马尔堡病毒糖蛋白GP1亚基的真核表达与纯化

目的:用真核表达系统可溶性表达重组马尔堡病毒糖蛋白GP1亚基并纯化。方法:从糖蛋白(GP)全长基因上扩增GP1基因序列,克隆至真核表达载体pcDNA3.4,在哺乳动物表达系统中进行表达,镍柱亲和层析纯化目的蛋白,ELISA检测重组蛋白与特异抗体的免疫反应性。结果:GP1在哺乳动物表达系统中获得可溶性表达,纯化得到的目的蛋白与特异抗体具有良好的结合活性,推测其构象与天然马尔堡病毒GP1具有相似性。结论:真核表达了马尔堡病毒糖蛋白GP1亚基,且目的蛋白具有良好的抗原性,可用于GP特异抗体筛选、疫苗效果评价等研究。     

埃博拉病毒包膜糖蛋白研究进展

埃博拉病毒可引起人类高致命性流行性出血热暴发,至今没有预防和治疗的疫苗和药物。作为埃博拉病毒包膜唯一的表面蛋白,包膜糖蛋白是一种多功能蛋白质,在病毒的吸附和穿入宿主细胞、致病性、下调宿主细胞表面蛋白质表达和增加病毒装配和出芽过程中起着至关重要的作用;同时包膜糖蛋白是保护性免疫的主要目标,是诱导产生中和抗体的最理想抗原。本文就近五年埃博拉病毒包膜糖蛋白的基因结构、致病机制和免疫原性方面的研究进展做简要回顾。     

埃博拉病毒GP和VP40蛋白在哺乳动物细胞中的共表达及病毒样颗粒装配

目的：制备基因重组埃博拉病毒样颗粒,为疫苗研究及埃博拉病毒特异抗原、抗体检测提供基础。方法：根据埃博拉病毒扎伊尔株的GP和VP40蛋白氨基酸序列,以哺乳动物细胞基因表达密码子偏好性进行基因优化设计;化学合成GP和VP40基因片段并分别构建于表达质粒pcDNA3.1或同时构建到具有双表达单元的质粒pBudCE4.1;重组质粒经lipofectamine2000转染293FT细胞;以Western blot检测重组蛋白GP和VP40的表达;通过电镜观察病毒样颗粒。结果：构建的重组质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建成功;Western blot结果显示,共转染分别表达GP和VP40的两个质粒或转染共表达两个蛋白的质粒都发现GP特异反应条带产生,且大小与预期相符,此外,转染共表达质粒产生的GP蛋白表达明显强于两个质粒共转染,并同时可检测到VP40的表达;电镜观察到典型的丝状的埃博拉病毒样颗粒。结论：在293FT细胞中基因优化的埃博拉病毒GP和VP40可有效表达并装配为病毒样颗粒,为进一步研究奠定了基础。     

扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白基因的克隆和表达

埃博拉病毒属丝状病毒科,能引发动物和人出血热症状,人感染后病死率高达90%以上,目前还没有有效预防和治疗的药物和疫苗。近年来,这种烈性传染病病毒传入我国的可能性不断加大,给我国公共卫生应急体系带来新的挑战。本研究针对埃博拉病毒的最主要结构蛋白——糖蛋白(GP),构建了重组原核表达载体pET28a(+)-GP1(33~313aa)、pET28a(+)-GP1(190~313aa)、pET28a(+)-GP2(502~632aa)、pET28a(+)-sGP,以及重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-edited GP、pcDNA3.1(+)-GP1、pcDNA3.1(+)-GP。结果表明,GP1(33~313aa)、GP1(190~313aa)和sGP能在大肠埃希菌BL21(DE3)中以包涵体的形式表达,GP、GP1和GP2能在HEK293T细胞中表达,但均不能在BHK21细胞中表达。本研究为进一步探索埃博拉病毒GP的结构和功能及GP抗体制备奠定了基础。     

鸡白细胞介素18成熟蛋白在昆虫细胞/杆状病毒系统中的表达

将编码鸡的白细胞介素 1 8(chickeninterleukine 1 8,ChIL 1 8)成熟蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB上 ,构建真核转移载体pMelBacBChIL 1 8,经限制性内切酶消化、ChIL 1 8特异引物PCR鉴定和确证性序列测定 ,证明目的基因正确克隆到载体的预期位点。将纯化的pMelBacBChIL 1 8质粒与杆状病毒DNA(Bac N BlueTM DNA)共转染sf9昆虫细胞 ,经四轮蓝斑筛选纯化 ,获得了重组杆状病毒 ,命名为rBaculovirusChIL 1 8。提取病毒染色体DNA ,经ChIL 1 8特异引物和重组杆状病毒特异引物PCR鉴定 ,证明获得了纯化的重组杆状病毒。用该重组病毒接种sf9昆虫细胞 ,收获接种后不同时间的细胞进行SDS PAGE电泳。结果表明ChIL 1 8基因在昆虫细胞中获得了表达 ,表达的重组蛋白分子量约为 2 3kDa。应用在大肠杆菌原核表达系统中表达的重组蛋白制备的兔抗ChIL 1 8多克隆抗体进行Westernblot分析 ,表明本研究真核系统表达的ChIL 1 8成熟蛋白和前期原核系统表达的ChIL 1 8成熟蛋白均具有生物学活性。     

棉铃虫病毒gp41基因的克隆表达及抗体制备

根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(Helicoverpa armigerasingle nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV)gp41基因的序列,设计引物,引入适当的酶切位点,通过PCR的方法扩增目的片段。将扩增出的基因片段克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组质粒并转化至大肠杆菌中,经IPTG诱导表达。纯化蛋白产物并免疫家兔产生抗血清。该抗血清可与原核表达的His-GP41融合蛋白及在感染的昆虫细胞中表达的GP41蛋白发生特异性免疫反应。该抗体的获得为深入研究GP41的功能提供了基础。     

截短型马尔堡病毒包膜糖蛋白的原核表达纯化及鉴定

目的:制备重组可溶性截短型马尔堡病毒包膜糖蛋白(MAGP),并验证其抗原性。方法:PCR扩增MAGP截短片段MAGP_(40-289)、MAGP_(148-526)、MAGP_(240-526)和MAGP_(258-526),克隆至原核表达载体pET-32a并转化至大肠杆菌进行诱导表达,经亲和层析、阴离子交换层析获得纯度良好的可溶性截短蛋白抗原,利用ELISA试验对该蛋白的抗原性进行验证。结果:截短抗原MAGP_(240-526)在大肠杆菌中可溶性表达良好,表达量约17 mg/L;Western印迹显示该抗原能与Ad5-MAGPopt免疫后的小鼠血清发生特异反应。结论:经原核系统表达的截短型MAGP具有良好的抗原性,可用于检测相关疫苗激发的抗MAGP抗体水平或评价抗MAGP的结合活性。     

埃博拉病毒包膜糖蛋白小鼠CTL表位的预测及鉴定

<正>背景:埃博拉病毒(EBOVs)能够引发严重的出血热,具有极高的致死率。目前世界上尚无批准上市的疫苗以及对该病毒感染的有效治疗手段。有研究表明,体液免疫和细胞免疫反应是控制埃博拉病毒感染的关键,而且CD8+T细胞在介导疫苗引发的免疫保护方面发挥着重要作用。本研究旨在对埃博拉病毒包膜糖蛋白(GP)H-2d单元型的T细胞表位进行鉴定。结果:利用计算机辅助算法对埃博拉病毒两种亚型(苏丹型和扎伊尔型)包膜糖蛋白H-2d单元型的T细胞表位进行预测。对预测的肽进行合成,在免疫     

蜱传脑炎病毒E抗原蛋白的原核表达及鉴定

目的:构建蜱传脑炎病毒(TBEV)结构蛋白E的原核表达载体,表达重组蛋白。方法:PCR扩增E蛋白全长基因片段,插入原核表达载体pET-32a并转化大肠杆菌进行诱导表达,镍柱纯化、复性。结果:E蛋白在大肠杆菌中获得表达,表达量达60 mg/L;重组E蛋白能与人抗TBEV多克隆抗体产生特异反应;用重组E抗原免疫家兔后,能检测到较高的抗体水平。结论:原核表达的E抗原蛋白具有抗体结合活性,可用于制备ELISA诊断试剂。     

EBOV-Z和MARV的NP基因在杆状病毒表达系统的表达及反应原性鉴定

利用昆虫杆状病毒表达系统,成功地对埃博拉(EBOV)扎伊尔型病毒和马尔堡病毒(MARV)的NP基因进行表达。Western blot结果显示,重组EBOV蛋白和重组MARV-NP与各自阳性血清有特异的反应原性,在血清学上无交叉反应。IFA检测感染重组昆虫杆状病毒的Sf9细胞表明,EBOV和MARV NP获得大量表达,呈现强烈的荧光,对照组细胞无特异荧光。该研究为EBOV和MARV流行病学调查和研制诊断试剂盒奠定了基础。     

扎伊尔型埃博拉重组糖蛋白GP-Fc基因疫苗构建及免疫原性研究

本实验将基于埃博拉病毒表面糖蛋白抗原GP基因序列,按照哺乳动物密码子使用频率优化,并与人IgG恒定区构建融合蛋白GP-Fc基因序列,重组蛋白序列插入基因疫苗载体pVR中,构建重组蛋白基因疫苗pVRmodGP-Fc。通过基因疫苗导入系统免疫小鼠,用间接ELISA和间接免疫荧光对抗体效价进行评估。实验结果显示,重组蛋白GP-Fc的基因疫苗可以很好的刺激小鼠产生特异性抗体,免疫周期结束后,小鼠血清中结合效价终点达到高剂量组1∶300 000及低剂量组1∶180 000,同时血清中的抗体可以很好地结合表达GP抗原的细胞表面,表现出很强的荧光信号。通过该研究我们验证重组蛋白基因疫苗pVR-modGP-Fc可以很好地诱导BALB/c小鼠产生较高滴度的抗原特异性IgG,具有较好的免疫原性。     

神经纤毛蛋白-1的原核表达及兔抗小鼠神经纤毛蛋白-1抗体免疫学活性的研究

目的:在原核系统中分段表达神经纤毛蛋白-1(Nrp1);将纯化的蛋白免疫家兔后获得特异的抗体,并将其应用于检测组织和细胞中Nrp1分子的表达。方法:提取BALB/c胎鼠脑组织总RNA,通过RT-PCR分段扩增获得Nrp1基因片段,将PCR产物插入表达载体pET28a( ),获得含5个Nrp1基因片段的重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导蛋白表达并纯化;将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔获得针对目的蛋白的特异性多克隆抗体;利用Nrp1特异性多抗检测胎鼠脑组织和HeLa细胞中Nrp1的表达。结果:在原核系统中分段表达了Nrp1蛋白,通过Ni-NTA纯化了Nrp1蛋白片段;纯化的Nrp1蛋白免疫新西兰大白兔获得了具有免疫活性的多抗;兔抗小鼠Nrp1特异性多抗可用于检测组织、真核细胞中Nrp1的表达。结论:应用原核系统成功地表达了Nrp1蛋白,兔抗小鼠Nrp1特异性多抗可用于免疫学检测Nrp1分子的表达。     

以副流感病毒为载体的三价埃博拉病毒疫苗诱导的抗体介导的保护机制

<正>埃博拉病毒扎伊尔(Ebolaviruses Zaire,EBOV)、本迪布焦(Bundibugyo,BDBV)和苏丹(Sudan,EBOV)毒株造成人类疾病,病死率高。使用单一包膜糖蛋白(Glycoprotein ,GP)的实验性单价疫苗都不能提供抵御异源埃博拉病毒的保护。以副流感病毒为载体的三价埃博拉病毒疫苗具有无针给药和诱导呼吸道黏膜应答等优点。采取多种途径来诱导针对三种埃博拉病毒的广泛保护。虽然以糖蛋白(GP)共有序列为基础的抗原     

重组杆状病毒表达尼帕病毒融合蛋白和受体结合蛋白的研究

构建了表达尼帕病毒(Nipah virus,NiV)囊膜功能糖蛋白F和G的重组杆状病毒rBac-NF、rBac-NG。Western-blot证实大小分别为61kD和66kD的重组融合蛋白(rNF)和受体结合蛋白(rNG)分别在rBac-NF、rBac-NG感染的昆虫细胞中获得表达,并且rNF前体F0可在昆虫细胞内进一步有效裂解为F1(~49kD)和F2;采用兔抗NiV病毒高免血清间接免疫荧光检测重组杆状病毒表达F和G蛋白显示出良好的特异免疫反应原性。以rBac-NF、rBac-NG感染的昆虫细胞裂解液稀释后直接包被ELISA板,间接ELISA检测兔抗灭活NiV全病毒高免血清中的F和G蛋白特异性抗体,同样具有良好的敏感性和特异性;以rBac-NF和rBac-NG感染昆虫细胞培养物直接免疫BALB/c小鼠,可诱导显著的NiVF和G蛋白特异体液免疫反应,产生的特异抗体可有效中和NiV囊膜蛋白F和G介导的伪型VSV重组病毒侵入NiV易感宿主细胞的感染性。结果表明,杆状病毒表达重组F和G蛋白抗原具有替代NiV全病毒,作为安全、经济、敏感和特异的诊断抗原的潜力,并为重组病毒亚单位疫苗防制尼帕病毒性脑炎的探索研究奠定了基础。     

HBV pre-c-Fc融合蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其生物学活性研究

目的:在杆状病毒表达系统中表达融合蛋白乙型肝炎病毒前C蛋白-小鼠IgG Fc蛋白(HBV precore protein-mouse IgG Fc,HBV pre-c-Fc),并鉴定其免疫原性。方法:目的基因HBV prec-Fc连接到pFastBac1载体,获得的pFastBac1-HBV pre-c-Fc质粒转化DH10Bac感受态,通过Tn7转座子将目的基因转座到Bacmid中,得到Bacmid-HBV pre-c-Fc穿梭载体,脂质体包被后转染Sf9昆虫细胞获得P1代病毒,重复转染Sf9获得高滴度病毒。收集细胞上清超滤后通过Protein G亲和层析柱纯化得到目的蛋白HBV pre-c-Fc。纯化的蛋白大腿内侧肌肉注射免疫BALB/c小鼠并检测血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗体产生量。结果:HBV pre-c-Fc在昆虫细胞中成功表达,纯化后蛋白纯度达90%以上,蛋白产量约为3.03mg/L,纯化蛋白能有效刺激BALB/c小鼠产生特异抗体。结论:成功地在杆状病毒表达系统中表达了具有免疫原性的HBV pre-c-Fc蛋白,为生产乙肝治疗性疫苗奠定了基础。     

基于狂犬病病毒G蛋白scFv介导的靶向shRNA制备与鉴定

【目的】探讨以狂犬病病毒G糖蛋白单链抗体介导的载体表达shRNA靶向制剂,靶向抑制狂犬病毒复制的可行性。【方法】应用PCR技术获得狂犬病毒G糖蛋白单链抗体scFv(G)和绿脓杆菌跨膜区-酵母DNA结合结构域ETA-GAL4基因,通过搭桥PCR法获得scFv(G)-ETA-GAL4(SEG)嵌合基因;克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达质粒pET28a(+)-scFv(G)-ETA-GAL4(pET28a-SEG);在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,利用镍柱亲和层析法纯化包涵体,经复性、鉴定制得SEG蛋白;ELISA法检测表达蛋白与狂犬病毒特异结合活性;将SEG蛋白与含shRNA的质粒(pRNATU6.3-shRNA)连接制成靶向shRNA,接入100 TCID50狂犬病毒感染BHK-21细胞,35 h观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况;48 h用直接免疫荧光抗体试验测定复合物抑制病毒效果。【结果】克隆得到1557 bp的SEG蛋白编码基因,大肠杆菌中成功表达57 KDa的SEG蛋白,能与抗His的单克隆抗体发生特异性反应,SEG蛋白经镍柱纯化、复性后得率为2.8 mg/mL。ELISA试验证明SEG蛋白在一定浓度范围内与RV结合呈正相关。细胞试验表明GFP在细胞内得到表达;直接免疫荧光试验测定该复合物能抑制76%病毒复制。【结论】SEG蛋白能与携带shRNA的质粒结合,可运送该质粒至RV感染BHK-21细胞中,抑制狂犬病毒的复制。     

人FGFR1的BacMam系统构建、表达、纯化与鉴定

目前激酶类蛋白的表达大多由昆虫细胞表达系统实现,采用BacMam系统来表达受体型酪氨酸激酶人FGFR1,旨在获得更接近天然结构与功能的重组蛋白.首先,将pDEST20载体的多角体蛋白启动子替换成CMV enhancer启动子,获得BacMam表达载体pDEST20-CMVe.通过Gateway系统,将FGFR1具有酪氨酸激酶活性的区域克隆至改造后的载体中.利用昆虫细胞Sf9产生病毒,P2代病毒转导哺乳动物细胞FreeStyle 293-F进行表达,经亲和纯化后,成功获得了75 kD的融合蛋白.通过磷酸化底物的反应检测此FGFR1激酶的活性.结果表明,BacMam系统是一个良好的表达重组激酶FGFR1的平台,并且所表达的激酶活性高于昆虫细胞表达的激酶蛋白.     

汉坦病毒H8205株G1P基因片段重组杆状病毒表达载体的构建及表达

将汉坦病毒H8205株G1P基因的保守序列(约1000bp)作为目的基因插入到BactoBac杆状病毒表达系统的pFastBacHTb供体质粒中,利用Tn7转座子同BacmidDNA同源重组,获得了含目的基因片段的重组杆状病毒DNA,并利用其转染Sf9昆虫细胞,72h后收集细胞悬液,再用该悬液侵染Sf9昆虫细胞,48h后收获病毒.采用IFA分析收获的产物,观察到了特异性的荧光,并且采用SDSPAGE和Western印迹也获得了与预期一致的结果.证明感染后的Sf9昆虫细胞所表达的蛋白中含有能与抗汉坦病毒H8205株多克隆抗体特异性结合目的蛋白.研究表明,采用杆状病毒表达系统可以成功表达出汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G1基因片段,为开发适合的以G1P为抗原的汉坦病毒诊断试剂进行了前期的探索.     

带有小鼠CD40L基因的汉滩病毒糖蛋白表达载体的构建

目的:构建汉滩病毒包膜糖蛋白基因的真核表达载体,并加入可增强免疫应答效应的细胞因子CD40L基因,检测其可否在真核细胞中表达。方法与结果:参照GenBank中汉滩病毒M基因和小鼠CD40L的全基因序列设计引物,通过聚合酶链反应(PCR)获得M和CD40L基因片段,将其与pCI-neo载体相连,测序证实该载体构建成功后,将此真核表达载体以脂质体转染法转染至哺乳动物细胞CHO-K1中,利用间接免疫荧光法(IFA)检测发现M基因和CD40L基因可以同时表达于CHO-K1细胞中。结论:构建了带有CD40L基因的汉滩病毒包膜糖蛋白重组质粒并获得表达,为深入研究汉滩病毒感染后包膜糖蛋白引起的特异性免疫应答规律奠定了实验基础。     

人类新细胞因子CKLFSF2羧基端蛋白在大肠杆菌中的表达纯化、抗体制备与鉴定

哺乳动物细胞表达的人类新细胞因子——趋化素样因子超家族成员-2(CKLFSF2)存在分泌形式,位于CKLFSF2分子的羧基端,具有细胞趋化作用.为进一步研究CKLFSF2羧基端蛋白的结构和生物学功能及抗体制备,构建了GST-CKLFSF2C51原核表达质粒,经原核表达、亲和层析、凝胶过滤,获得GST-CKLFSF2C51融合蛋白和CKLFSF2羧基端蛋白(CKLFSF2C51),纯度可达到95%以上.GST-CKLFSF2C51融合蛋白用于制备多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价阳性,蛋白质印迹检测CKLFSF2哺乳动物细胞超表达细胞裂解液,获得特异性条带与预期大小一致.CKLFSF2C51经N端测序,质谱鉴定与预期结果一致,该蛋白质具有对PC-3细胞趋化的活性,并且该活性可被制备的多克隆抗体中和.上述结果表明,原核CKLFSF2羧基端蛋白具有与CKLFSF2真核表达蛋白类似的细胞趋化活性,原核CKLFSF2羧基端蛋白制备的多克隆抗体可用于免疫组织化学、蛋白质印迹检测,并能中和CKLFSF2蛋白的趋化活性作用.