人轮病毒的细胞培养分离及其血清型的鉴定

<正>本轮报导从73份轮状病毒阳性粪便中,用MA-104细胞或非洲绿猴(AGMK)原代细胞培养方法分离到39株人轮状球毒。用噬斑抑制试验和中和试验法鉴定结果可分为4个血清型,其中3个型别以前已报导过。 病毒分离方法,取10％粪便悬液,先经10μg/ml胰酶处理37℃1小时,接种细胞后吸附37℃1小时,洗一次,加入含0.5μg/ml胰酶的MEM,其中含DEAE-dext-     

人轮状病毒命名法

<正>人轮状病毒发现后不久,即已查明在病毒颗粒内衣壳层中具有所有轮状病毒共同的“群”特异性抗原。1978年比利时布鲁塞尔Zissis等和英国伯明翰Felwett等首次报导了轮状病毒的不同血清型。布鲁塞尔报告中中最初采用的是补体结合试验和免疫电镜法,后来美国比塞大Yokan和布鲁塞尔Zissis用ELISA法来鉴别。在英国伯明翰的报导中用免疫荧光灶中和试验法(NIFF)测出血清能中和细胞培养中人粪便轮状病毒的感染能力。     

人H组轮状病毒免疫荧光检测方法的建立

轮状病毒(Rotavirus,RV)是引起婴幼儿病毒性胃肠炎的主要病原体。目前,尚没有人H组轮状病毒(Rotavirus H,RVH)的免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测方法。本研究建立了检测人H组轮状病毒的免疫荧光方法,为研究轮状病毒感染以及与宿主免疫反应之间的作用机制提供技术支撑。本研究首先培养MA104恒河猴肾细胞,感染人H组轮状病毒J19毒株,对病毒进行培养;原核表达纯化病毒VP6蛋白,用纯化的VP6蛋白制备antiVP6抗体;以anti-VP6作为检测抗体,应用免疫荧光检测技术检测J19病毒在MA104细胞中的定位;并利用免疫荧光方法检测J19病毒的荧光灶形成单位(Fluorescence focus units,FFU),对病毒进行定量。本方法为进一步检测和研究人H组轮状病毒感染机制提供技术条件。     

人胎肾和人胎肺细胞对肠道病毒的易感性

猴肾细咆和人羊膜细胞虽然对大多数类型的肠道病毒易感,但由于猴肾细胞来源有限和人羊膜细胞制备的成功率较低,昕以需要寻求其他更合适的细胞来代替。为了确定人胎肾和人胎啼细胞在肠道病毒工作中的使用价值,本文较系统地比较了这两种细胞对晒遒病毒的易感性。实验证明,除了Co～ckie B2和H4型病毒,ECHO 9、18、20和2 7型病毒在人胎肾细胞及ECHO、22和23型病毒在人胎肺细胞的滴度不够理想外,这两种细胞对所研究的其余类型的病毒都较易感。大多数类型的肠道病毒不但能在人胎肾和人胎肺细胞中培养和传代,而且原有皿凝者仍能保持其血凝特性。用猴肾、人胎肾和人胎肺细胞从122份粪便标本分离病毒,结果共有64份标本阳性。其中用猴肾细胞分离得到阳性结果的有;4份,用人胎肾细胞有56份,用人胎肺细胞有51份。猴肾细胞对脊髓灰质炎病毒比人胎肾和人胎肺细胞易感,而人胎肾和人胎肺细胞对某些非脊髓灰质炎病毒比猴肾细胞易感。实验结果表明,在肠道病毒的工作中可以应用这两种细胞培养来代替猴肾细胞培养。     

猪和牛轮状病毒的分离和鉴定

我国对动物轮状病毒的研究报道尚少。用细胞培养法分离轮状病毒又比较困难。本文报道用非洲罗猴胎肾细胞MA-104,结合胰酶处理及旋转培养技术,从北京地区腹泻仔猪和犊牛的粪便中成功地分离到6株猪轮状病毒(暂名为PRV1,PRV2,PRV8,PRY11,PRV15和PRV17)和4株牛轮状病毒(暂名为BRV6555,BRV6551,BRV6571和BRV6576)及其初步鉴定结果。     

五、轮状病毒的细胞培养

<正>近10年来发现的与人急性胃肠炎有关的病毒的共同特征之一就是难于在细胞培养或器官培养中生长。这些病毒包括轮状病毒、副轮状病毒、Norwalk病毒群、腺病毒、冠状病毒及其它小圆病毒如星状病毒、萼状病毒等。ECHO病毒和Coxsackie病毒虽较容易分离培养,但它们与急性腹泻关系不大。因此,细胞培养法在腹泻病毒研究方面没有发挥更大的作用。腹泻病毒的分类鉴定主要是靠电镜法。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒感染的细胞培养系统的建立

目的:建立稳定的HSV-1感染的细胞培养系统,为HSV-1感染性皮肤病的基础及临床研究提供稳定的平台。方法:以猴肾细胞(Vero)为繁殖细胞,选择人鼻咽癌上皮细胞(Hep-2)为靶细胞,观察HSV-1在Hep-2株中的致细胞病变效应(CPE)。结果:HSV-1在Vero细胞中能稳定、大量地繁殖;HSV-1感染Hep-2细胞后可出现明显的细胞病变;结论:以Vero为繁殖细胞,Hep-2为靶细胞的稳定的细胞培养系统可作为HSV-1感染性皮肤病的基础及临床研究的平台。     

Sabin2型脊髓灰质炎病毒适应人胚肺二倍体细胞不同代次病毒滴度与5′端非编码区变异关系

脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)是一类无包膜单股正链RNA病毒,基因组长约7．5kb。其5′端非编码区由约742个核苷酸长,主要与病毒RNA复制、蛋白翻译起始、病毒颗粒的装配及病毒的细胞适应减毒及神经毒力密切相关。我们研究发现,脊髓灰质炎病毒(Sabin株)在人胚肺二倍体细胞(KME17)上致细胞病变较猴肾细胞慢,病毒产量亦明显低于恒河猴肾细胞培养,国内外也有类似的报道。     

细胞基质流感疫苗的研究

流行性感冒(influenza,简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,疫苗接种仍是最有效的防御措施之一。传统制备人用流感疫苗是使用鸡胚,但由于其生产周期长、操作繁琐等缺点,研究人员积极研发了细胞培养生产流感疫苗,以达到省时、高效的目的。目前,犬肾细胞(madin-darby canine kidney cells, MDCK)、非洲绿猴肾细胞(Vero)和人胚胎成视网膜细胞(PER.C6)已获得药物监管机构的许可,并应用于临床研究。现就鸡胚及三种细胞培养生产的流感疫苗作一简要概述。     

精制甲型肝炎灭活疫苗的狨猴保护实验

目的　检测精制甲型肝炎 (甲肝 )灭活疫苗的保护效果。方法　甲型肝炎病毒 (YN5株 )经Vero细胞培养制成精制甲肝灭活疫苗 ,采用普通狨猴进行疫苗的免疫原性和保护性研究。结果　 7只狨猴均有特异性抗体产生 ,无血清酶活性升高和肝组织学病理改变 ,接种疫苗的狨猴能抵抗甲肝病毒强毒 (Han ZD)株的攻击。但是 ,对照组狨猴均出现血清酶异常升高和肝组织学病理改变。结论　甲肝灭活疫苗 (YN5株 )具有良好的免疫原性和保护效果。     

猴B病毒PCR检测方法的建立

目的　建立检测猴血B病毒的PCR方法。方法　根据MakotoH报道的引物 ,用PCR方法直接扩增猴血B病毒及扩增经Vero细胞培养后的猴血B病毒 ,扩增产物连于pGEM T载体。结果　这四对引物可同时对猴血B病毒及经Vero细胞培养后的猴血B病毒进行扩增 ,扩增结果一致 ,对扩增片段克隆测序的结果证实 ,其与美国猴B病毒E2 4 90株同源性为 10 0 %。结论　建立了从血样中直接检测猴B病毒DNA的PCR方法。     

人C群轮状病毒全基因组鉴定:VP3基因的两个谱系的鉴别

<正>C群轮状病毒是分布在全世界的人畜共患感染的肠道病原体。然而,到目前为止可用的轮状病毒全基因组序列仅为人株(Bristol)和猪株(Cowden)。为了研究人C群轮状病毒的基因多样性,我们对近来印度(v508)、孟加拉国(BS347)、中国(Wu82和     

基于线粒体控制区序列的猕猴属系统发育研究

通过线粒体部分控制区DNA序列数据探讨7种猕猴属物种的分子系统发育关系。结果表明熊猴的核苷酸多样度最高,而藏酋猴核苷酸多样度较低。基于控制区序列数据所构建的最大似然树,不考虑食蟹猴的位置,7种猕猴物种可粗略地分为3个种组,即狮尾猴组(包括北平顶猴)、头巾猴组(包括红面猴、熊猴和藏酋猴)和食蟹猴组(包括恒河猴和台湾猴)。与前人(Fooden＆Lanyon,1989;Tosi et al,2003a;Deinard＆Smith,2001;Evans et al,1999;Hayasaka et al,1996;Morales＆Melnick,1998)的结果不同,我们的结果支持食蟹猴比北平顶猴分化早的假设;东部恒河猴(相对于台湾猴)和东部熊猴(相对于藏酋猴)出现并系。与Y染色体、等位酶、核基因以及部分形态学数据推测的结果(Delson,1980;Fooden＆Lanyon。1989;Fooden,1990;Tosi et al,2000,2003a,b;Deinard＆Smith,2001)一致,红面猴应归于头巾猴组,但此结论与前人(Hayasaka et al,1996;Morales＆Melnick,1998;Tosi et al,2003a)依据线粒体得到的结果有较大分歧。     

轮状病毒LH9株在Vero细胞中的培养条件优化研究

为优化轮状病毒株在Vero细胞上的培养条件,将轮状病毒基因重配株LH9按0.1MOI分别接种于不同规格的细胞培养瓶(100ml、2000ml、3L、15L)。病毒接种采用吸附与未吸附两种方式、病毒收获采取低温冻融后离心与直接离心两种方法,观察分析对病毒滴度的影响。实验中,用CASY细胞计数仪分析活细胞率,病毒接种后逐日观察细胞病变(CPE)并取样,采用细胞半数感染量测定病毒滴度。结果表明,使用不同规格细胞培养瓶经吸附法培养接种、低温破碎法收获的LH9株病毒滴度高,其中以15L立瓶培养滴度最高(6.0～7.0 logCCID50/ml)。     

轮状病毒酶联免疫吸附试验

<正>用电镜技术可以对轮状病毒感染进行快速有效的诊断,但这种技术需要有一台电子显微镜,需要有技术熟练的人员掌握使用电镜并对电镜图象能正确地辩认和解释,另外,只有当病毒颗粒完整可辩时,才能用电镜得到诊断结果。 由于上述限制,人们就想到寻找一些不需要电镜的新方法来诊断轮状病毒,其中大多数都是免疫学方法,因为实验室已经可以用实验动物来制备特异性抗轮状病毒的抗体。虽然人轮状病毒与动物轮状病毒在抗原性上有明显差别,但目前所有已知轮状病毒都具有一种共同特异性的群抗原(group antigen)。用一种轮状病毒毒株制备的免疫血清     

轮状病毒生物学性状的研究

对最常应用的3个轮状病毒(RV)标准株(人的Wa株,牛的NCDV株,猴的SA_(11)株)进行了形态学、培养特性及理化性质的比较观察与检测。它们在MA_(104)细胞上的培养特性基本相同,在电镜下呈现RV特有的形态结构,RNA电泳图具有典型的电泳带分布模式4、2、3、2规律,各项理化性质亦与文献报道一致。表明RV的细胞适应株的生物学性状有相当高的稳定性。     

中国河北省卢龙县儿童轮状病毒腹泻研究

轮状病毒是我国儿童重症腹泻的主要病原。按照WHO轮状病毒监测方案,于1999年7月至2003年6月,在河北省卢龙县开展了医院和社区为基础<5岁儿童轮状病毒腹泻的监测。结果表明:卢龙县<5岁儿童腹泻的发病率为1 3次/人/年。4年中全县共有2350名<5岁急性腹泻患儿住院,占所有住院儿童的38%(2350/6213)。住院的腹泻患儿每年有两个高峰,一个是夏季(6～8月),占全年腹泻住院病例的22%;另一个在冬季(12月至次年2月),占58%。住院的轮状病毒腹泻只有一个高峰,是在冬季(12月至次年2月),高峰期的轮状病毒腹泻住院患儿数占全年轮状病毒腹泻患儿住院数的86%。按全年统计,轮状病毒腹泻占住院腹泻患儿的46%,轮状病毒腹泻的住院率为11/1000儿童/年。在门诊腹泻患儿中轮状病毒腹泻患儿占28%,在社区腹泻患儿中轮状病毒腹泻占10%。轮状病毒毒株的分布,G3型(45%)最常见,其次为G1型(35%)、G2型(8%)、G4型(3%)、G9型(0 6%),混合感染较少(1%)。还有8%的毒株未能分出型别。在轮状病毒腹泻患者中,9～11月龄的儿童检出率最高(53%),其次是12～17月龄(51%)、18～23月龄(36%)和6～8月龄(30%)。在4年研究期间共有5～10名1～59月龄儿童可能因为轮状病毒腹泻死亡,其中有1例确诊为P[8]G1型毒株感染。初步估计,该县1～59月龄儿童轮状病毒腹泻的死     

恒河猴大脑皮质星形胶质细胞的原代培养及鉴定

为建立有效纯度高的恒河猴星形胶质细胞体外培养体系,无菌条件下取6月龄恒河猴婴猴的大脑皮质,除去白质,充分剪碎后机械吹打制成细胞悬液接种培养,待原代培养的细胞长满培养皿后,通过恒温摇床振荡和传代差速贴壁除去寡突胶质细胞、成纤维细胞等,得到纯化后的星形胶质细胞,并用GFAP-FITC(glial fibrillary acidic protein-fluorescein isothiocyanate)免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。分离培养的细胞具备典型的星形胶质细胞形态,并表达星形胶质细胞特异性抗原GFAP(glial fibrillary acidic protein),纯化后获得了高纯度的恒河猴星形胶质细胞。采用该培养方法成功建立原代恒河猴星形胶质细胞培养体系,为体外研究嗜神经性病毒、神经系统疾病及其相关中枢神经病理机制等提供了可靠的细胞模型。     

在我国患急性腹泻成人中发现一种新轮状病毒

从3例急性成人腹泻患者粪便中,经电镜观察,成人腹泻轮状病毒—酶联免疫吸附试验(ADRV-ELISA)、普通轮状病毒—酶联免疫吸附试验(Rota-ELISA),猪抗C型(组)轮状病毒和鸡抗D型(组)轮状病毒血清分别与本病毒的免疫电镜试验以及RNA电泳等实验结果,发现了一种新轮状病毒,该病毒的形态结构与普通轮状病毒(Rotavirus)、成人腹泻论状病毒(Adult Diarrhoea Rotavirus,简称ADRV)极为相似,但抗原性与普通轮状病毒(A组),成人腹泻轮状病毒(B组),C型轮状病毒(C组),D型轮状病毒(D组)显然无关。基因分析表明,该病毒基因组由11个双链RNA片段组成,但其RNA电泳图型具有独自的特点,与目前公认的A组、B组、C组、D组论状病毒韵RNA电泳图型均不同,免疫电镜证实,该病毒能被人恢复期血清所凝集,表明该病毒可能是腹泻病人的病因。     

红茶,青茶,黑茶抗人轮状病毒的实验研究

采用病变抑制法在细胞培养上测定了红茶、青茶、黑茶对人轮状病毒的抑制作用。试验结果表明,红茶和青茶茶汤(2克茶叶用25ml沸水浸泡)在1:1000的稀释浓度时,可以完全抑制病毒,而黑茶茶汤在1:100时才能完全抑制病毒。试验结果还表明,茶汤在高浓度时具有细胞毒作用。