植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅲ.高粱叶片PEP羧化酶的多构象状态

应用NEM对酶的化学修饰技术,报导了半胱氨酸残基与高粱叶片的PEP羧化酶催化功能的关系。结果表明,NEM修饰使PEP羧化酶活性丧失。酶的失活速度表现为拟一级反应动力学特性。随NEM浓度的增加酶的失活速度加快。不同效应剂对酶的NEM失活具不同影响。油酸和MgCl_2促进酶的失活,G6P、甘氨酸和苹果酸各具有不同程度的保护作用。以P_(0.5)值来比较G6P和甘氨酸的保护效果,其值各为4.17mM和3.44mM。而当这两种效应剂以等量浓度同时存在时,P_(0.5)值下降为0.06mM,表现出它们的协同保护作用。从复合效应剂对酶的热失活速度和最大反应速度(V_(max))的影响亦可看出这种协同作用的存在。上述两方面的结果表明G6P和甘氨酸同时存在时诱发的酶的构象状态与它们分别存在时诱发的构象状态各不相同。根据这些结果提出了高粱叶片的PEP羧化酶可能存在的多构象状态模型,并对其生理意义进行了讨论。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅶ.PEP羧化酶必需赖氨酸残基的化学修饰

本文报道纯化的高粱叶片PEP 羧化酶经氨基修饰剂TNBS 和PLP 的修饰迅速失活。酶的TNBS 失活与保温时间和抑制剂浓度呈函数关系并表现为拟一级反应的特性。动力学资料表明酶仅被1分子TNBS 修饰即失活。TNBS 修饰酶的吸收光谱特性表明被修饰的是酶蛋白的赖氨酸残基。底物(PEP)和效应剂(G6P)保护酶免被TNBS 失活。计算G6P 和酶的解离常数K_d-2.39×10~(-3)M。酶的其他反应组分HCO_3~-和MgCl_2单独存在时均不影响TNBS 对酶的失活作用。在被TNBS 修饰过程中还导致酶对G6P 迅速脱敏,同时却保持酶对甘氨酸的敏感性。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅶ.PEP羧化酶必需赖氨酸残基的化学修饰

本文报道纯化的高粱叶片PEP羧化酶经氨基修饰剂TNBS和PLP的修饰迅速失活。酶的TNBS失活与保温时间和抑制剂浓度呈函数关系并表现为拟一级反应的特性。动力学资料表明酶仅被1分子TNBS修饰即失活。TNBS修饰酶的吸收光谱特性表明被修饰的是酶蛋白的赖氨酸残基。底物(PEP)和效应剂(G6P)保护酶免被TNBS失活。计算G6P和酶的解离常数K_d=2.39×10~(-3)M。酶的其他反应组分HCO_3~-和MgCl_2单独存在时均不影响TNBS对酶的失活作用。在被TNBS修饰过程中还导致酶对G6P迅速脱敏,同时却保持酶对甘氨酸的敏感性。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究 V.PEP羧化酶的可逆冷失活

从高梁叶片中纯化的PEP羧化酶在低温下活性迅速丧失,失活是可逆的。将低温失活的酶重新加热至室温酶,活性可以得到恢复。酶的失活速度与介质温度有关。温度越低,失活速度越快。 底物PEP、效应剂G6P、甘氨酸均能防止酶的低温失活。在G6P和甘氨酸同时存在时对酶的保护更为有效。 酶的沉降特性表明在低温下酶由聚合状态(10.2S)解联成低聚状态(4.1S)。而在G6P和甘氨酸的共同保护下,酶在低温下仍保持具有催化活性的聚合状态(10.1S)。 尿索(3M)导致酶的失活,而在G6P和甘氨酸的存在下酶的失活程度大大下降(残存酶活性为53％),而在Mg~(++)同时存在下可使酶对尿素的稳定性大大提高(残存酶活性为79％)。 NaCl,KCl等也具有防止酶低温失活的作用。     

植物磷酸烯醇式两酮酸羧化酶的研究——Ⅵ.葡萄糖-6-磷酸和甘氨酸对高粱叶片PEP羧化酶的稳定效应

高粱叶片的PEP羧化酶对温度很敏感,在45℃下迅速失活。加入变构活化剂G6P或者甘氨酸对酶的稳定性没有明显的影响。但当在C6P和甘氨酸同时存在时,酶对高温的稳定性则大大提高了。PEP羧化酶在低温中也不稳定。4℃下很快失活。酶的这种冷失活现象也可为加入效应剂G6P和甘氨酸所防止。 比较一些多羟基醇类对酶的热稳定性的影响,表明它们都显著地提高酶的热稳定性。山梨醇的保护作用最强,赤藓醇次之,甘油又次之。说明保护效应与保护剂的羟基数有关。应用含有G6P、甘氨酸和甘油(GGG)的缓冲液对提高酶在纯化和贮存过程中的稳定性非常有效。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的可逆胍变性

纯化的高梁叶片磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEP羧化酶)经不同浓度的盐酸胍处理变性失活后,在试验的蛋白浓度范围内,它的失活时间进程的动力学分析表明为一级反应。0.4 M盐酸胍处理25分钟后(O℃),酶的催化活性完全丧失,酶蛋白的远紫外圆二色性光谱、内源荧光光谱及免疫特异性等测定均表明酶的结构发生了深刻变化。甘油及PEP羧化酶的变构效应剂G6P和甘氨酸对酶在盐酸胍溶液中的变性作用有一定的保护效果。变性酶用复性缓冲液稀释20倍后,在最佳条件下,再经30分钟保温,酶的催化活性能恢复70％以上。G6P和甘氨酸能促进变性酶的复性,甘油亦有明显效果。随着酶活性的恢复,它的远紫外圆二色性、内源荧光及免疫特异性也随之恢复,变性酶的复性速率在常温下(25℃)比在低温下(0℃)要快得多。     

色氨酸残基在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化功能中的作用

在pH7.5条件下,用NBS对PEP羧化酶中色氨酸残基进行共价修饰表明,PEP羧化酶中48个色氨酸残基均能被NBS修饰。用邹承鲁图解法求得,其中4个残基为酶表现催化活性所必需的。 PEP羧化酶的变构效应剂G6P、Gly及Mal分别与酶预保温后,再经NBS修饰,前两种处理中,同样浓度的NBS所用修饰的色氨酸残基数和处理后的残存酶活与对照相比有很大的差异,而用Mal处理的,两者与对照相差无几。     

乙醇酸氧化酶必需精氨酸残基的化学修饰

丁二酮能使GAO迅速失活,其失活速度受介质pH和硼酸浓度的显著影响;其修饰反应具可逆性,当透析除去修饰剂和硼酸时,活性得到恢复。失活进程表现为假一级动力学。而计算表明,酶的每一活性中心单位与一分子丁二酮结合便可引起酶的失活。底物和竞争性抑制剂均能有效地保护酶免于失活。氨基酸分析表明,酶的失活是因为丁二酮修饰了精氨酸残基。丁二酮修饰GAO后使酶的K_m增大,而V_m没有变化。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅱ.高粱叶片PEP羧化酶的代谢物调节特性和油酸抑制效应

本文报导高粱叶片的PEP羧化酶与一些代谢物相互作用的动力学特性。MgCl_2对不同PEP羧化酶同工酶表现程度不同的负协同性,Hill系数分别为0`86(PC Ⅰ)和0.47(PCⅡ)。PEP的饱和曲线呈S型。Hill系数为2.4,表现为正协同性。在不同浓度的G6P存在下,曲线的S型特性消失,Hill系数下降至1。而在不同浓度甘氨酸存在下负协同程度逐步增强,Hill系数为0.72。测定不同浓度G6P对酶活化程度的影响结果表明高浓度G6P(10 mM以上)活化程度反而下降,同时加入低浓度的甘氨酸(0.1～5 mM)能减缓高浓度G6P活化作用下降的程度。上述结果表明Mg~( )和PEP不仅作为底物或辅因子参与反应而且以同位协同的方式调节酶构象的变化,G6P和gly活化酶的作用类型是不同的。低浓度油酸(5～50 μM)对酶有强烈的抑制效应。高浓度Mg~( )不能解除其对酶的抑制。不同材料的酶对油酸反应不同。使高梁叶片PC Ⅰ活性完全抑制的油酸浓度(100 μM),对PCⅡ和小麦的PEP羧化酶活性几乎没有多大影响,表明油酸对高梁光合型PEP羧化酶的选择性抑制与Mg~( )的螯合作用无关。酶先后与Mg~( )或油酸预保温试验结果表明油酸可能作用于Mg~( )在酶蛋白上的调节位置。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶精氨酸残基的化学修饰

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的精氨酸残基被苯乙二醛或2,3-丁二酮修饰后,可导致酶催化活性以及对AMP抑制的敏感性的丧失。在修饰时,有底物或AMP存在,可分别保护酶的这两种性质,表明与活力有关以及与AMP抑制有关的是两类不同的精氨酸残基。在底物保护了与活力有关的精氨酸残基后,可以观察到修饰引起酶对AMP抑制的脱敏,完全脱敏后,每一亚基有2个精氨酸残基被修饰。在本文条件下,K~ 对酶的激活作用以及K~ 存在时酶对AMP抑制敏感性增强等性质均不因精氨酸残基的修饰而变化。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶精氨酸残基的化学修饰

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的精氨酸残基被苯乙二醛或2,3-丁二酮修饰后,可导致酶催化活性以及对AMP 抑制的敏感性的丧失。在修饰时,有底物或AMP 存在,可分别保护酶的这两种性质,表明与活力有关以及与AMP 抑制有关的是两类不同的精氨酸残基。在底物保护了与活力有关的精氨酸残基后,可以观察到修饰引起酶对AMP 抑制的脱敏,完全脱敏后,每一亚基有2个精氨酸残基被修饰。在本文条件下,K~+对酶的激活作用以及K~+存在时酶对AMP 抑制敏感性增强等性质均不因精氨酸残基的修饰而变化。     

高粱叶片PEP羧化酶的溶液构象——近紫外圆二色性光谱研究

用近紫外CD光谱技术追踪了PEP羧化酶与各种配基的相互作用。底物PEP、必需金属离子Mg~( )、PEP-Mg~( )以及效应剂G6P、Gly、G6P-Gly,均可引起高粱叶片PEP羧化酶近紫外CD光谱各不相同的变化。这表明高粱叶片PEP羧化酶分子构象有较大的灵活性,不同的配基与酶相互作用可引起酶分子不同的构象变化,因而使酶分子表现出催化功能、调节特性、必需氨基酸残基的化学反应性以及稳定性诸方面的差异。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅸ.高粱叶片PEP羧化酶的可逆酸变性

在酸性pH下高粱叶片PEP羧化酶的酶活性的丧失伴随着酶蛋白内源荧光强度和ANS-酶复合物荧光强度的变化。经变性缓冲液(pH 3.4)处理导致蛋白质内源荧光强度的下降和ANS-酶复合物荧光强度的增加,同时表现出ANS-酶复合物发射光谱最大荧光波长的轻微蓝移(从493 nm移至487nm)。经pH 2.6和pH 3.4酸处理变性的PEP羧化酶可以借含有DTT或β-巯基乙醇的缓冲液(pH 8.3)恢复大部份酶活性。在最适条件下,酶活性的恢复可达90％以上,随着酶潘性的恢复,酶的荧光特性随之恢复。酶复性过程遵从一级反应动力学。甘油明显减缓酶的复性过程,减缓程度与其浓度有关。酶的效应剂甘氨酸、丝氢酸和G6P提高酶的复性速度,其中甘氨酸最为有效。动力学分析表明无论上述效应剂或甘油存在与否都不改变复性过程的反应级。     

低温对玉米叶片PEP羧化酶及其调节特性的影响

低温贮存期间,玉米叶片PEP羧化酶活性随贮存时间的延长而明显降低,对效应剂Gly的敏感性也减弱。多羟基醇(甘油和山梨醇)以及PEP羧化酶的正效应剂G-6-P在与Gly和甘油同时作用时,对PEP羧化酶在低温贮存期间的活性和对Gly的敏感性均有保护效应,且对两者的保护程度相一致,表明低温贮存期间PEP羧化酶对效应剂敏感性减弱与其低温失活有直接关系。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅰ.PEP羧化酶同功酶的分离和变构特性的比较

本文报导高梁(C_4植物)和小麦(C_3)植物绿色和黄化叶片中PEP羧化酶的一些特性的比较研究。结果表明不同材料叶片的PEP羧化酶对一些代谢物的反应不同。高梁绿色叶片的PEP羧化酶为G6P、Gly和FDP所激活,为油酸和柠檬酸所抑制。G6P、Gly和FDP对小麦叶片(绿色和黄化叶)、高粱黄化叶片的PEP羧化酶则均无激活作用,油酸和柠檬酸的抑制效应也消失或者下降。 比较这些不同来源的PEP羧化酶在DEAE——纤维素柱层析的结果表明它们具有不同的离子特性。在高粱绿色叶片中分得两种具有不同物理学和动力学特性的PEP羧化酶同功酶(PCⅠ;PCⅡ)。它们的Km(PEP)值各为1.66毫克分子和0.181毫克分子。PCⅡ对G6P的反应较迟钝。从NaCl洗脱梯度、聚丙烯酰胺凝胶电泳和对变构效应剂的反应来看,PCⅡ的一些特性接近于小麦的PE羧化酶。     

低温胁迫对水稻幼苗PEP羧化酶的影响

水稻幼苗经低温(0℃)处理后,叶片中PEP羧化酶活性明显地降低.Km值增大。经1—2天低温处理者,增加反应底物的浓度,有减少PEP羧化酶活性降低的幅度;当低温伤害严重时(0℃4天),这种效应则消失。这些结果表明:水稻叶片中PEP羧化酶对低温反应是敏感的,其活性的下降是由于该酶对底物的亲和力的降低。     

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶cDNA在T7 RNA多聚酶/启动子系统中专一性表达的研究

用PT7和pGP1—2质粒偶联表达系统,通过温度诱导(30～42℃),使温度敏感基因CI875失活;加入利福霉素选择性抑制E.coliRNA多聚酶的表达,从而使外源PEP羧化酶cDNA得到专一性的表达。产物经SDS—PAGE和Wesern杂交分析,表明该系统表达出两条PEP羧化酶带,分子量分别是78kD和80kD。     

棉铃虫可溶型海藻糖酶的化学修饰

【目的】本研究旨在通过分析化学修饰剂对棉铃虫Helicoverpa armigera可溶型海藻糖酶活性的影响,以明确海藻糖酶活性中心的结构特点和氨基酸构成。【方法】采用化学修饰方法,测定不同修饰剂处理后棉铃虫5龄幼虫海藻糖酶催化活性的变化,进而通过化学修饰反应失活常数来推测酶活性中心的特定氨基酸残基数量。【结果】采用8 mmol/L水溶性碳二亚胺(carbodiimide,EDC)溶液和25 mmol/L苯甲酰甲醛(phenylglyoxal,PG)溶液分别对棉铃虫5龄幼虫海藻糖酶羧酸基团和精氨酸残基进行修饰后,其活性分别减少81.58%和54.14%,这表明对羧酸基团和精氨酸残基的修饰可有效抑制海藻糖酶活性。底物海藻糖可保护海藻糖酶不受修饰剂的影响。修饰动力学结果显示,海藻糖酶活性中心可能包含1个羧酸基团和2个精氨酸残基。【结论】结果表明,含有羧基的谷氨酸和天冬氨酸是海藻糖酶活性中心的催化残基,精氨酸是维持海藻糖酶活性的必要残基。本研究结果可为开发新型农药提供理论支持。     

组氨酸残基在乙醇酸氧化酶活性中的作用

DEPC能显著抑制GAO的活性。其失活速度表现为假一级动力学特性,并和抑制剂浓度成线性正比关系。底物乙醇酸可保护GAO免受DEPC抑制,羟胺能使被抑制的酶重新复活。光谱测定表明,被抑制的酶只有组氨酸残基被修饰,而酪氨酸残基未被修饰,修饰前后酶的氨基含量均无变化。反应动力学表明,在35℃下,GAO中有一个pK为6.5的解离基团和催化活性有关,其解离⊿H为31610 J/mol。因此组氨酸残基为GAO催化活性的一个必需基团。     

豇豆初生叶多胺氧化酶的分子特性

从6d苗龄的豇豆幼苗初生叶中提纯得到的多胺氧化酶是一种糖蛋白,其碳水化合物含量为8．17％,全酶分子量约为146kD,由分子量为70kD的两个相同亚基组成,每个亚基含1个Cu^2 。该酶的等电点为6．2,吸收光谱分别在波长278nm和500nm处有1吸收峰。8种蛋白质修饰剂修饰试验并配合底物保护证实酷氨酸,赖氨酸和色氨酸残基及－SH都不是该酶活性中心的必需基团,而组氨酸残基则是活性中心的必需基团,进一步分析部分失活的修饰酶动力学参数的变化得知,组氨酸残基可能处于酶分子的催化部位而非底物的结合部位。