乙型肝炎病毒表面抗原基因在酵母SUC2启动子-信号顺序控制下的表达

酵母SUC2基因克隆YFD6的DNA用核酸酶BAL31从SUC2基因的BamHI切点进行酶解,加上BamHI接头后,自连环化,得到的一个缺失质粒YFD6A21保留sucz基因动子-信号顺序以及氨基端22个氨基酸残基的编码顺序。将带有HBsAg基因的BamHI片段插入YFD6 A21的BamHI切点,使HBsAg基因suc2基因融合,然后将重担质粒引入酵母将酵母转化子在葡萄糖阻遏及去阻遏条件下生长,然后测定细胞内、周质空间和培养基中的HBsAg量。我们只能在葡萄糖去阻遏条件下检测到HBsAg的表达,几乎全部表达的HBsAg位于细胞内。     

表达乙肝病毒融合表面抗原基因SA-28的二倍体酵母工程菌的选育

将乙肝病毒融合表面抗原基因SA-28的单倍体酵母工程菌Y19/YFD158和与其不同接合型的单倍体酵母菌Y95接合,筛选到二倍体酵母工程菌Y95xY19/YFD158。对两种工程菌的研究表明：二倍体工程菌发酵密度为单倍体工程菌的3倍;表达质粒在二倍体酵母中的稳定性明显高于单倍体工程菌;二倍体工程菌对融合抗原的表达量为单倍体的3倍以上;表达质粒在二倍体细胞中的平均拷贝数略低于单倍体工程菌。     

恶性疟裂殖子表面蛋白1合成基因在毕赤酵母中的表达

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1是当今疟疾疫苗主要的候选抗原。由于天然MSP1基因AT含量异常高(为74%),使得克隆全长天然基因无法实现。本文已全合成了msp1基因(4940bp),解决了该天然基因在异源系统中不稳定的问题。为制备大量msp1重组蛋白进行疫苗有效性试验,本研究建立了msp1基因在毕赤酵母中的表达,将合成的msp1基因克隆到毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5,构建了重组质粒pPIC3.5/msp1,用电击转化毕赤酵母得到重组转化子,经PCR证实msp1基因已整合于毕赤酵母染色体中。含有重组表达质粒的毕赤酵母菌经甲醇诱导后表达出全长msp1重组蛋白。表达产物能与识别MSP1分子二硫键依赖构象表位的特异性单抗发生很强的反应,表明msp1重组蛋白至少在该表位构象上与天然蛋白一致。从毕赤酵母中分离得到大量msp1为开展该蛋白的结构与功能,特别是测定其疟疾保护性免疫提供可能。     

透明颤菌血红蛋白的表达对酵母中麦角固醇合成的影响

构建了含透明颤菌（Vistreoscilla）血红蛋白基因vgb和酵母遗传霉素（G418）抗性基因的重组质粒pVgbkanMX4,转化至酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1190中,经过分析,基因vgb在酵母细胞中得到表达。对重组菌和野生菌进行了摇瓶培养及5 L发酵罐培养的研究。在摇瓶实验中,重组菌的麦角固醇产量比野生菌有显著提高,在野生菌中的含量为0.573%、而在重组菌中的产量为1.07%。 经过30 h发酵罐培养的实验,野生菌中麦角固醇含量为0.9%,重组菌中其含量为1.38%,验证了摇瓶实验的结果。结果证明vgb基因有利于酵母中麦角固醇的合成。     

假单胞杆菌2-萘酸加氧酶基因的克隆与表达

采用Cosmid pLARF1构建了完整的2-萘酸代谢菌2-NAT菌株的基因文库.通过分析基因文库中产生蓝色色素的克隆验证了2-萘酸代谢基因在大肠杆菌体内得到表达,并导致重组细菌产生靛蓝.从产生靛蓝的克隆抽提重组的Cosmid DNA进行酶解分析,发现所有能产生靛蓝的克隆均含有一大小相同的DNA片段.用重组细菌进行靛蓝生物合成的试验展示了微生物法生产靛蓝的美好前景.     

麦迪霉素生物合成基因克隆研究

利用穿梭粘粒载体pNJ1组建了麦迪霉素产生菌Streptomyces mycarolaciens 1748的基因文库,用与麦迪霉素生物台成有类似途径的放线紫红素聚酮合成酶基因Act I,Act Ⅱ为探针,从麦迪霉素产生菌的基因文库中,获得了与ActI,Act Ⅱ基因有同源性的阳性克隆,对其中PCNSBl2、6C5及11E11克隆DNA进行了酶切分析,其分子量分别为36kb,48．5kb及41．6kb。PCN6C5 DNA中包含有PCN 8B32的全部DNA片段,PCN ⅡEⅡ与PCN 8B12及PCN 6C5有6．75kb的重叠区。通过分子杂交实验,初步将麦迪霉素聚酮台成酶基因定位在PCN 8812 DNA的EcoR I—BamH I 4．02kb片段上(与Act Ⅱ基因有同源性)及PCN 8B12(6C5),PCNIIEIIDNA BgⅡ—BgⅡ 2．42kb与PCNllE11 Bgl I—B g1 I 1Okb片段上(与Act I基因有同源性)。PCN 8B12及PCN 6C5克隆DNA在麦迪霉素聚酮合成酶基因缺陷型变株Streptomyces mycarofaciens var．68及不产抗生索的变铅青链霉菌Streptomyces lividans TK24受体菌的表达产物,经TLC及HPLC等分析表明与麦迪霉素标准品相似。     

里氏木霉内切葡萄糖苷酶Ⅳ在毕赤酵母中的表达*

进行了内切葡萄糖苷酶Ⅳ(EGⅣ)在毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中的表达。采用RT-PCR的方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)中分离到eg4基因。将eg4基因与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,得到重组质粒pPICZαA-eg4。将该重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115,eg4基因通过同源重组被整合到毕赤酵母的染色体上,并处于酵母α因子的下游,得到重组菌株P.pastoris-EGⅣ1。在甲醇     

紫云英根瘤菌共同结瘤基因nodA和nodBC的核苷酸序列

以~(32)p标记的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)2.3kb nod DNA作探针,从紫云英根瘤菌(Rhizobium huakuii即R. astragali)159基因文库中分离到一株能与探针DNA呈阳性反应的克隆pRaN109。同源DNA-DNA杂交及DNA序列分析表明:pRaN109DNA的9kb EcoRI片段上携带了nodD_1BC基因,pRaN109 NDA的18kb EcoRI片段上携带了nodD_2A基因。共同结瘤基因nodA与nodBC两者相距6.7kb。在nodA基因和nodBC基因的上游都存在有结瘤盒(nod box)。与来自不同种属的菌株所报告的结果相比较,紫云英根瘤菌159中的共同结瘤基因有着明显不同的组合。     

代谢木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母的构建*

为使酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58代谢木糖产乙醇,采用PCR方法克隆得到树干毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖醇脱氢酶基因xyl2,并将该基因和克隆得到的休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)缺终止子的木糖还原酶基因xyt1一起连接到酵母表达载体pYES2的强启动子GAL下,得到融合表达载体pYES2-P12。通过醋酸锂转化的方法将pY- ES2-P12转入S．Cerevisiae YS5     

吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997中噬菌体基因转移系统的建立及其应用

由吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997产生的格尔德霉素geldanamycin(GA)属安莎类抗生素, 具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性。本文应用链霉菌温和噬菌体C31衍生的KC515载体,在吸水链霉菌S.hygroscopicus 17997中建立并优化了S. hygroscopicus　17997的基因转染体系。利用所建立的基因转染体系,以基因阻断技术从S. hygroscopicus 17997基因文库含有多组PKS基因柯斯质粒中,鉴定了与GA PKS生物合成相关基因的柯斯质粒,该工作为GA生物合成基因簇的克隆奠定了基础。     

链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1-木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌及毕赤酵母中的高效表达

从橄榄绿链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1中克隆出木聚糖酶基因xynA,将带与不带原基因信号肽编码序列的xynA分别以正确的阅读框架克隆到大肠杆菌表达载体pET22b(+)上的pellB信号肽编码序列之后,得到2种构建的重组载体,在重组大肠杆菌中木聚糖酶得到了表达,表达产物具有生物活性。进一步将不带原基因信号肽编码序列的xynA插入到毕赤酵母转移载体pPIC9中,转化毕赤酵母得到重组子,在重组子中木聚糖酶基因得到了高效分泌表达,在摇床培养水平上的表达量达到200mg/L,且表达产物具有生物学活性。     

来源于Escherichia coli的高比活植酸酶基因的高效表达

高效表达高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的一个有效途径。对源于Escherichia coli的高比活植酸酶基因appA,按照毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子的偏爱进行了密码子优化改造。该改造后的基因appA-m按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9上的α-因子信号肽编码序列3′端,通过电击转化得到重组转化子。对重组毕赤酵母的Southern blotting分析证实植酸酶基因已整合到酵母基因组中,并确定了整合基因的拷贝数。Northern blotting分析证实植酸酶基因得到了正常转录。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,植酸酶得到了高效分泌表达,在5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到2.5mg/mL发酵液, 酶活性(发酵效价)达到7.5×10⁶IU/mL发酵液以上, 大大高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。     

新的热带假丝酵母载体-宿主系统的建立

热带假丝酵母(Candida tropicalis)是一种可以利用多种非糖碳源代谢的微生物,在石油发酵、石油化工生产领域已得到长期应用^[1]。随着分子生物学研究技术的发展。通过代谢工程技术改变热带假丝酵母的代谢途径和流向．发展出能够把石油中的烃类物质发酵转化成各种重要化工原料、中间体的新型生产菌株,已普遍受到国内外研究机构的重视。另一方面,热带假丝酵母具有细胞生长密度高,分泌蛋白能力强等特点,可以发展成一个重要的异源蛋白表达体系。建立稳定高效的热带假丝酵母载体一宿主系统是实现上述构想的前提和关键。迄今为止,在热带假丝酵母细胞内尚未发现能游离于染色体外自主复制的天然质粒存在。目前已有20余种热带假丝酵母基因被克隆和鉴定。大部分与热带假丝酵母的氧化代谢过程有关,其中5个过氧物酶体蛋白基因的结构和2个细胞色素P450系统基因的表达调控规律巳被阐明^[2-5],与DNA复制过程有关的基因或功能序列均未见报道。本文研究和探索Candida属其他微生物基因元件在热带假酵母中的功能作用,选用热带假丝酵母细胞色素P450单加氧酶基因的启动子和侧翼调控序列^[3],构建了一套新的热带假丝酵母载体一宿主系统,并成功地表达了小鼠CYPlAl基因。     

化学合成的人a-心房肽基因在SUe2启动子—信号顺序控制下的表达

本文报道将化学合成的人a-心房肽(a-hANP)基因与酵母分秘型表达载体YFD6△21重组,使a-hANP基因在蔗糖酶基因(suc2)启动子—信号顺序指导下,在酵母菌中台成和分泌有活性的a—hANP。放射免疫分析表明：a-hANP基因只有在葡萄糖去阻遏条件下才能得到表达,而且其表达量与细胞浓度成正比。此外,95％以上表达产物被分泌到培养液中。     

LCB1基因表达对酵母神经酰胺合成的影响

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LCB1（Long chain base）基因被克隆到酵母诱导表达载体pYES2中,并转入到FY2中,用半乳糖诱导表达。与对照相比,质粒所含LCB1基因的表达,使酵母细胞干重略有下降,而神经酰胺的含量提高为对照的1.9倍。     

高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

γ-亚麻酸（GLA）作为人体必需的不饱和脂肪酸,具有重要的营养和药用价值。Δ⁶-脂肪酸脱氢酶是γ-亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ-亚麻酸的表达体系,将高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体pPIC3.5K连接,SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母SMD1168,获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达,通过脂肪酸气相色谱和气相色谱质谱（GC-MS）联用分析表明高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达,γ-亚麻酸含量占总脂肪酸的16.26%。     

水稻磷酸盐转运蛋白基因的克隆、表达及功能分析

以水稻叶片为材料, 设计一对特异引物, 获得了编码磷酸盐转运蛋白基因OsPT6:1. 聚类和氨基酸保守位点分析指出该基因可能为水稻高亲和力磷酸盐转运蛋白编码基因. 原位杂交与RT-PCR表达结果确定此基因在根与叶片中均表达, 尤以低磷诱导下叶片的叶肉细胞表达量最高. 同源重组表明该基因的表达可以提高毕氏酵母对磷素的吸收效率, 同时其基因的导入可以使高亲和力磷酸盐转运蛋白缺失的酵母突变体的磷素吸收功能得以恢复. 以上结果表明, OsPT6:1为水稻高亲和力磷酸盐转运蛋白的编码基因.     

人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母系统中的高效表达

本文以黑曲霉(Aspergillus niger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列,换用在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因(PhyA-as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合入酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDSPAGE结果与表达产物酶学性质研究表明植酸酶得到分泌表达,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌,其中SPANⅢ菌株达到了在摇床培养条件下,每毫升发酵液产生165000u植酸酶的水平,基本满足工业化生产的要求。     

汉森酵母表达载体的构建和人血管生成抑制素基因的表达

汉森酵母(H.polymorpha)是一类能以甲醇为唯一碳源和能源的甲基营养酵母,具有高表达外源基因、易于高密度发酵和产业化的特点。应用PCR技术扩增汉森酵母甲醇氧化酶(Methanol oxidase MOX)基因启动子和转录终止序列,并与汉森酵母Leu基因(Hpleu2)和人血管生成抑制素基因一起重组进大肠杆菌质粒pSP72,构建了整合型表达载体pSMA17,采用LiAc法将pSMA17转入汉森酵母A16(leu),筛选出阳性转化子H.polymorpha A16(pSMA17)。转化子在YPGE培养基中培养至对数生长后期,用甲醇进行诱导表达。ELISA和SDSPAGE分析结果证明人血管生成抑制素已获表达,表达产物分泌至培养基中。Western blot结果显示重组的人血管生成抑制素能与抗人纤溶酶原抗血清特异结合,具有免疫原性。     

产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因的克隆

当酵母细胞处于高渗压环境时,甘油被诱导合成以提高其胞内渗透压,这一过程受ＨＯＧ途径的调控。ＧＰＤ１基因为ＨＯＧ途径的重要靶基因,高效表达使胞内３磷酸甘油脱氢酶酶活水平提高可极大地提高甘油的产量。本研究将产甘油假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｇｌｙｃｅｒｏｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）染色体ＤＮＡ经Ｓａｕ３ＡＩ部分酶解后的５～１０ｋｂＤＮＡ片段与经ＢａｍＨＩ线性化及ＣＩＰ处理过的酵母大肠杆菌穿梭质粒ＹＥｐ５１连接,以大肠杆菌ＤＨ５α为受体,构建产甘油假丝酵母的染色体基因文库。通过遗传互补法,在含５０ｇ／Ｌ氯化钠的培养基上筛选出１５个转化子,对转化子０６０１进行了进一步鉴定,转化子０６０１所含质粒ＹＥｐ０６０１带有ＹＥｐ５１的标记并可以消除Ｓａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ６４２菌株由于其ＧＰＤ１,ＧＰＤ２两基因的缺失突变而表现出的渗透压敏感性,表明已克隆到产甘油假丝酵母的编码胞浆３磷酸甘油脱氢酶的基因