Baff转基因斑马鱼的构建及相关基因表达检测

通过RT-PCR法由斑马鱼脾脏克隆B细胞刺激因子baff基因,构建过表达斑马鱼baff且携带有绿色荧光标记蛋白的重组质粒pIRES2-GFP-baff;胚胎显微注射获得转基因斑马鱼胚胎;通过GFP荧光标记跟踪并筛选转基因阳性鱼;Western blot法鉴定Baff-GFP融合蛋白表达情况;qPCR检测baff,GFP及baff下游相关基因bcl-2,il-4mR-NA表达情况。结果表明细胞、胚胎及幼鱼baff和GFP均高表达,baff下游基因bcl-2激活和il-4基因抑制表达。通过胚胎显微注射法可成功获得过表达baff的转基因斑马鱼,此研究为建立红斑狼疮转基因斑马鱼模型及高通量筛选Baff拮抗剂奠定了基础。     

人BAFF转基因斑马鱼的构建及早期免疫基因表达检测

目的建立人BAFF转基因斑马鱼模型,探讨其在自身免疫性疾病发病中的作用。方法RT-PCR法由人淋巴瘤细胞克隆了人BAFF基因全长855bp蛋白编码区域,构建表达人BAFF重组质粒Tol2-hBAFF,体外细胞转染并通过免疫印迹法验证蛋白表达。重组载体经显微注射斑马鱼受精卵后,GFP荧光跟踪并筛选阳性鱼。qPCR法检测早期免疫相关基因表达情况。结果人BAFF-GFP融合蛋白可成功表达,利用Tol2-hBAFF重组质粒显微注射斑马鱼受精卵可获得表达人BAFF的转基因斑马鱼,且表达人BAFF斑马鱼1dpf胚胎中TCRAC明显高表达,而Ikaros则表达量显著降低,表明在斑马鱼胚胎中表达人BAFF蛋白会造成早期淋巴系统中基因的过早表达。结论建立的表达人BAFF的转基因斑马鱼,可为系统性红斑狼疮等与BAFF功能亢进密切相关的自身免疫性疾病的治疗,及相关机制研究提供一种具有诸多优点的新型工具。     

利用Tol2转座子构建斑马鱼心脏组织特异表达转基因载体及其表达分析

为了制备用于在斑马鱼心脏中特异表达目的基因的转基因载体,通过分子克隆的方法对能够在斑马鱼心脏中特异表达EGFP报告基因的Tol2载体进行了改造,在原有的CMLC2启动子与EGFP编码区之间插入带有多克隆位点的IRES序列,获得pTol2-CMLC2-IRES-EGFP转基因表达载体,该载体可以实现在同一个启动子CMLC2的驱动下分别同时表达目的基因和EGFP;为了验证该表达载体的有效性,进一步在CMLC2启动子与IRES序列之间插入DsRed-Monome编码区,利用得到的pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP转基因载体显微注射到斑马鱼单细胞期胚胎中进行表达分析,结果表明外源目的基因DsRed-Monome和报告基因EGFP均能以相同的表达模式在斑马鱼心脏组织中特异表达。pTol2-CMLC2-IRES-EGFP转基因表达载体的成功构建对于建立心脏发育候选基因的斑马鱼转基因实验模型具有重要意义。     

转基因高表达卵泡抑素1对斑马鱼肌肉生长促进作用研究

抑肌素是转化生长因子β超家族成员,其主要功能是对肌肉的生长发育起负调控作用.在哺乳动物中,抑肌素信号是通过其特异性的与激活素受体ⅡB亚基结合而发挥作用.因此,其信号传递作用可以被其结合蛋白以及ActR ⅡB的结合蛋白卵泡抑素所抑制.在小鼠肌肉组织中,高表达卵泡抑素可以导致肌肉组织肌纤维的增生和肥大.为了研究鱼类卵泡抑素...     

斑马鱼两种转基因方法的比较

对斑马鱼(Danio rerio)的两种转基因方法进行比较,分别采用显微注射和电脉冲导入法将携带有GFP报告基因的表达载体质粒导入斑马鱼受精卵,得出电脉冲最佳导入条件为最适电压125 V/cm,电阻50 Ω,最佳导入时期为1-2细胞期(40-50 min),以及最佳外源基因浓度为300 ng/μL.利用两种方法均得到转GFP基因的斑马鱼,而两种方法对比的结果表明,显微注射法耗时费力,但转基因阳性率高;电脉冲法一次可以处理大批量受精卵,但转基因阳性率远低于显微注射法.     

miR-22心肌特异转基因斑马鱼的构建及心肌肥厚的评估

目的:构建miR-22心肌特异转基因斑马鱼系,在体评估miR-22对于心肌肥厚的作用。方法:构建pTol2-CMLC2-miR-22-IRES-EGFP表达载体。通过显微注射的方法将tol2重组质粒于一细胞期注射入斑马鱼受精卵胚胎中,荧光筛选获得心肌特异表达绿色荧光的斑马鱼胚胎,并稳定表达传代。然后对稳定传代的成年斑马鱼心脏进行心肌肥厚及心功能的检测。结果:成功建立了miR-22心肌特异转基因斑马鱼系,通过定量PCR确定心肌中miR-22表达升高,荧光显微镜观察发现斑马鱼心肌出现绿色荧光。miR-22心脏特异过表达的转基因鱼系的成年鱼与野生对照组相比,出现了心肌肥厚的现象,心肌肥厚分子标志物nppa、myh7明显升高。斑马鱼心脏病理切片结果同样显示出miR-22心肌特异转基因斑马鱼出现了心肌肥厚的现象。结论:成功构建了miR-22心肌特异转基因斑马鱼,为研究心肌中miR-22的生物学功能提供了重要的工具,并证明miR-22心脏特异过表达会引起斑马鱼心肌肥厚。     

卵黄蛋白原1(vtg1)启动子调控绿色荧光蛋白表达的转基因斑马鱼的构建

环境雌激素严重危害人类的健康.为了简便直观地检测水环境中的雌激素污染,构建了一种转基因斑马鱼,在这种鱼的体内,利用卵黄蛋白原1(vitellogenin1,vtg1)的启动子调控报告基因绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)的表达.用1ng/L的17!-炔雌醇(17"-ethynylestradiol,EE2)诱导4天后,仔鱼肝脏中出现绿色荧光.RT-PCR和整体原位杂交实验证实,仔鱼体内EGFP和vtg1的时空表达模式相同.通过在显微镜下观察转基因鱼的绿色荧光,可以直观判断水环境中是否含有雌激素活性物质.该研究为环境雌激素的监测提供了一种简便直观的新型工具.     

斑马鱼pax2a(-3.1 kb):eGFP转基因品系的构建

为了更好地了解脊椎动物肾脏的早期发育,本研究利用斑马鱼这一研究脊椎动物器官发育的理想模式生物,通过构建肾脏特异性pax2a荧光标记转基因品系以实现实时在体地观察斑马鱼前肾的发育过程。我们分析了斑马鱼pax2a基因的启动子,扩增出其翻译起始位点上游3.1 kb的基因组DNA,利用Tol2转座子系统,经胚胎显微注射及三代筛选,成功构建了一个稳定的pax2a(-3.1 kb):eGFP转基因鱼品系。此转基因品系的绿色荧光蛋白在3体节时期就可以标记出中间中胚层,并在后续体节时期的中间中胚层前端(第3体节至第5体节对应的部分),及24 hpf的肾管前端和中段表达,基本模拟了pax2a在斑马鱼早期前肾发育中的时空表达模式。本研究所获得的pax2a(-3.1 kb):eGFP弥补了已有pax2a转基因品系中报告基因无法准确标记出中间中胚层和前肾管前端的缺陷,是研究斑马鱼前肾早期发育的良好材料。     

将制作转基因斑马鱼的实验引入本科生基因工程实验课教学的探索与实践

转基因动物的制备是基因工程的核心技术与重要成果之一, 然而目前在国内高校本科生基因工程实验课中还未见开展制备转基因动物的报道。作者利用科研平台的优势, 将转基因斑马鱼的制作引入本科生基因工程实验课教学, 并对其教学模式进行了探索与实践, 取得了较好的成效, 具有较好的推广价值。     

荧光转基因斑马鱼Tg(ttn.2:EGFP)的构建

为了建立一种用于研究肌肉和心脏发育及其相关疾病的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转基因斑马鱼品系,本研究使用斑马鱼ttn.2基因编码区上游启动子序列和绿色荧光蛋白基因编码序列构建了重组表达载体,并将该载体和Tol2转座酶的加帽mRNA显微共注射入斑马鱼1-细胞期胚胎,通过荧光检测、遗传杂交筛选和分子鉴定等方法,成功建立了能稳定遗传的Tg(ttn.2:EGFP)转基因斑马鱼品系。荧光表达分析及原位杂交分析结果表明,绿色荧光信号在斑马鱼肌肉和心脏组织中特异表达模式与ttn.2基因的mRNA表达一致。通过反向PCR鉴定转基因表达载体在F1代斑马鱼品系中的随机整合位点,结果表明:No.33转基因品系的EGFP基因整合在斑马鱼的4号和11号染色体上,No.34转基因品系则整合在1号染色体上。该荧光转基因斑马鱼品系Tg(ttn.2:EGFP)的成功构建为肌肉和心脏发育以及相关疾病研究提供了一个新的理想实验模型。此外,绿色荧光强烈表达的斑马鱼品系还可以作为一种新的观赏鱼。     

Generation and Characterization of a Transgenic Zebrafish Expressing the Reverse Tetracycline Transactivator

Conditional expression of a target gene during zebrafish development is a powerful approach to elucidate gene functions. The tetracycline-controlled systems have been successfully used in the modulation of gene expression in mammalian cells, but few lines of zebrafish carrying these systems are currently available. In this study, we had generated a stable transgenic zebrafish line that ubiquitously expressed the second-generation of reverse Tet transactivator （rtTA-M2）. Southern blotting analysis and high-throughput genome sequencing verifed that a single copy of rtTA-M2 gene had stably integrated into the zebrafish genome. After induction with doxycycline （Dox）, a strong green fluorescent protein （GFP） was seen in rtTA-transgenic eggs injected with pTRE--EGFP plasmids. The fluorescent signal gradually decreased after the withdrawal of Dox and disappeared. However, leaky expression of GFP was undetectable before Dox- induction. Additionally, transgenic embryos expressing rtTA-M2 exhibited no obvious defects in morphological phenotypes, hatching behavior and expression patterns of developmental marker genes, suggesting that rtTA-M2 had little effect on the development of transgenic zebrafish. Moreover, expressed Dickkopf-1 （DKK1） in pTRE-DKKl-injected embryos led to alterations in the expression of marker genes associated with Wnt signaling. Thus, this rtTA-transgenic zebrafish can be utilized to dissect functions of genes in a temporal manner.     

HtrA2转基因鼠的建立与鉴定

旨在建立神经特异性过表达HtrA2转基因鼠。通过质粒重组技术构建神经特异性表达HtrA2质粒pNSE-HtrA2,利用EcoR I及PvuI切割pNSE-HtrA2获得转基因。显微注射转基因到FVB/N受精卵并移植到假孕鼠的输卵管中发育,获得的转基因鼠利用Western blot鉴定特异性过表达情况。结果显示,成功建立神经特异性过表达HtrA2转基因鼠,神经特异性过表达HtrA2达到5.4倍。本研究建立了神经特异性过表达HtrA2转基因鼠,可用于HtrA2在神经系统的作用研究。     

染色体重组对转基因大麦中gfp基因表达的作用

利用5种转绿色荧光蛋白基因(gfp)大麦不同株系及野生型大麦为材料,对不同转基因株系间以及转基因株系与野生型植株间进行杂交,分别对不同世代植株的根尖、花粉中gfp基因的表达量进行测定.结果表明,不同转基因株系间的根尖、花粉的gfp基因在表达量上存在差异,同一转基因材料的gfp基因表达存在组织差异;gfp基因在杂交后代中作为一个显性基因以孟德尔方式稳定遗传,不同染色体上的gfp基因重组有利于提高持基因表达.     

人尿激酶原乳腺定位转基因小鼠的建立

应用大鼠β乳酪蛋白基因的上游调控序列和人尿激酶原ｃＤＮＡ构建成功了乳腺定位表达载体．用显微注射的手段导入到受精卵的雄前核,从注射的３００枚受精卵中,１４０枚被移植到９只假孕的受体小鼠．结果从获得的子一代小鼠中,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实,有３只转基因阳性的小鼠．     

系统表达HB-EGF转基因小鼠的建立

目的建立系统表达肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF）的转基因动物模型,利用转基因动物模型研究HB-EGF与组织纤维化的关系。方法RT-PCR法克隆小鼠HB-EGF基因,将其插入Chickenβ-actin启动子下游,构建Chickenβ-actin-HB-EGF表达载体,利用显微注射的技术把表达载体注射到受精卵的雄原核中,建立HB-EGF转基因小鼠。利用特异引物PCR的方法鉴定转基因的基因型,采用Western Blot方法鉴定HB-EGF基因在全身组织的表达。分别取HB-EGF转基因鼠与同窝阴性小鼠的肝、肾、肺及膀胱组织进行Massion染色。结果建立了系统表达HB-EGF转基因小鼠,Western Blot发现其HB-EGF在肝、肺、肾及膀胱的表达与同窝阴性对照小鼠相比明显增加。Massion染色结果表明转基因鼠肝、肺、肾及膀胱组织纤维化程度明显高于同窝阴性对照小鼠。结论成功建立了系统表达HB-EGF转基因小鼠,HB-EGF的过度表可显著加重组织纤维化程度。     

斑马鱼在抗肿瘤血管生成研究中的应用

近年来,斑马鱼作为一种新的模式生物,在胚胎的分子发育机制、疾病模型的构建以及药物筛选等研究中受到了广泛重视。随着先进的基因诱导技术和共聚焦显微观察技术的发展,斑马鱼已经在抗肿瘤血管生成药物研究中得到广泛应用。就斑马鱼在抗肿瘤血管生成药物筛选及其在肿瘤血管生成机制方面研究的应用作一综述。     

转基因植物发展状况及外源基因在后代中遗传分离研究进展

转基因植物近年来得到迅猛发展。本文综述了转基因植物 ,特别是转基因林木的的发展现状。并从单基因位点孟德尔遗传 ,多基因位点孟德尔遗传以及非孟德尔式遗传三个方面介绍了外源基因在转基因植物后代中遗传分离的研究进展。并就影响外源基因遗传分离的因素进行了讨论。