胰岛素基因及其顺式作用元件和反式作用因子

胰岛素基因及其顺式作用元件和反式作用因子杨绍华,陈俊杰（华西医科大学生化与重组ＤＮＡ室,成都６１００４１）关键词胰岛素基因,顺式作用元件,反式作用因子胰岛素基因迄今虽已从多种脊椎动物分离克隆、但对它的研究主要是以鼠和人的基因为对象进行的。除三种鼠（大...     

LCRG1基因启动子关键顺式调节元件的鉴定

LCRG1基因(laryngeal carcinoma related genel,LCRG1)是一个新的喉癌候选抑瘤基因,其转录调控机制一直未被阐明.通过限制性内切酶酶切介导对LCRG1基因(-169～+127)区域进行剪切体分析,将LCRG1基因最小启动子定位于-169～-57.应用连接体扫描突变体分析,将关键顺式作用元件确定在-137～-122.生物信息学提示该区存在SP1、E2F1/DP1、EKLF和ZF9转录因子结合位点.利用已知反式作用因子与报告基因质粒进行共转染,提示Sp1为有效的反式作用因子,且能上调LCRG1基因的表达.凝胶迁移阻滞实验确定LCRG1基因关键的顺式作用元件区域具有Sp1结合位点.LCRG1基因启动子-137～-122片段在该基因表达过程中可能起重要作用,为LCRG1基因功能研究提供了新的证据.     

Nodal基因的第一内含子中存在着顺式调控增强子元件

小鼠ｎｏｄａｌ基因是在胚胎发育时期表达的一个基因,它在原肠期起着重要作用,并且参与左－右体轴的决定,４１３－ｄ小鼠胚胎干细胞系３５６３在ｎｏｄａｌ基因的第一内含子中含有单拷贝逆转录病毒的插入。采用定量ＲＮａｓｅ保护法比较了该细胞系及其母源ＥＳ细胞ＣＣＥ中ｎｏｄａｌ基因的表达量,ＣＣＥ细胞中ｎｏｄａｌ ｍＲＮＡ的含量是３５６３ＥＳ细胞含量的２．３倍。这一结果提示原病毒在ｎｏｄａｌ基因第一内含子中的整     

抗逆基因AtRPK1启动子关键顺式作用元件的研究

为确定拟南芥抗逆相关基因AtRPK1启动子的顺式功能元件,对其启动子区进行了分段克隆。通过5'端缺失方法得到203、316、604、809 bp 4个启动子片段,分别构建成p1300-pro-GUS表达载体,并转入拟南芥,进行GUS染色和GUS定量检测。通过对809 bp全长启动子转基因拟南芥GUS染色发现,转基因拟南芥的叶片、茎、花、根中均有表达,在分生能力强的组织和维管束集中的组织,AtRPK1基因启动子具有较高启动表达能力。5'端缺失启动子检测结果表明,转录起始点到启动子上游-114位点区域包含AtRPK1基因启动子的关键顺式作用元件。对启动子缺失片段转基因植株利用200 mmol·L-1NaCl胁迫3 h后,β-葡萄糖苷酸酶活力定量检测结果表明,在启动子上游-19位点处的GT-1顺式作用元件GAAAAA可能直接与盐胁迫应答相关。     

人类新细胞因子CKLFSF2羧基端蛋白在大肠杆菌中的表达纯化、抗体制备与鉴定

哺乳动物细胞表达的人类新细胞因子——趋化素样因子超家族成员-2(CKLFSF2)存在分泌形式,位于CKLFSF2分子的羧基端,具有细胞趋化作用.为进一步研究CKLFSF2羧基端蛋白的结构和生物学功能及抗体制备,构建了GST-CKLFSF2C51原核表达质粒,经原核表达、亲和层析、凝胶过滤,获得GST-CKLFSF2C51融合蛋白和CKLFSF2羧基端蛋白(CKLFSF2C51),纯度可达到95%以上.GST-CKLFSF2C51融合蛋白用于制备多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价阳性,蛋白质印迹检测CKLFSF2哺乳动物细胞超表达细胞裂解液,获得特异性条带与预期大小一致.CKLFSF2C51经N端测序,质谱鉴定与预期结果一致,该蛋白质具有对PC-3细胞趋化的活性,并且该活性可被制备的多克隆抗体中和.上述结果表明,原核CKLFSF2羧基端蛋白具有与CKLFSF2真核表达蛋白类似的细胞趋化活性,原核CKLFSF2羧基端蛋白制备的多克隆抗体可用于免疫组织化学、蛋白质印迹检测,并能中和CKLFSF2蛋白的趋化活性作用.     

LCRG1基因启动子关键顺式调节元件的鉴定

LCRG1基因( laryngeal carcinoma related gene1,LCRG1 )是一个新的喉癌候选抑瘤基因,其转录调控机制一直未被阐明．通过限制性内切酶酶切介导对LCRG1基因 (-169～+127)区域进行剪切体分析,将LCRG1基因最小启动子定位于-169～-57．应用连接体扫描突变体分析,将关键顺式作用元件确定在-137～-122．生物信息学提示该区存在SP1、E2F1/DP1、EKLF和ZF9转录因子结合位点．利用已知反式作用因子与报告基因质粒进行共转染,提示Spl为有效的反式作用因子,且能上调LCRG1基因的表达．凝胶迁移阻滞实验确定LCRG1基因关键的顺式作用元件区域具有Spl结合位点．LCRG1基因启动子-137～-122片段在该基因表达过程中可能起重要作用,为LCRG1基因功能研究提供了新的证据．     

基因及其顺式调控元件在动物表型进化中的作用

顺式调控假说是当前进化发育生物学中重要的理论之一, 该假说认为顺式调控元件的进化是调控外表性状进化的主要遗传机制。然而越来越多的实验结果表明, 仅靠顺式调控假说远不足以解释复杂的进化发育过程, 其他因素也会导致表型的进化, 如：与顺式调控元件相联基因的蛋白序列改变; 基因及染色体组复制; 蛋白结构域与顺式调控元件的灵活性等。文章回顾了近年来顺式调控元件以及与顺式调控元件相联基因的进化发育研究, 探讨了进化发育生物学研究的新方法与新思路。     

NGAL基因不同长度片段的克隆及其顺式作用元件定位分析

NGAL(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin)是lipocalin家族的一个新成员,可能是人类的一种新癌基因,但其在肿瘤中的表达调控机制尚不清楚。应用生物信息学手段对NGAL(X99133,包括外显子和内含子)进行分析发现,此区域内含有许多潜在的顺式作用元件,其中主要为增强子元件。对此设计了以下实验:应用PCR技术从食管癌细胞SHEEC基因组DNA中扩增不同长度的NGAL基因片段,将其连接到PGEMT-eacy载体中进行扩增,并测序。NCBI/BLAST分析确认扩增片段为NGAL基因所有,与实验所设计相吻合。在此基础上并应用KEGG/MOTIF检索分析系统对NGAL基因的上述区段进行了顺式作用元件定位分析,结果共鉴定出5个Score值=100分的顺式作用元件位点。这为NGAL基因增强子的鉴定提供了新线索。     

脊椎动物肌动蛋白基因顺式转录元件的分布模式

脊椎动物肌动蛋白各亚型的表达具有严格的与物种无关的组织特异性; 本文改进和完善了一种顺式元件匹配预测方法, 在实验资料的基础上, 统计出５ 种顺式元件的核苷酸分布权重矩阵模式, 对脊椎动物β细胞质亚型和α平滑肌亚型肌动蛋白基因的５＇ 调控区进行顺式元件的匹配预测和序列分析,获得了相应亚型的特异性的顺式元件编码分布模式,并分析了其进化趋势。     

脂肪细胞分化过程中影响PAI-1基因转录表达的Dex和C/EBPs顺式调控元件的分析(英)

在研究胰岛素(Ins)、地塞米松(Dex)和甲基异丁基黄嘌呤(Mix)对脂肪细胞分化过程中PAI-1基因表达的影响基础上,为进一步探讨Ins、Dex调控PAI-1基因转录表达的调控机制,应用DNA重组技术,构建含萤光素酶（luciferase）报告基因和PAI-1启动子不同长度片段的嵌合质粒,转染3T3-L1前脂肪细胞并测定报告基因荧光素酶的活性.结果表明,小鼠PAI-1基因起动子－690至－850碱基序列之间有一个Dex的正调控元件.用计算机软件进行分析发现：Dex顺式元件位于PAI-1启动子的－750至－770碱基序列.其组成为：5′ GGTAACCTCTGTTCTCAT 3′.同时还发现在PAI-1启动子的－720至－740碱基序列中,存在一个C/EBPs的结合元件5′CCAAT3′并用凝胶电泳迁移实验对这些元件进行了鉴定.表明Dex正是通过激活转录因子（糖皮质激素受体,GR）和C/EBPα一起与各自的顺式元件结合来促进PAI-1基因的表达.     

共表达人p53、GM-CSF和B7-1基因的重组腺病毒的构建

 为开展肿瘤的复合基因治疗 ,构建以串联方式携带人野生型p53、GM CSF和B7 1基因的重组腺病毒穿梭质粒pBB 1 0 2 .将pBB 1 0 2与腺病毒包装质粒GT40 50共转染 2 93细胞 ,通过细胞内同源重组获得重组腺病毒BB 1 0 2 .在 2 93细胞中扩增病毒 ,并通过氯化铯密度梯度超速离心纯化病毒 ,获得高滴度和高纯度的病毒 .分别经免疫组织化学分析、ELISA和流式细胞分析 ,检测BB 1 0 2介导的人野生型p53、GM CSF和B7 1基因在喉癌细胞Hep 2中的表达 .结果表明 ,BB 1 0 2能够有效地将其所携带的目的基因导入Hep 2细胞并使其在细胞中高效表达 ,表达高峰期为转染后 2～ 4d ,此后随时间递减 ,可持续 1 0d以上 .     

广州地区新型H1N1流感病毒PB1-F2基因进化和变异分析

比较和分析2009～2011年广州地区分离到的甲型H1N1流感病毒PB1-F2基因和世界各地甲型H1N1流感病毒PB1-F2基因的变异情况,为该蛋白的功能和作用机制奠定基础。对分离自中国广州地区2009～2011年人类感染的17株新型H1N1和1株季节性H1N1流感病毒进行了PB1-F2基因克隆和序列测定,通过与GenBank数据库中68株人类新型H1N1和季节性H1N1流感病毒参考株的PB1-F2基因进行比对。结果表明,甲型流感病毒的PB1-F2基因进化树形成了2个不同的进化分支。全部2009～2011年新型H1N1流感病毒为一分支。广州地区PB1-F2基因与其它地区分离到的新型H1N1流感病毒具有高度的同源性,均为截短型变异。本实验室分离的1株季节性H1N1流感病毒也发生了第12位氨基酸截短突变。广州地区新型H1N1流感病毒PB1-F2截短蛋白与其它地区病毒相比未发生氨基酸变异,季节性H1N1流感病毒发现类似新型H1N1流感病毒PB1-F2的截短变异,提示新型H1N1流感病毒和季节性H1N1流感病毒PB1-F2可能发生早期重组。     

Bt菌株QCL-1中cry2Ac10基因的克隆、表达和活性研究

目的:从高毒力Bt菌株中克隆cry2Ac10基因,并研究其表达和杀虫活性。方法:以Bt菌株QCL-1质粒为模板,利用cry2特异性引物FY2A5和FY2A3进行PCR扩增,将目的片段克隆到表达载体pET-21b( ),构建T7启动子控制的大肠杆菌重组表达质粒pET21b-cry2Ac。经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测基因表达情况,然后对表达产物进行生物活性测定。结果:从菌株QCL-1中克隆出目的基因,该基因的编码框由1 872个碱基组成,编码的蛋白质由623个氨基酸组成,与已报道的Cry2Ac氨基酸同源性为97.4%~99.7%。该基因(GenBank accession EF405952)已被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry2Ac10。该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达70kDa的蛋白,表达产物对棉铃虫、粘虫和粉纹夜蛾幼虫具有高毒力,同时对甜菜夜蛾幼虫生长有抑制作用,其中对棉铃虫和粘虫初孵幼虫的LC50分别为30.0μg/g和16.7μg/g。结论:成功克隆和表达了cry2Ac10基因,并明确了cry2Ac10蛋白的活性,为该基因的研究和应用奠定基础。     

甲型H1N1流感病毒NA、PB2和PA表位抗原区段的克隆和表达

目的:分析比对甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)、聚合酶B2(PB2)和聚合酶A(PA)抗原的序列,克隆表达保守的和变异的表位抗原区段,为免疫学诊断试剂的研究提供候选抗原。方法:采用BioSun生物学软件比较新近公布的A/H1N1流感病毒和我国猪流感病毒浙江株NA、PB2和PA抗原序列,并预测筛选NA、PB2和PA抗原表位保守区段与变异区段,采用PCR逐步合成法合成NA、PB2和PA表位抗原区段基因序列,并利用原核表达载体pBVIL1进行克隆表达。结果:筛选的保守表位抗原区段和变异表位抗原区段为NA/135～180aa、NA/310～350aa、PB2/1～80aa、PA/41～90aa、PA/231～280aa和PA/341～400aa;获得6条表位抗原区段基因序列,且6条表位抗原区段均获得了高效表达,得到纯化后的抗原。结论:获得了A/H1N1流感病毒NA、PB2和PA表位抗原区段,为进一步研制特异的甲型流感病毒快速诊断试剂提供了抗原储备。     

核受体辅活化子PNRC与孤儿核受体SF1的相互作用有赖于SF1的AF-2功能结构域

核受体辅活化子PNRC(proline richnuclearreceptorcoregulatoryprotein ,富含脯氨酸的核受体辅调节蛋白 )可通过含SH3结合模体的PNRC2 78 30 0区域与孤儿核受体类固醇生成因子 1(steroido genicfactor 1,SF1)相互作用 .激活功能 2 (activationfunction 2 ,AF 2 )结构域在核受体配体依赖性转录激活中发挥了重要作用 ,为探讨AF 2结构域在SF1转录激活中的作用机制 ,采用酵母双杂合分析、缺失突变技术和瞬时转染等研究方法考察了AF 2结构域对SF1反式激活功能及SF1与PNRC相互作用的影响 .SF1的反式激活功能有赖于AF 2结构域 ,其机制是SF1AF 2结构域的突变严重影响了SF1与PNRC的有效相互作用 ,并消除了PNRC对SF1反式激活功能的辅激活作用 .结果表明 ,SF1与PNRC的相互作用有赖于AF 2的功能结构域     

IGF2‐derived miR‐483‐3p associated with Hirschsprung's disease by targeting FHL1

HSCR (Hirschsprung's disease) is a serious congenital defect, and the aetiology of it remains unclear. Many studies have highlighted the significant roles of intronic miRNAs and their host genes in various disease, few was mentioned in HSCR although. In this study, miR‐483‐3p along with its host gene IGF2 (Insulin‐like growth factor 2) was found down‐regulated in 60 HSCR aganglionic colon tissues compared with 60 normal controls. FHL1 (Four and a half LIM domains 1) was determined as a target gene of miR‐483‐3p via dual‐luciferase reporter assay, and its expression was at a higher level in HSCR tissues. Here, we study cell migration and proliferation in human 293T and SH‐SY5Y cell lines by performing Transwell and CCK8 assays. In conclusion, the knockdown of miR‐483‐3p and IGF2 both suppressed cell migration and proliferation, while the loss of FHL1 leads to opposite outcome. Furthermore, miR‐483‐3p mimics could rescue the negative effects on cell proliferation and migration caused by silencing IGF2, while the FHL1 siRNA may inverse the function of miR‐483‐3p inhibitor. This study revealed that miR‐483‐3p derived from IGF2 was associated with Hirschsprung's disease by targeting FHL1 and may provide a new pathway to understand the aetiology of HSCR.