大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR检测方法的建立与应用

目的建立快速检测实验大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR方法。方法根据大鼠冠状病毒N基因、仙台病毒L基因设计特异性引物;经过双重PCR优化,特异性和敏感性的检测,建立双重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染仙台病毒组织DNA样本和实验动物组织样本,并与ELISA方法比对。结果双重PCR扩增出大鼠冠状病毒(168 bp)和仙台病毒(262 bp)目的条带,PCR扩增产物测序结果利用核酸BLAST功能进行同源序列对比,仙台病毒和大鼠冠状病毒同源性分别为100%和99%。仙台病毒和大鼠冠状病毒的检测下限为1.56×10~2 copies/μL。特异性检测对小鼠肝炎病毒扩增,产生片段大小近似大鼠冠状病毒产物。应用建立的双重PCR体系检测人工感染仙台病毒组织DNA样本,30份DNA标本均被检出;检测94份实验动物肺组织样本,结果均阴性。结论建立的双重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对实验动物仙台病毒和大鼠冠状病毒病原体的快速检测。     

仙台病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

目的建立一种快捷、灵敏的检测方法,即反转录-环介导等温扩增方(RT-LAMP)用于仙台病毒(SeV)的检测。方法根据Gen Bank公布的SeV序列(DQ219803.1),在其保守区域设计了六套LAMP引物,利用LAMP Real-Time Turbidimeter LA-320C仪监测反应进程并筛选最佳引物、反应条件,建立对SeV核酸进行特异性扩增的RT-LAMP检测方法,并可通过加入目测荧光检测试剂肉眼判断结果。对所建立的方法进行了敏感性、特异性评估并对92份样品进行了检测。结果该方法在63℃恒温下作用60 min,SeV RNA获得了高效率的特异性扩增,与其余常见小鼠病毒无交叉反应;最低检出量为2.1TCID_(50) SeV,比RT-PCR方法高102倍;肉眼判断结果与RealTime Turbidimeter LA-320仪监测结果一致;通过对92份样品的RT-LAMP,RT-PCR和间接ELISA方法的检测比对,三者符合率为100%。结论建立的SV RT-LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏,操作简单的特点,具有良好的应用前景。     

五种国产与进口小鼠病毒ELISA抗体检测试剂盒的比较研究

目的评价国产小鼠病毒抗体ELISA检测试剂盒。方法选择国产与进口小鼠淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）、肝炎病毒（MHV）、仙台病毒（SV）、腺病毒（MAV）、细小病毒（MPV）ELISA抗体检测试剂盒,进行敏感性、特异性、精密性、稳定性、可信度试验比较。结果国产与进口试剂盒：同种试剂盒之间灵敏度相差最低为2倍,差异显著（P〈0.05）,最高为16倍,差异极显著（P〈0.01）;特异性试验显示每种试剂盒,与其他4种病毒均无交叉反应;精密性试验显示5种试剂盒批内平均变异系数均小于10%;稳定性试验显示5种试剂盒相对偏差均小于25%;分别选择已知36份小鼠血清进行检测,国产和进口LCMV、MHV、SV、MPV符合率均为100%;国产MAV符合率为86.1%,进口MAV符合率均为100%,二者之间差异极显著（P〈0.01）。结论除国产MAV试剂盒敏感性、可信度低于进口外,国产LCMV、MHV、SV、MPV试剂盒与进口同种试剂盒相比,在敏感性、特异性、精密性、稳定性和可信度方面均良好。     

PDCoV、SADS-CoV与SVA三重RT-PCR检测方法的建立与应用

【背景】猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)与塞内卡病毒A型(Seneca virus A,SVA)均为猪的新发病原,严重危害养猪业的发展。猪感染这3种新发病原难以根据临床症状诊断,因此亟须建立多重RT-PCR检测方法对疑似患病猪进行快速诊断,以降低经济损失。【目的】建立能同时检测PDCoV、SADS-CoV和SVA单一或混合感染的三重RT-PCR检测方法。【方法】参考GenBank中登录的PDCoV和SADS-CoV N基因、SVA L/P1基因保守区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(T_m);采用方阵法优化其引物浓度;构建重组质粒PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV和PMD-SVA作为标准品确定最小检测量(limits of detection,LOD);以猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等6种常见感染猪的病毒核酸样本为模板,确定三重RT-PCR法的特异性;以批间和批内实验验证其重复性;经检测疑似感染的临床样本并与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果。【结果】最佳退火温度为58.3℃;引物最佳浓度分别为0.5、0.25和0.25μmol/L;其敏感性高,PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV与PMD-SVA最低检测限分别为1、1和10copies/μL;其特异性强,仅对PDCoV、SADS-CoV和SVA有特异性条带,对其他病毒均无扩增条带;该方法重复性好,批间和批内实验检测结果均一致。经临床样本检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的阳性率分别为65.85%、30.49%和57.32%,与已报道的检测方法一致。最后从13份PDCoV、SADS-CoV和SVA均为阳性的样品中随机选取5份样品进行测序,并做同源性及进化树分析,结果显示5份阳性病料的PCR扩增序列之间相似性较高,而且和参考序列之间也具有较高的相似性,均可达到96%以上。表明本研究建立的方法在应用于临床样品检测中具有较高的准确性和可靠性。【结论】建立了一种能够同时快速检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的三重RT-PCR方法,为临床上检测上述3种病毒提供了技术支撑。     

仙台病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

目的利用原核表达系统表达仙台病毒(Sendai Virus,SV)核衣壳蛋白。方法根据GenBank上发表的仙台病毒(Sendai Virus,SV)核衣壳蛋白基因序列,设计并合成一对引物,通过RT-PCR扩增出核衣壳蛋白全长cDNA序列,将其克隆至原核表达载体pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS,于37℃1mmol/LIPTG条件下诱导表达,大肠杆菌裂解物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约60×103处出现一新蛋白带,与预期目的蛋白分子量相符。结果Western blot检测表明,表达产物能与兔抗SV阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带,表明其具有免疫原性。结论为建立以重组NP蛋白为诊断抗原检测SV奠定基础。     

非洲马瘟病毒群特异性RT-PCR检测方法的研究

非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)为双股RNA病毒,感染所有马科动物.设计2对位于AHSV基因组S7片段的引物,经RT-PCR扩增,证实2对引物对6种血清型的AHSV RNA均有特异性扩增,且能对同属的蓝舌病病毒(BTV)、鹿出血热病毒(EHDV)进行区别诊断.经序列测定及Blast,证实所扩增的条带确为AHSV S7相应位置核苷酸序列,表明已初步建立AHSV群特异性RT-PCR检测方法.     

水体中诺瓦克病毒RT-PCR检测研究

诺瓦克病毒是公认的食源性或水源性非细菌性胃肠炎的主要致病因子之一。建立诺瓦克病毒的RT-PCR检测方法,验证其特异性及灵敏度,并在实验室人工污染水样,进行模拟水样的检测,验证RT-PCR检测方法的实用性。所用引物为RNA多聚酶区的JV12/JV13,多次反复实验,均可产生327bp预期大小的特异条带,并通过杂交进一步证实了其特异性和正确性;在临床粪样中,可达到的最高检测限为50pg/mL。在共42份模拟样品的检测中,经过播毒、富集和浓缩,38份均可检出诺瓦克病毒。其中4份池塘水未检出。在模拟水样中的检测灵敏度为200pg/mL。实验中所建立的试验条件和体系可用于实际水样中诺瓦克病毒的筛选,对水质控制起到了很好的监控作用。     

水体中诺瓦克病毒RT-PCR检测研究

诺瓦克病毒是公认的食源性或水源性非细菌性胃肠炎的主要致病因子之一。建立诺瓦克病毒的RT-PCR检测方法,验证其特异性及灵敏度,并在实验室人工污染水样,进行模拟水样的检测,验证RT-PCR检测方法的实用性。所用引物为RNA多聚酶区的JV12/JV13,多次反复实验,均可产生327bp预期大小的特异条带,并通过杂交进一步证实了其特异性和正确性;在临床粪样中,可达到的最高检测限为50pg/mL。在共42份模拟样品的检测中,经过播毒、富集和浓缩,38份均可检出诺瓦克病毒。其中4份池塘水未检出。在模拟水样中的检测灵敏度为200pg/mL。实验中所建立的试验条件和体系可用于实际水样中诺瓦克病毒的筛选,对水质控制起到了很好的监控作用。     

小鼠仙台病毒TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立

仙台病毒（Sendai virus, SeV）能够引起啮齿类动物呼吸道疾病,引起免疫应答,严重影响SPF级动物模型实验结果,实验动物质量国家标准T/CALAS49-2017也将其作为SPF级大小鼠质量检测必检项目之一。为了开发用于快速检测及日常监测SeV的分子生物学诊断方法,本研究基于TaqMan-MGB探针荧光技术,根据GenBank中SeV的L基因的保守区段（8 556-15 242）序列,设计了1对特异性引物与1条5‵端携带羧基荧光素（FAM）与3‵端为淬灭基团（Eclipse）标记的TaqMan探针,标准品进行稀释建立标准曲线,并经反应条件优化,建立了TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、敏感性与重复性进行评估。结果显示,最佳优化反应条件为：反应体系,20μmol/L;引物和探针浓度,10μmol/L和15μmol/L;退火温度,54℃;在特异性试验中,除SeV检测出现特异性曲线外,其他鼠类常见病毒均未出现特异性曲线;在敏感性试验中,Sev最低检测限为5.29×101拷贝/μL。在重复性试验中,其批内变异系数为0.44%～0.77%,批间变异系数为...     

新型布尼亚病毒抗体检测方法的建立及初步应用简

目的：建立新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法。方法：用基因工程重组表达的新型布尼亚病毒NP抗原包被酶联板,建立间接ELISA法检测新型布尼亚病毒IgG抗体,并进行特异性和灵敏度评价,健康人群中检测结果计算临界值（均值＋3标准差）。检测70例发热伴血小板减少综合征患者恢复血清和69份健康人血清样品。结果：在70份患者血清样品中,检测出新型布尼亚病毒IgG抗体阳性51例,阳性率为72．14％（51/70）;69份健康人血清样品中,检测出1份阳性,特异性为98．6％（1/69）。结论：建立的新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法特异性强、灵敏度高,可用于新型布尼亚病毒感染的检测及流行病学调查。     

小鼠仙台病毒标准化血清的制备及鉴定

目的制备标准化抗小鼠仙台病毒（Sendai Virus,SV）免疫血清,为清洁级及SPF级实验小鼠质量检测提供批量、稳定、敏感的质控血清。方法使用动物来源的仙台病毒（sv）感染BALB／c小鼠,获得高效价免疫血清,经IFA、IEA、ELISA等方法检测血清效价。结果制备多量抗SV血清,经多种方法检定,IFA效价达1：640,IEA效价达1：320,ELISA效价达1：102400～1：204800。结论本研究中制备的sV抗血清达到同批次大量高滴度的水平,可作为检测实验小鼠中sv病原的标准化质控血清。     

灰仓鼠多房棘球蚴腹腔动物模型的建立

目的观察多房棘球蚴(Echinococcus muhilocularis E.m)在灰仓鼠腹腔内的生长发育规律,制作E.m灰仓鼠动物模型。方法 2000个E.m原头节/只剂量腹腔接种灰仓鼠,接种后10、15、18、22、39、60、80和100 d,测量包囊重量和抗体,计算包囊重与灰仓鼠体重的包囊系数,观察多房棘球蚴在灰仓鼠体内的发育规律。分别按100个/只、500个/只和2000个/只剂量腹腔接种灰仓鼠各10只,100 d后剖检比较不同感染剂量的包囊发育情况和感染率。结果 62只灰仓鼠中有59只感染了多房棘球蚴。18 d可观察到成熟原头节,感染率达到100%,15 d出现抗体阳性,60 d时包囊系数达到15%以上;100、500和2000三种剂量的感染率100%;结论建立的灰仓鼠腹腔多房棘球蚴动物模型具有感染率高,感染周期短,包囊生长发育和抗体滴度变化易观察,感染60 d可作为E.m动物模型成模观察期。包囊系数,抗体滴度和包囊发育变化可作为造模的主要参考指标。雌性灰仓鼠造模优于雄性。     

小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型标准化血清制备及ELISA检测方法的建立

目的制备标准化小鼠呼肠孤病毒III型（reovirus 3,Reo-3）免疫血清,建立小鼠Reo-3抗体ELISA检测方法。方法使用动物来源的Reo-3病毒感染BALB/c小鼠,获得高效价免疫血清;以BHK-21细胞制备Reo-3病毒抗原,同时制备做正常对照抗原。滴定抗原和标准化小鼠Reo-3血清的最佳工作浓度,进行特异性、敏感性、重复性、稳定性等实验。结果制备18 mL抗Reo-3血清,经检测,IFA效价达1∶640,IEA效价达1∶160;Reo-3抗原和标准化小鼠Reo-3免疫血清最佳工作浓度分别为5μg/mL和1∶2400;该ELISA检测体系Reo-3特异抗原批内变异系数为3.8%,批间变异系数为4.0%;检测灵敏度〉1∶4400;与仙台病毒（SV）、小鼠肝炎病毒（MHV）、小鼠腺病毒（Mad）、小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）、小鼠多瘤病毒（POLY）均无交叉反应。经37℃破坏性试验,2 d稳定性试验相对偏差〈27%。结论本研究制备的Reo-3抗血清达到同批次大量高滴度的水平,可作为检测实验小鼠Reo-3病原的标准化质控血清。本研究建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。该体系可用于大、小鼠等实验动物Reo-3抗体的检测。     

小鼠脑脊髓炎病毒标准血清制备及间接ELISA检测方法的应用

目的制备小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）标准血清,建立ELISA检测方法,实现一种病毒多种检测方法的比对研究。方法用TMEV感染3周龄SPF级BALB／c小鼠,制备免疫用抗原。分别在0、7、14d以腹腔注射的方式免疫SPF级6-8周龄BALB／c小鼠,免疫血清用IFA、IEA法进行鉴定;TMEV感染BHK-21细胞,制备EHSA抗原,确定酶结合物、抗原和标准阳性血清的最佳工作浓度,建立TMEVEHSA检测方法,进行敏感性、特异性、重复性和稳定性实验。结果制备TMEV免疫血清,以IFA、IEA测定血清效价分别为1：640和1：320,与痘苗病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠肝炎病毒、仙台病毒和呼肠孤病毒-Ⅲ型均无交叉反应;建立了ELISA检测方法,确立了各种试剂的最佳工作浓度,其中酶结合物最佳工作浓度为1：10000,抗原为2.5μg／mL,阳性参考血清为1：200;EHSA检测灵敏度为1：3200。板内特异抗原、正常抗原平均变异系数为4.67％和5.7％,板间为4.39％和7.61％。稳定性实验相对偏差均小于20％。结论本研究制备的TMEV免疫血清可作为血清学检测方法中的标准质控血清;建立的ELISA方法重复性、稳定性好,敏感性和特异性强,可用于小鼠脑脊髓炎病毒血清抗体检测。     

五种主要上呼吸道病毒多重RT-PCR 检测方法的建立

目的:建立甲型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、B型(RSV-A、RSV-B)和腺病毒(ADV)五种主要上呼吸道病毒的多重RT-PCR检测方法。方法:利用Primer premier5.0分别针对甲型流感病毒的M基因、乙型流感病毒的PB1基因、RSV-A和RSV-B的F基因及ADV的hexon基因设计五对特异性引物,对Mg2+、dNTP、引物浓度及退火温度等进行优化,建立同时检测甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B和ADV的多重RT-PCR方法,并验证该检测方法的灵敏性。结果:所建立的五种病毒的多重RT-PCR方法可以同时或者分别扩增甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B及ADV的141bp、635bp、525bp、377b和283bp基因片段,敏感度分别达到770PFU/ml、800PFU/ml、680PFU/ml、970PFU/ml和850PFU/ml,且五种病毒间无交叉反应。结论:所建立的多重RT-PCR方法可以迅速准确地检测甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B和ADV,为五种病毒的检测提供了一种方便易行的方法。     

活疫苗及其生产基质中Sendai病毒RT-PCR检测方法的研究

目的建立检测Sendai病毒的RT-PCR方法并应用于活疫苗及其生产基质中Sendai病毒的检测.方法将Sendai病毒E17株接种9日龄鸡胚尿囊腔,72h后收集尿囊液,用于提取病毒RNA,并逆转录成cDNA,用两对针对Sendai病毒NP基因设计的外引物和内引物分别进行扩增.扩增产物克隆于T-载体,并测序.尿囊液按10倍倍比稀释,进行敏感性实验.将该方法用于检测乙脑减毒活疫苗和用于生产疫苗用的普通级乳地鼠肾中的Sendai病毒.结果外引物和内引物的PCR分别扩增出684bp和248bp的片段,外引物PCR产物的测序结果与Genbank报告的序列完全一致.敏感性实验结果表明,第一次PCR可检测到10-4病毒滴度,巢式PCR可检测到10-7病毒滴度.乙脑减毒活疫苗和乳地鼠肾的检测结果为阴性.结论建立检测Sendai病毒的RT-PCR方法具有很高的特异性和敏感性.     

TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测甲型肝炎减毒活疫苗病毒含量的研究

目的：建立一种快速定量检测甲型肝炎减毒活疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法。方法对Gen-Bank中登陆的甲型肝炎减毒活疫苗株（ L-A-1）和其他甲型肝炎病毒基因组全序列比较分析,根据其高度保守的5′端非编码区设计针对甲型肝炎减毒活疫苗株特异性引物与探针,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏性,并对甲型肝炎减毒活疫苗病毒含量进行定量检测。结果该方法对甲型肝炎减毒活疫苗株高度特异,扩增片段为207 bp,不与其他肠道病毒发生非特异性反应。在104 CCID50/管～10-1 CCID50/管之间有良好的扩增曲线,检测的灵敏度可达0．1CCID50～0．01CCID50,比普通RT-PCR高100倍。结论该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好等优点,可应用于甲型肝炎减毒活疫苗生产过程中病毒含量滴度测定及指导疫苗成品的配制。     

三种麻醉药物对灰仓鼠麻醉效果的分析和选择应用

目的分析氯胺酮、水合氯醛和氨基甲酸乙酯三种不同麻醉药物对灰仓鼠的麻醉效果。方法将60只灰仓鼠（雌雄各半）随机分为6（A1、A2、B1、B2、C1、C2）组,每组10只,分别进行三种麻醉药物的效果测试,行腹腔注射麻醉,观察临床表现和诱导时间及麻醉时间。结果三种麻醉药物依剂量分为6组,分别在2.82±0.46min、3.50±0.47 min、2.14±0.24 min、2.68±0.49 min、3.16±0.16 min、3.67±0.33 min进入麻醉状态,维持时间分别为29.3±3.7 min、17.4±2.7 min、89.4±3.9 min、61.8±3.1 min、487.9±9.5 min、393.1±7.8 min;三种麻醉药物麻醉后,灰仓鼠的直肠体温分别为34.77℃、32.64℃和32.54℃。结论三种麻醉药物对灰仓鼠的腹腔注射麻醉是有效和安全的,在应用中可以根据实验需要选择不同的麻醉药物,为灰仓鼠得到广泛应用奠定基础。     

猴腺病毒（SAdV）PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立SAdV特异的PCR检测方法并研究实验猴群和猴源性生物制品中SAdV感染或污染情况。方法比对分析多株SAdV序列,设计SAdV特异引物,优化PCR实验条件,建立的PCR方法经验证后检测实验猴群和猴源性生物制品,阳性产物测序并构建进化树。结果经特异性和敏感性鉴定,在设计的5对引物中确定一对最佳引物,可以区分SAdV和MAD,ICH,CELO且可以检测到的最小DNA量为47.9 pg/mL。PCR方法检测实验猴群,阳性率49.2%,测序及进化分析表明,SAdV感染型别呈广泛基因多样性。主要分布在G亚属和以SAdV-49为代表的分支。结论经测序验证,PCR检测方法具有很好准确性,初步应用表明我国实验猴群中SAdV高度流行,应加强实验猴群及相关生物制品中SAdV的监测,避免人类感染SAdV的潜在风险。