siRNA抑制c—myc基因的表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：利用siRNA（small interference RNA）技术研究C-myc基因的对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法：依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对C-myc基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA。通过阳离子聚合物jet—SITM—ENDO将合成的siRNA转染入HeLa细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNA—scr转染细胞为对照。用细胞计数法检测siRNA对HeLa细胞增殖的影响。流式细胞法检测细胞周期及蛋白表达的变化,RT—PCR法比较转染前后C-myc mRNA表达水平的变化。结果：细胞计数法结果显示,转染24h后c-myc基因siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48h后,抑制效率稳定。c-myc基因siRNA转染后能有效地抑制HeLa细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0／G1期,siRNA转染组c-myc mRNA、蛋白的表达量明显低于空白对照组、错义序列组。结论：体外转录合成的siRNA可有效降低HeLa细胞c-myc基因的表达,抑制细胞增殖。     

抑制VEGF基因表达对乳腺癌细胞细胞周期的影响

目的：研究针对VEGF基因的siRNA（small interferenceRNA）对乳腺癌MCF-7细胞细胞周期的影响。方法：依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对VEGF基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA。脂质体转染法将合成的siRNA转染入MCF-7细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNAscr转染细胞为对照。用细胞计数法检测siRNA对MCF-7细胞增殖的影响：流式细胞法检测细胞周期变化,RT—PCR法比较转染前后p21、CyclinDl表达水平的变化,Westemblot检测转染前后磷酸化ERK的表达。结果：细胞计数法结果显示,转染24h后siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48h后,抑制效率稳定。siRNA转染后能有效地抑制MCF-7细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0／G1期,S期细胞明显减少,G0／G1期细胞比例逐渐增多;p21mRNA表达显著上调,抑制CyclinD1mRNA及磷酸化ERK蛋白的表达。结论：体外转录合成的siRNA可能通过上调细胞周期蚤白激酶抑制剂p21的表达,下调CyclinDl及磷酸化ERK的表达,将细胞周期阻滞于G0／G1期,从而显著抑制MCF-7细胞的增殖。     

靶向XBP1S的RNA干扰质粒对细胞增殖的影响

目的 构建靶向人XBP1S的siRNA真核表达载体（pSUPER-XBP1S）并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.方法 设计并合成针对XBP1S基因的siRNA,退火成互补双链后克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒,并将其转染入HeLa细胞和HepG2细胞中.采用RT-PCR检测转染前后XBP1S在HeLa细胞和HepG2细胞中的转录,Western印迹检测转染前后XBP1S蛋白的表达;MTT法、细胞计数检测重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒能有效地抑制HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S基因的转录和表达;转染HeLa细胞和HepG2细胞后,细胞增殖抑制率及细胞增殖数与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 成功构建了靶向人XBP1S的siRNA表达载体pSUPER-XBP1S,并且有效的抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S的转录和表达,有效抑制了细胞的增殖能力.     

抑制VEGF基因表达对大肠癌细胞HT-29的增殖影响

选择血管内皮生长因子（VEGF）基因为靶基因,设计两组针对VEGF mRNA的小干扰RNA．合成DNA寡核苷酸链,体外转录合成siRNA．以人大肠癌细胞系HT-29为靶细胞,应用脂质体转染的方法,将siRNA导入细胞．MTT法检测siRNA对细胞增殖率的影响,RT—PCR法比较转染前后VEGFmRNA表达水平的变化．ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化．结果表明,两组siRNA转染后均能有效地抑制HT-29细胞的生长,VEGF mRNA的表达量大幅度减少;相对应的VEGF蛋白水平也显著降低,而作为阴性对照的错义序列组siRNA转染后则无上述作用．     

敲减VEGFR-1基因抑制乳腺癌细胞增殖的研究

目的:体外水平探讨利用化学修饰的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲减VEGFR-1基因治疗乳腺癌的可行性和特异性.方法:采用阳离子脂质Lipofectamine2000TM作为转染试剂将同时针对人和大鼠VEGFR-1基因的小干扰RNA转染人乳腺癌细胞系MCF-7和大鼠乳腺癌细胞系SHZ-88,敲减VEGFR-1基因的表达;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,半定量RT-PCR,蛋白印迹试验等检测VEGFR-1mRNA和蛋白表达及细胞增殖变化.结果:靶向VEGFR-1基因的siRNA转染细胞后,两种细胞增殖均被抑制,同浓度两细胞株指标无显著差异,VEGFR-1mRNA和蛋白的表达均明显降低.各对照组指标则无显著变化.结论:化学修饰的siRNA介导的RNAi能成功敲减VEGFR-1基因的表达、抑制乳腺癌细胞增殖.     

siRNA沉默SIRT1基因对宫颈癌细胞HeLa增殖和凋亡的影响

化学合成靶向SIRT1基因的小干扰RNA,脂质体法转染人宫颈癌细胞株HeLa,观察小干扰RNA沉默SIRT1基因对HeLa增殖及细胞凋亡的影响。在优化siRNA SIRT1转染条件的基础上,应用RT-PCR和Western blot分别检测各组SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白及凋亡相关蛋白的表达;CCK-8法检测细胞增殖抑制率;Hoechst荧光染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果表明,siRNA SIRT1转染细胞组SIRT1 mRNA水平和蛋白表达量明显低于对照组;siRNA SIRT1转染组细胞增殖受抑制,细胞凋亡率明显增加;凋亡相关蛋白P53、P21表达上调,Survivin表达下调。上述结果表明:siRNA SIRT1诱导的HeLa细胞凋亡与P53、P21、Survivin通路关系密切,但siRNA SIRT1诱导HeLa细胞凋亡的详尽机制有待进一步研究。     

转录因子Foxo3a高表达对小鼠T淋巴瘤EL-4细胞周期和凋亡的影响

为了研究转录因子Foxo3a高表达对小鼠T淋巴瘤EL-4细胞周期和凋亡的影响,采用电穿孔法将真核表达载体pEGFP-N1/Foxo3a转染小鼠T淋巴瘤细胞系EL-4细胞,并通过聚合酶链式反应和免疫印迹法分别检测Foxo3a mRNA及蛋白表达。转录因子Foxo3a高表达后,采用细胞计数法绘制其细胞生长曲线;采用荧光显微镜法及流式细胞仪定性和定量观察典型EL-4细胞凋亡形态特征、细胞凋亡百分率及细胞周期变化情况。结果表明,转录因子Foxo3a真核表达质粒pEGFP-N1/Foxo3a经酶切鉴定及测序检测序列正确。转染pEGFP-N1/Foxo3a的小鼠EL-4细胞表达Foxo3a mRNA和蛋白水平显著升高。Foxo3a高表达明显抑制EL-4细胞的增殖能力,并使EL-4细胞发生明显G2期阻滞(P<0.001)。Foxo3a基因高表达后,荧光显微镜可以观察到典型凋亡的细胞形态。同时,EL-4细胞凋亡百分率显著升高(P<0.01)。结果提示,Foxo3a高表达可以有效抑制小鼠T淋巴瘤细胞体外细胞增殖,使细胞周期G2时相阻滞,并具有诱导细胞凋亡的作用。     

STAT3反义核酸对HL-60细胞周期及c-myc mRNA表达的影响

实验分反义组、无义组、脂质体组、空白组,转染后,应用四唑盐（MTT）比色法分析细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞周期,RT-PCR检测细胞中STAT3 mRNA和c-myc mRNA的表达。探讨STAT3反义寡核苷酸对白血病细胞HL-60细胞周期及c-myc的影响。STAT3 ASODN抑制HL-60细胞增殖呈时间和浓度依赖性;反义寡核苷酸作用后,G0/G1期细胞明显减少,S期细胞增多,细胞周期进程受到明显阻滞;反义寡核苷酸作用48h后细胞内STAT3mRNA及c-myc mRNA的表达水平下降,与各对照组比较有显著性差异（P〈0.05）。STAT3 ASODN能够明显抑制HL-60细胞增殖,并能阻滞HL-60细胞于G0/G1期、并下调c-myc mRNA的表达。     

siRNA靶向沉默p22phox表达对内皮细胞衰老抑制作用的研究

设计特异性siRNA(Short interference RNA)诱导人脐静脉内皮细胞株ECV-304细胞NAD(P)H氧化酶活性亚单位p22phox基因沉默, 探讨p22phox基因沉默在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的ECV-304衰老中的作用及机理。应用体外转录合成3种siRNA转染体外培养的ECV-304, RT-PCR鉴定对p22phox基因沉默的效率和特异性, 确立适宜的转染浓度和基因沉默的持续时间; ECV-304分为空白对照组、AngⅡ组、siRNA转染组、AngⅡ+siRNA转染组, 观察细胞衰老改变及活性氧水平, 分析各组细胞p22phox的mRNA及蛋白表达。结果表明: 3种siRNA中, 一种对p22phox mRNA表达抑制率达到83％, 在一定转染浓度范围内, siRNA诱导的基因沉默效率呈剂量依赖性, 抑制效率高峰期在24~36 h; 给予AngⅡ后, b-gal染色阳性细胞数显著增加, 出现衰老的特征性改变, 衰老细胞p22phox的 mRNA及蛋白表达增加, 伴有一氧化氮(NO)生成减少, 活性氧生成增加, siRNA诱导p22phox基因沉默后降低了活性氧水平, 增加NO生成, 改善了AngⅡ诱导的ECV-304细胞的衰老改变。siRNA干扰技术可成功诱导NAD(P)H氧化酶p22phox基因沉默, 从而减缓AngⅡ诱导体外培养的ECV-304衰老进程, p22phox是防治衰老有希望的分子靶点。     

应用DNA芯片鉴定HPV18 E6-siRNA诱导HeLa 细胞凋亡的分子机制

高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）的E6基因在宫颈癌的发生中起关键作用,特异siRNA能有效抑制宫颈癌HeLa 细胞内HPV18 E6基因的表达,诱导肿瘤细胞凋亡.为进一步探讨HPV18 E6-siRNA诱导HeLa 细胞凋亡的分子机制,针对HPV18-E6基因设计siRNA序列,利用人源U6启动子为模板,经PCR表达框架法体外扩增,转染宫颈癌HeLa细胞抑制HPV18 -E6基因表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡.对转染前后HeLa细胞总RNA样品进行荧光标记后,与Agilent Human 1A寡核苷酸芯片杂交、扫描、数据分析及标准化处理,确定表达差异的基因并经荧光定量PCR对部分基因进行验证,结合PANTHER数据分析系统,将这些基因按照生物学功能进行归类,查阅GenBank数据库及相关文献,对其结果进行深入分析及讨论.在检测的18 716个基因和EST中,共筛出差异表达基因359个,其中307个基因表达上调,52个基因表达下调,主要包括细胞周期相关基因CCNG1、p21;凋亡相关基因CASP4、CASP6、IGFBP3、DFFA;泛素蛋白酶解途径相关基因E6-AP、UBE2C;角化细胞分化相关基因KRT4、KRT6E、KRT18;抑癌基因RECK、VHL等.研究结果表明,HPV18 -E6基因抑制引起的细胞凋亡效应主要是通过P53信号途径和泛素蛋白酶解信号途径调节细胞周期相关基因和凋亡相关基因的表达,从而抑制HeLa细胞增殖、促进细胞凋亡.同时,抑癌基因的激活,角化细胞分化和免疫相关基因的表达上调,都说明了E6抑制后肿瘤细胞恶性转化程度的下降.     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism