甲型H5N1流感病毒M2与HA双基因载体疫苗在小鼠体内的免疫学评价

高致病性H5N1亚型禽流感病毒 (AIV) 严重威胁到人类健康,因此研制高效、安全的禽流感疫苗具有重要意义。以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒 (A/Anhui/1/2005) 作为研究对象,PCR扩增基质蛋白2 (M2) 和血凝素 (HA) 基因全长开放阅读框片段,构建共表达H5N1亚型AIV膜蛋白基因 M2和HA的重组质粒pStar-M2/HA。此外,还通过同源重组以293细胞包装出表达M2基因的重组腺病毒Ad-M2以及表达HA基因的重组腺病毒Ad-HA。用间接免疫荧光 (IFA) 方法检测到了各载体上插入基因的表达。按初免-加强程序分别用重组质粒pStar-M2/HA和重组腺病毒Ad-HA+Ad-M2免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔14 d。第1、3次用DNA疫苗,第2、4次用重组腺病毒载体疫苗,每次免疫前及末次免疫后14 d采集血清用于检测体液免疫应答,末次免疫后14 d采集脾淋巴细胞用于检测细胞免疫应答。血凝抑制 (HI) 实验检测到免疫后小鼠血清中的HI活性。ELISA实验检测到免疫后小鼠血清中抗H5N1亚型流感病毒表面蛋白的IgG抗体。ELISPOT实验检测到免疫后小鼠针对M2蛋白和HA蛋白的特异性细胞免疫应答。流感病毒M2与HA双基因共免疫的研究,为研究开发新型重组流感疫苗奠定了基础。     

人H5N1流感病毒血凝素蛋白DNA疫苗的构建及其免疫原性研究

将我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和HA1基因片段并克隆至真核表达载体pStar,构建成真核表达质粒。通过Western blot和间接免疫荧光检测方法确认,构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和HA1。将重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测免疫后外周血中HA/HA1特异性抗体的效价,并比较HA和HA1的免疫原性。结果表明,重组质粒免疫后成功地诱导了体液免疫反应,且二者的血清抗体效价无显著性差异。     

H5N1禽流感病毒HA和NA基因重组腺病毒共表达载体的构建

利用口蹄疫病毒(FMDV)2A蛋白具有自我裂解的功能,将其作为连接肽构建携带有H5N1亚型AIVHA和NA基因的重组腺病毒表达载体,进而为AIV基因工程疫苗的开发以及相关诊断试剂的开发提供依据。采用融合PCR的方法扩增出含有H5N1 AIV HA-2A-NA的基因,定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA,将pAdeasyd-H5经PacI线性化后转染HEK293细胞株包装出含有HA-2A-NA基因的腺病毒pAd-HA-2A-NA。结果表明,构建的含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA经PCR、双酶切及核苷酸测序测定无误。线性化后的pAdeasy-HA-2A-NA转染HEK293细胞包装成功获得腺病毒pAd-HA-2A-NA载体,经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。本试验构建的含有AIV H5N1亚型HA-2A-NA基因的重组腺病毒表达载体,将为进一步研究开发基因工程疫苗提供病毒模型。     

中国H5N1禽流感病毒HA基因的分子进化分析

为了阐明中国H5N1禽流感病毒血凝素(HA)基因的分子进化规律,从GenBank下载中国近年来分离的27株禽流感H5N1病毒的HA基因,利用LaserGene软件包中的EditSeq程序剪切共同序列并翻译成氨基酸序列,与DNAMAN软件进行比对,并以LaserGene软件包中的MegAlign程序构建分子进化树,结合背景资料分析其传播流行规律。结果显示:①在HA裂解位点上游毗邻的位置,gdch04、gddu04、gxch0405、gxdu05、gxqu0502、hkcph05、stch05、stqu05、ynch0502株都缺失了三个碱基;②27株毒株在HA裂解位点上游毗邻的位置存在多个连续的碱性氨基酸;③来自广西的gxch0405、gxdu05、gxqu0502和来自香港的hkcph05、hkgh04的序列同源性很高,很可能与苍鹭的迁移有关;④来自广西的gxqu0502和来自香港的hkcph05亲源关系很近,很可能来自同一祖先。     

一种新发现的流感病毒—H5N1

1997年 5月 ,香港首次分离到一种新的Ａ型流感病毒———Ｈ5Ｎ1[1,2 ] ,至该年底共有 18位患者确诊被Ｈ5Ｎ1感染 ,其中 6人死亡[3 ,4 ] 。这是对人类具强毒性的流感病毒新亚型首次被确定。在呼吸系统疾病的病毒中 ,流感病毒因其有抗原性变异而不同于其它病毒 ,特别是它的表面抗原如血凝素 (ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ,ＨＡ)和神经氨酸酶 (ｎｅｕ ｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ,ＮＡ)。主要有两种类型变异 :抗原性漂离(因编码基因点突变的累积导致少量氨基酸改变 )和抗原性转移 (由于不同Ａ型流感病毒亚型的抗原基因的重配引起表面抗原分子广泛的…     

共表达甲型流感病毒M1和HA抗原的重组杆状病毒的构建

为构建同时表达流感病毒M1和HA抗原的重组杆状病毒,采用PCR扩增流感病毒A/PR/8/34株的M1基因和去除信号肽的HA基因,将两基因克隆到杆状病毒转座载体pFastBac Dual的两个启动子下游的多克隆位点,筛选出阳性重组转座载体pFastBac Dual-M1-HA。将其转化含有杆状病毒穿梭载体(Bacmid)的DH10Bac感受态细胞,通过抗生素、蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-M1-HA,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-M1-HA。提取重组病毒基因组,通过PCR鉴定外源基因插入成功。间接免疫荧光和Western-blot检测表明,该重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中成功地表达了M1和HA。应用杆状病毒/昆虫细胞系统成功共表达流感病毒M1和HA抗原,为研究流感病毒VLP的形成机制和开发新型流感疫苗奠定了基础。     

甲型H1N1流感病毒HA蛋白结构和功能研究进展

自2009年3月,甲型H1N1流感疫情相继在包括我国在内的许多国家暴发,对人体健康和社会经济发展造成了严重危害。血凝素（HA）蛋白是重要的病毒表面糖蛋白,主要有3种功能：①与宿主细胞表面受体结合;②引起病毒包膜与靶细胞间的膜融合;③刺激机体产生中和性抗体。本文综合了近年来的研究成果,对甲型H1N1流感病毒HA蛋白结构、主要功能、进化、抗原性的研究进展进行了综述。     

辽宁省2016‒2017年H3N2亚型流感病毒HA1基因特征分析

目的 了解2016‒2017年辽宁省H3N2亚型流感病毒基因变异情况及流行株与疫苗株的匹配情况。方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对分离得到的H3N2亚型流感毒株的HA1基因进行扩增,扩增片段经测序与近年来WHO推荐的北半球疫苗株进行比对和基因特征分析。结果 进化分析表明,2016‒2017年H3N2亚型流感病毒与近三年的疫苗株均不在同一分支上;基因特性分析中,所有病毒均在A、B抗原决定簇上发生了两处以上的变异;19株病毒的受体结合位点131位氨基酸发生了新的变异;20株病毒中有1株突变产生了新的半胱氨酸,提示可能有新的二硫键产生;糖基化位点并未检测到新的突变。结论 2016‒2017年辽宁省H3N2亚型流感病毒的抗原性及基因特性均发生了一定的变化,但变异程度不大,应密切关注疫苗株对流感病毒的免疫效果及流感毒株的变异情况。     

2008～2009年珠海市H3N2亚型流感病毒HA1基因特性分析

为了解2008~2009年珠海市H3N2亚型流感病毒HA1基因变异情况,选择珠海市2008~2009年期间不同时间点的经狗肾传代细胞(MDCK)培养分离的H3N2亚型流感毒株20株,提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增HA1基因片段,将产物纯化并测序,推导氨基酸序列,进行基因进化特性分析。与同时期的疫苗株比较,2008年珠海市流行的H3N2亚型流感毒株HA1区抗原决定簇的氨基酸位点变异数少于4个;2009年珠海市流行的H3N2亚型流感毒株除09-0056外,HA1区存在5个位于抗原决定簇内的变异氨基酸位点。2008年H3N2亚型流感毒株的HA1区的糖基化位点与疫苗株一致;2009年H3N2亚型流感毒株HA1区丢失第144位糖基化位点。2008~2009年H3N2亚型流感毒株RBS氨基酸序列未见明显变异。与2008年H3N2亚型流感毒株比较,2009年H3N2亚型流感毒株HA1区抗原决定簇内存在多个位点的氨基酸替换。这些说明2008年珠海市流行的H3N2亚型流感病毒不是新变种;2009年流行的H3N2亚型流感病毒为新的变异株,这可能是H3N2亚型流感病毒在2009年6-9月为珠海地区季节性流感流行优势株的原因。     

云南省2009～2014年甲型H1N1流感病毒HA及NA基因特征分析

了解云南省2009~2014年甲型H1N1流感病毒的流行趋势,研究HA和NA基因进化特征。对云南省近6年来上报的流感监测病例数据进行病原谱总结,挑选出23株甲型H1N1流感毒株进行HA及NA基因分析。利用MEGA 5.0软件对测序结果构建进化树分析基因同源性。2009~2014年云南省共监测到4次甲型H1N1流感流行高峰,核酸检测结果中甲型H1N1流感占检出总量的28.8%。测序结果显示,HA与NA基因均分为3个类群,检测到一株具有H275Y突变位点的毒株。甲型H1N1流感是导致本省流感流行的重要亚型之一,2009~2014年间分离的毒株主要有Goup1、Gourp7和Gourp6三个支系,绝大部分甲型H1N1流感毒株仍对神经氨酸酶抑制剂敏感。     

H5N1亚型禽流感病毒进化的研究进展

由H5N1流感病毒引起的高致病性禽流感,在禽类之间广泛传播。当人类接触这些禽类时,可能会被感染并产生严重的呼吸道症状,且死亡率高达60%。血凝素(hemagglutinin,HA)是H5N1病毒中和抗体的主要抗原,为了便于对病毒的HA突变进行研究,根据HA遗传基因的差异远近,所有的H5病毒株都被划分在20个分支内。对于H5N1病毒进化的研究在禽流感疫苗的研制、禽流感大流行的预防等方面均具有重要意义。现对禽流感、H5N1病毒特征、血凝素的结构功能、H5N1病毒的分支以及病毒进化的研究进行概述。     

The variable codons of H5N1 avian influenza A virus haemagglutinin genes

We investigated the selection pressures on the haemagglutinin genes of H5N1 avian influenza viruses using fixed effects likelihood models. We found evidence of positive selection in the sequences from isolates from 1997 to 2007, except viruses from 2000. The haemagglutinin sequences of viruses from southeast Asia, Hong Kong and mainland China were the most polymorphic and had similar nonsyn-onymous profiles. Some sites were positively selected in viruses from most regions and a few of these sites displayed different amino acid patterns. Selection appeared to produce different outcomes in vi-ruses from Europe, Africa and Russia and from different host types. One position was found to be positively selected for human isolates only. Although the functions of some positively selected posi-tions are unknown, our analysis provided evidence of different temporal, spatial and host adaptations for H5N1 avian influenza viruses.     

H1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及其应用

为建立H1亚型猪流感病毒抗体检测方法,扩增了H1N1亚型猪流感病毒流行株的血凝素基因HA1部分,构建原核表达载体pET30a-HA1,并转化大肠杆菌BL21表达重组蛋白。对重组蛋白包涵体进行变性、复性和Ni-NTA亲和层析纯化。以纯化后的蛋白作包被抗原,建立间接ELISA检测方法。利用该检测方法检测了2008?2009年采集的猪血清785份,阳性率为15.54％,不同省份的阳性率存在差异 (8％~47％)。以IDEXX相关试剂盒检测结果作为参照,该方法的诊断特异性达到91％,诊断敏感性达到95％。     

H5N1禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达及生物活性鉴定

经RT-PCR扩增了H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因(HA)片断,限制性内切酶酶切后将其克隆到pFastBacHTA杆状病毒转座载体,经酶切鉴定及测序,筛选出阳性重组转座载体pFastBac-H5。将pFastBacH5转化含有杆状病毒穿梭载体（bacmid）的DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-H5。rBacmid-H5在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,SDS－PAGE蛋白电泳、Western blot、血凝试验和血凝抑制试验分析表明：分子量约63Kd重组血凝素蛋白（rH5）在sf9昆虫细胞中实现了高效表达。rH5具有血凝活性,而且其血凝活性能够被H5N1禽流感病毒高免血清所抑制;rH5免疫鸡诱导产生针对H5N1禽流感病毒亚型特异的血凝抑制抗体,说明表达的重组蛋白具有与天然蛋白相似的生物活性。     

Highly pathogenic H5N1 influenza virus causes coagulopathy in chickens

Severe hemorrhage at multiple organs is frequently observed in chickens infected with highly pathogenic avian influenza (HPAI) A viruses. In this study we examined whether HPAI virus infection leads to coagulation disorder in chickens. Pathological examinations showed that the fibrin thrombi were formed in arterioles at the lung, associated with the viral antigens in endothelial cells of chickens infected intravenously with HPAI virus. Hematological analyses of peripheral blood collected from the chickens revealed that coagulopathy was initiated at early stage of infection when viral antigens were detected only in the endothelial cells and monocytes/macrophages. Furthermore, gene expression of the tissue factor, the main initiator of blood coagulation, was upregulated in the spleen, lung, and brain of HPAI virus-infected chickens. These results suggest that dysfunction of endothelial cells and monocytes/macrophages upon HPAI virus infection may induce hemostasis abnormalities represented by the excessive blood coagulation and consumptive coagulopathy in chickens.     

不同免疫状态的小鼠对禽流感病毒H5N1感染的敏感性及其机制探讨

目的 比较不同免疫状态的小鼠对禽流感病毒的易感性,并探讨可能的原因.方法 四种免疫状态的小鼠,无菌BALB/c小鼠,SPF级BALB/c小鼠,SCID小鼠和nude小鼠,以10TCID50的禽流感病毒50μL感染小鼠,观察小鼠的体重变化,存活率,各组织脏器的病毒分布,肺组织的细胞因子变化和肺组织病理病变.结果 四种小鼠均能感染禽流感病毒,其中,无菌小鼠对禽流感病毒H5N1的易感性最低,存活率最高.并且病毒在无菌鼠体内病毒的复制水平最低,细胞因子TNF-α,IL-12,MIP2,GATA3,IFN-a/β在感染后表达水平最低,其中第7天最低.结论 无菌小鼠能感染禽流感病毒,但是相比较SPF级BALB/c小鼠,SCID小鼠和nude小鼠,其易感性最低,可能与病毒在组织内的低复制和细胞因子的低表达均有关.     

Molecular genetic characterization of H5N1 influenza virus strains isolated from poultry in the Kurgan region in 2005

In the second half of 2005, a large-scale outbreak of influenza in poultry and wild birds was caused by a highly pathogenic H5N1 influenza virus in Russia. The level of pathogenicity is a polygenic trait, and most individual genes contribute to the influenza A virus pathogenicity in birds, animals, and humans. The full-length nucleotide sequences were determined for H5N1 strains isolated in the Kurgan region (Western Siberia). The structure of viral proteins was analyzed using the deduced amino acid sequences. The receptor-binding site of hemagglutinin (HA) in strains A/chicken/Kurgan/05/2005 and A/duck/Kurgan/08/2005 was typical for avian influenza viruses and contained Glu and Gly at positions 226 and 228, respectively. The structure of the basic amino acid cluster located within the HA cleavage site was identical in all isolates: QGERRRKKR. According to the neuraminidase structure, all H5N1 isolates from the Kurgan region were assigned to the Z genotype. Amino acid residues typical for the avian influenza virus were revealed in 30 out of 32 positions of M1, M2, NP, PA, and PB2, determining the host range specificity. One of the strains contained Lys at position 627 of PB2. Isolates from the Kurgan region were shown to have a remantadine-sensitive genotype. Both strains contained Glu at position 92 of NS1, indicating that the virus is interferon-resistant. Phylogenetic analysis related the Kurgan isolates to subclade 2 of clade 2 of highly pathogenic H5N1 influenza viruses.