水稻叶绿体16S启动子克隆改造、载体构建及转化研究

利用PCR方法从水稻叶绿体基因组DNA中分离16S启动子,并在其下游加入rbcL基因SD序列,以增强该启动子的翻译能力;序列分析表明,除加入的SD序列外,扩增片段与水稻(Oryza sativa)叶绿体基因组DNA序列16S启动子相应区域同源性为100％。将16S启动子与bar基因和gfp基因的融合基因连接,以psbA基因的3′序列为终止子,并以烟草叶绿体trnH—psbA和trnK为同源片段构建了烟草叶绿体表达载体pRl6S。用基因枪转化烟草,转化植株经Southern、Northern检测及后代遗传学分析,发现：16S启动子具有启动活性,融合基因已在烟草叶绿体中稳定整合并遵循母系遗传规律。     

水稻叶绿体转化载体pBS的构建及融合基因功能的初步鉴定

利用PCR方法分别从载体pchN-CAT-Bar和Psk51中分离得到编码膦丝菌素乙酰转移酶基因bar和绿色荧光蛋白基因sgfp,并在bar基因前段连接T7 leader sequence/5′-UTR和T7 10 N-terminus的8个氨基酸序列.运用融合PCR技术,得到bar和sgfp的融合基因片段BS.以水稻叶绿体基因组中的trnI和trnA为同源重组片段,来自烟草叶绿体16S rRNA的Prrn为启动子,psbA基因的TpsbA为终止子,融合片段作为双效筛选标记,构建水稻叶绿体转化载体pBS.大肠杆菌原核表达检测到明显荧光,基因枪轰击TP309愈伤,筛选抗性愈伤.     

水稻 Rubisco 小亚基启动子的克隆及光诱导表达载体的构建

高效特异表达的启动子往往是转基因研究的关键因素。Rubisco小亚基启动子具有光诱导性、组织特异性和高表达的特性,可利用该启动子为转基因研究服务。本文以水稻(Oryza sativa)中花11叶片为材料,根据GenBank所报道的水稻Rubisco小亚基启动子序列,设计特异引物从水稻基因组DNA中扩增得到长度约1600bp的DNA片段,将该片段连接至T载体pMD18-TSimple,测序结果表明该片段序列与GenBank报道序列一致为100%。Plant CARE序列分析表明,该启动子具有12个与光诱导表达相关的元件。为构建光诱导表达载体,将该启动子和植物表达载体pCactF分别以KpnⅠ和XbaⅠ酶切后连接。光诱导表达载体的构建为进一步研究基因功能及利用光诱导表达载体改良作物品质奠定基础。     

油菜叶绿体16S rRNA基因前导顺序的一级结构

质粒pBN119的3.2kb BamHI片段的PvuⅡ-BglⅡ片段全顺序长为840bp,其中含油菜叶绿体16S rRNA基因5′端的140bp。通过寻找GTTC顺序,发现在395至468位核苷酸之间是tRNA~(Val)基因;在73至118位核苷酸之间是一个蛋白阅读框。和已发表的玉米叶绿体16S rRNA前导顺序进行比较,同样存在三个相应的大肠杆菌RNA聚合酶的结合位点。和大肠杆菌的启动子及相应基因作比较,表明叶绿体基因组具有很明显的原核性,但其tRNA~(Val)基因没有CCA3′顺序。在16S rRNA基因、tRNA~(Val)基因及蛋白阅读框的5′端附近均能找到一个比较稳定的茎环结构。我们推测这些茎环结构可能和位于反问重复顺序上的某些基因的转录调节有关。     

基于叶绿体16S rRNA的绿色裸藻类系统发育及性状进化研究

该研究基于叶绿体16S rRNA基因序列,构建绿色裸藻类的系统发育树,并对绿色裸藻类植物8个形态性状进行祖先重建分析,以明确绿色裸藻类植物的系统演化关系,为研究该类植物的起源提供理论依据。结果表明：(1)贝叶斯法构建的绿色裸藻类系统发育树显示,双鞭藻属与拟双鞭藻属互为姐妹群,扁裸藻属、鳞孔藻属和盘裸藻属亲缘关系较近,而囊裸藻属和陀螺藻属亲缘关系较近,裸藻属、隐裸藻属、柄裸藻属和旋形藻属亲缘关系较近,表明裸藻属不是一个单系类群。(2)基于形态性状的祖先重建结果显示,绿色裸藻类相对原始的7个性状包括：表质柔软易变形,出现螺旋形线纹,细胞后端渐尖或尖尾刺状,无囊壳,叶绿体为片状、盾状或大盘状,具无鞘蛋白核,副淀粉粒为小颗粒状且数量不定,而鞭毛长度不能推断可能的祖先状态。(3)综合8种性状祖先重建结果发现,裸藻属和眼裸藻属植物具有所有原始性状,可能是最先出现的绿色裸藻类的祖先。     

Bt基因甜菜叶绿体转化载体构建及毒蛋白表达

利用植物叶绿体基因组在进化中高度保守的特点,根据烟草、菠菜、水稻叶绿体基因组全序列资料设计合成引物,PCR扩增并克隆了甜菜叶绿体两个重要功能基因rbcL和atpB(GenBank登录号分别为DQ067450和DQ067451),并以其作为定点整合外源基因的同源重组片段,构建了Bt基因CryIAc甜菜叶绿体定点转化载体pSKARBt,酶切鉴定表明:所构建载体符合预期设计。对克隆菌菌体总蛋白进行了生物杀虫试验,结果表明:Bt基因CryIAc能够在叶绿体特异性启动子及终止子的调控下表达,并对二龄末甘蓝夜蛾有很强的毒杀作用。该载体构建对培育甜菜高抗虫品种具有重要应用价值。叶绿体转化及后续工作正在进行中。     

LRP16基因启动子克隆及特征分析

克隆LRP16基因启动子分子,并对启动子特征进行分析,预测启动子区调控元件,为深入研究LRP16基因的表达调控机制奠定基础。在NCBI的人类基因组数据库中截取并下载LRP16基因转录起始位点5′侧翼区2.7kb的基因组序列,设计PCR引物,从健康外周血单个核细胞中扩增,利用Genomatix程序对5′侧翼区近1000bp进行启动子特征分析,获得了与GenBank序列一致,长度为2.7kb的LRP16基因启动子DNA序列,该序列具有典型的真核生物RNA聚合酶Ⅱ启动子特征及多个核受体结合位点,如α视黄酸受体及RAR相关孤生受体。     

水稻Xa1基因启动子的克隆及功能分析

Xa1是一个能对日本白叶枯病优势小种(小种1号)产生专化性抗性的R基因,虽已有该基因克隆、表达和功能方面的研究,但对其表达调控分子机制还不很清楚。本研究利用Xa1启动子与GUS报告基因的转基因T1株系,研究了Xa1启动子的时空表达及对不同外源激素的应答特征。结果表明,Xa1启动子驱动的GUS基因在水稻根中的表达量明显高于茎和叶,且在根部的中柱区GUS的表达量明显高于周围组织;在外源MeJA作用下GUS的表达显著增强,在SA和ABA处理下也有一定程度的增强,这些结果暗示Xa1的抗病作用与其在根系中柱的组织特异性表达存在一定的相关性,MeJA对Xa1启动子的活性起重要的调控作用。     

玉米逆境诱导型启动子克隆及其植物表达载体构建

设计特异引物,利用PCR方法从玉米(Zea mays)基因组DNA中克隆低温和盐相应蛋白(low temperature andsalt responsive protein,LS)基因上游1 735 bp,命名为Lsp。利用在线启动子预测工具PlantCARE分析表明,序列中含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,还包含各种胁迫响应元件。以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将克隆得到的启动子片段与GUS报告基因融合构建了重组表达载体pCAM-Lsp,并用反复冻融法将其导入农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法转化烟草,GUS组织化学染色显示出Lsp驱动GUS基因表达。结果表明,该Lsp启动子片段具备一定的启动活性,为探明玉米逆境胁迫启动子表达调控序列及其调控机制的研究奠定基础。     

两个水稻胚乳启动子的克隆及表达分析

启动子的克隆对基因表达及基因工程研究有重要意义。根据数据库中EST丰度,从水稻中克隆了两个预测在水稻胚乳中高效表达的启动子Os772和Os359,并将启动子片段与GUS报告基因融合,构建了重组表达载体。通过农杆菌介导方法将其导入水稻愈伤组织细胞。转基因水稻经GUS组织化学分析显示,Os772和Os359能启动GUS基因在水稻胚乳中表达但不能在根、茎、叶和花中表达。该结果表明Os772和Os359为两个水稻胚乳特异性启动子。     

用于叶绿体遗传转化的表达载体

叶绿体遗传转化是植物基因工程的新方向。本文简要介绍用于叶绿体遗传转化的表达载体的构建方法,涉及同源重组片段、叶绿体特异的启动子和终止子、筛选标记基因,以及目前在叶绿体中已实现表达的外源基因等内容。 Abstract:Chloroplast genetic transformation is a new way of plant genetic engineering.This paper reviews the construction methods of expression vector used in chloroplast genetic transformation.It contains the homologous recombinant fragments,the chloroplast specific promoter and terminater,the selectable marker genes and the interest genes whose expression in chloroplast have been achieved.     

含35S启动子的粟酒裂殖酵母表达载体的构建及功能鉴定

利用PCR技术从植物表达载体pBI121上先后克隆出GUS基因和35S-GUS-NOS基因序列,分别构建粟酒裂殖酵母重组表达载体pESP-2-GUS和pESP-2-35S.GUS.NOS,并将它们转化到粟酒裂殖酵母菌体中.通过对不同液体培养基中两种转化子的不同启动子启动GUS基因表达产物的GUS染色分析与比较,证明连入的35S启动子能够替代pESP-2自身受维生素B1浓度调控的启动子,从而降低了培养基的成本,为今后工业上利用粟酒裂殖酵母发酵生产产品,提高经济效益,奠定了基础.     

甘薯叶绿体表达载体构建及其融合基因在叶绿体中的瞬间表达

利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计引物,从甘薯(Ipomoea batatas)叶绿体基因组中克隆了2个相邻的功能基因rbcL(GenBank登录号为AY942199)和accD(GenBank登录号为AY942200),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段.以来自叶绿体基因组的强启动子Prrn和RpsbA-pro分别驱动选择标记基因aadA及phaC-gfp融合基因,构建成表达盒prrn-aadA-TpsbA-ter与RpsbA-pro-phaC-gfp-RpsbA-ter,然后将这2个表达盒串联在一起克隆进甘薯叶绿体同源片段中,获得甘薯叶绿体定点整合表达载体pSC-GFP.酶切分析证明,所构建的载体符合预期设计;采用该载体对甘薯叶片进行基因枪转化,结果显示,phaC-gfp融合基因可在叶绿体特异启动子和终止子的调控下在甘薯幼嫩叶片中瞬间表达,证明构建的载体pSC-GFP可用于甘薯叶绿体转化.     

一个水稻高效表达启动子Os252的分离

植物基因的表达受启动子的控制,高效表达启动子的分离及功能分析不仅是植物基因工程研究的重要研究方面,也是表达调控研究的重要内容。根据EST数据克隆了一个预测在水稻茎中高效表达的启动子Os252。将该启动子与GUS基因构建成表达载体并转入水稻。转基因水稻PCR分析表明,GUS基因已经成功地整合进水稻基因组中。GUS组织化学分析表明,Os252能启动GUS基因在水稻叶、茎以及胚乳中表达。进一步GUS酶活性的测定表明,叶和胚乳中Os252启动子活性分别是35S启动子的1.9和2.5倍。由于Os252来自于水稻,在叶和胚乳中活性高于35S启动子,因此该启动子可望用于水稻基因工程研究。     

嗜热脂肪芽孢杆菌启动子克隆载体pFDC4和表达型载体pFDC11的构建

以pPL703的衍生质粒pPGV5为载体,从嗜热脂肪芽孢杆菌CU21总DNA的Sau 3A酶切产物中得到1个0.54kb的启动子片段,它能促进载体上的无启动子的cat-86基因在嗜热脂肪芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌中表达。这一片段以正、反向插入pPGV5载体,都能使重组质粒转化CU21原生质体的效率提高10~(?)至10(?)倍。Southern杂交实验表明,这一启动子片段与Imanaka等报道的来自CU21中的隐蔽性质粒pBS02的能提高转化效率的1.6kb Eco RI片段是同源的。利用所得到的0.54kb Sau 3A片段构建了新的启动子克隆载体pFDC4和表达型载体pFDC11,二者都能以很高的效率转化CU21原生质体。     

玉米叶绿体表达载体的构建及AsRED基因原核表达

从玉米幼嫩叶片中提取玉米叶绿体基因DNA,通过PCR克隆出叶绿体同源重组片段trnA和trnI、叶绿体特异性启动子Prrn以及终止子psbA.构建玉米叶绿体表达载体pBAIRTARED,含有一个人工操纵子,其中,筛选标记基因aadA和红色荧光蛋白报告基因AsRED处于Prrn启动子和psbA终止子控制.将构建的载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,观测到重组细胞呈现红色,表明构建的载体可以用于玉米叶绿体转化以及表达报告基因.