KCNQ1基因及其编码钾通道的研究概况

本文介绍了KCNQ1基因和其编码的通道蛋白的结构、生理学功能及电生理特点。归纳了围绕KCNQ1基因的热点研究方向和成果,并展望了未来的研究趋势。对基础医学上关心的KCNQ1基因突变与疾病的关系,及相关的病理药理学研究做了较为详细的介绍。     

应用PCR技术对先天性长QT综合征KCNQ1 基因进行定点突变的研究

利用聚合酶链反应（PCR）技术对长QT综合征（LQTS）KCNQ1基因进行定点突变的研究。首先设计两对引物（包含预定的突变）,通过3轮PCR扩增,扩增出含有所需突变位点的片段,然后将片段克隆入T载体中,通过酶切连接的方法将突变点引入到pIRES2-EGFP-KCNQ1中,随后用Effectene转染试剂介导转染HEK293细胞。结果在真核表达载体pIRES2-EGFP-KCNQ1基础上获得了KCNQ1 cDNA C934T的突变体,测序表明在序列中发生了预期的突变。将含突变点的pIRES2-EGFP-KCNQ1转染HEK293细胞后,在荧光显微镜下观察到被转染的HEK293细胞发出绿色荧光,表明含突变点的pIRES2-EGFP-KCNQ1得到了表达。Abstract: To study PCR site-directed mutagenesis of long QT syndrome KCNQ1 gene in vitro. The site-directed mutagenesis of LQTS gene KCNQ1 was made by PCR. Two sets of primers were designed according to the sequence of KCNQ1 cDNA, and mismatch was introduced into primers. Mutagenesis was performed in a three-step PCR. The amplified fragments from the third PCR which contained the mutation site were subcloned into the T-vecor PCR2.1.Then the fragments containing the mutation site was obtained from PCR2.1 with restriction enzyme digestion and was inserted into the same restriction site of pIRES2-EGFP-KCNQ1. With Effectene Transfection Reagent, pIRES2-EGFP-KCNQ1 was transfected into HEK293 cell. The sequencing analysis showed that the mutation site was correct. Mutation from T to C in 934 site of KCNQ1 cDNA was found. Under the fluorescence microscope, the green fluorescence was spread in the transfected HEK293 cell, meaning the pIRES2-EGFP-KCNQ1 containing the mutation site was expressed correctly.     

心脏特异表达LMNA^E82K转基因小鼠的建立

目的建立心脏特异表达LMNAE82K转基因小鼠,为研究LMNAE82K与心肌病发病机制的关系提供工具动物。方法把LMNAE82K基因插入α-MHC启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立C57BL/6JLMNAE82K转基因小鼠,PCR鉴定转基因小鼠的基因型,采用Western Blot鉴定LMNAE82K在心脏组织中的表达,H＆E染色和超声检测转基因小鼠心脏的病理改变。结果建立了2个心脏组织特异表达LMNAE82K的转基因小鼠品系。超声检查显示转基因小鼠心室壁变薄,收缩期容积和舒张期容积增加,射血分数及短轴缩短率降低。结论LMNAE82K转基因小鼠具有LMNAE82K引起的家族性扩心病有类似的病理变化,为研究LMNAE82K与心肌病发病机制的关系的研究提供了有价值的疾病动物模型。     

WIF-1心脏特异表达转基因小鼠心脏功能分析

目的建立心脏特异表达WIF-1转基因小鼠,研究该基因在心脏中表达对小鼠心脏发育,形态和功能维持中的作用。方法RT-PCR法克隆人WIF-1基因,把WIF-1基因插入α-MHC启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立转WIF-1C57BL/6J小鼠。并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因表型,RT-PCR和Westernblot检测基因表达水平,超声检测不同月龄WIF-1转基因小鼠心脏结构及功能变化。结果建立了2个系的心脏特异表达WIF-1转基因小鼠。心脏超声检查证实,WIF-1转基因小鼠与对照小鼠比较,左心室重量减小,舒张期左室内径和容积变小,每搏输出量和心输出量减小。结论WIF-1基因是心脏功能的负调控因子。     

心脏特异表达Dhcr24转基因小鼠的建立和表型分析

目的建立心脏特异表达小鼠24-脱氢胆固醇还原酶基因（Dhcr24）转基因小鼠,研究该基因在心脏中表达对小鼠心脏发育,形态和功能维持中的作用。方法RT-PCR法克隆小鼠24-脱氢胆固醇还原酶基因,把Dhcr24基因插入-αMHC启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立Dhcr24 C57BL/6J转基因小鼠。并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR和Western Blotting检测基因表达水平,光学显微镜和超声检测不同月龄Dhcr24转基因小鼠心脏的组织结构改变。结果建立了2个品系的心脏特异表达Dhcr24转基因小鼠。转入的Dhcr24基因在心脏组织的表达水平超过内源性Dhcr24的3倍。心脏组织学和超声检查证实：Dhcr24转基因小鼠的心室壁变厚,心腔变小,但心脏功能保持正常。结论成功建立了心脏特异表达Dhcr24转基因小鼠,Dhcr24基因在心脏组织的过度表达对小鼠心脏发育和功能维持中的作用需要进一步探讨。     

心脏组织特异性表达 Neuregulin -2转基因小鼠的建立及心脏功能分析

目的：神经调节蛋白2（ neuregulin-2, NRG2）可促进神经系统发育,基因缺失表现早期生长延迟, NRG2在心脏中也有表达,但其在心脏发育尤其是病理刺激时对心脏结构及功能的影响尚未见报道。本文目的是建立心脏组织特异性表达NRG2转基因小鼠,分析其在正常及压力负荷刺激时对心脏结构及功能的影响。方法将人NRG2基因插入到心脏特异性启动子α-MHC下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立NRG2转基因小鼠,PCR鉴定转基因小鼠基因型,western blot鉴定NRG2蛋白在心脏中的表达并筛选高表达的转基因品系,主动脉缩窄术（ transverse aortic constriction , TAC）制备压力负荷诱导的心肌肥厚小鼠模型。利用超声影像分析和病理学观察小鼠心脏结构和功能改变。结果建立了心脏组织特异性高表达NRG2转基因小鼠品系。与同窝阴性转基因小鼠相比,转基因小鼠左心室舒张末期后壁厚度（LVPWD）明显增加,3月龄时可达15．6％（P＜0．05）,经压力负荷刺激后,NRG2转基因手术小鼠心室壁增厚程度显著下降,心室腔增大,同时心肌排列紊乱程度和纤维化程度明显比NTG手术小鼠严重。结论在压力负荷下,转基因表达NRG2缩短了肥厚过程,同时加速了心衰进程。     

神经组织特异表达CTF1转基因小鼠的建立

目的建立神经组织特异表达CTF1的转基因模型小鼠,为研究CTF1生物学功能及与老年痴呆等疾病发病机制的关系提供工具动物。方法把CTF1基因插入神经组织特异的启动子PDGF下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立C57BL/6J CTF1转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠基因型,采用Western Blot方法鉴定CTF1在脑组织中的表达,对转基因小鼠脑组织进行石蜡切片,HE染色,显微镜观察组织结构形态的改变。结果建立了2个不同表达水平的CTF1转基因小鼠品系。转入的CTF1基因在脑组织的表达水平均高于同龄对照小鼠。组织学分析显示CTF1转基因小鼠大小脑组织基本结构形态未见异常。结论成功建立了稳定遗传的神经组织特异表达CTF1转基因小鼠品系,为CTF1的生物学功能及与老年痴呆等疾病发病机制关系的研究提供了有力的模型工具。     

心脏特异表达肾素（原）受体转基因小鼠的建立

目的建立心脏特异表达（p）RR的转基因小鼠,研究（p）RR在心肌病发病过程中的调节作用。方法将（p）RR基因插入到心脏特异表达启动子α-MHC下游,构建转基因表达载体,通过显微注射的方法建立（p）RR转基因小鼠,PCR法鉴定转基因小鼠的基因型;Western blot和免疫组化的方法检测（p）RR在心脏组织中的表达;利用小动物超声仪检测转基因小鼠的心脏结构和功能;双色免疫荧光共聚焦进行（p）RR蛋白在转基因小鼠中的亚细胞定位,Western blot方法检测了钙泵（ATP2A2）、钠-钙交换体1（NCX 1）以及肌钙蛋白T（cTnT）在转基因小鼠心脏组织中表达量的变化情况。结果建立了心脏高表达（p）RR的转基因小鼠品系;内源性和转基因高表达的（p）RR蛋白均定位在细胞内高尔基体和内质网上;心脏特异高表达（p）RR蛋白使小鼠心脏收缩功能增强,主要表现在与同窝阴性对照小鼠相比,转基因小鼠收缩期左室内径（LVID,systolic）降低9%（P〈0.05,n=18）,收缩期容积（LVESV,systolic）减少了23%（P〈0.05,n=18）,射血分数EF（ejection fraction）升高14%（P〈0.01,n=18）,短轴缩短率FS（fraction shortening）升高20%（P〈0.01,n=18）;和心脏收缩功能和钙离子相关的ATP2A2和NCX 1表达均下调,而cTnT表达量上调。结论在心脏中过表达（p）RR能够引起心脏收缩功能明显增强,同时直接或间接调节ATP2A2、NCX 1和cTnT表达。提示（p）RR可能是调节心脏中的钙离子而参与影响心肌功能。     

用鼻咽相对特异性调控区建立N-LMP1转基因小鼠

为了研究EBV LMP1在鼻咽癌发生发展中的作用 ,构建了EDL 2、PLUNC p双启动子调控鼻咽癌来源的LMP1(latentmembraneprotein 1,潜伏膜蛋白 1)的表达载体 ,采用受精卵前核显微注射法构建转基因小鼠。结果表明 ,在所获得的 5 8只转基因首建鼠中 ,4只整合阳性 ,其中的一只转基因小鼠在鼻咽、前胃、舌根等部位检测到了外源基因的表达。     

Dicer1转基因小鼠模型的建立

目的建立Dicer1转基因小鼠模型。方法构建pcDNA3.1-Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导入BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR受体母鼠输卵管内。出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer1基因表达。结果显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR检测获得6只阳性鼠,Southern检测6只均为阳性。对Southern检测阳性转基因小鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达。对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常。结论成功建立Dicer1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER1基因功能及miRNA的表达及功能等奠定基础。     

The novel C-terminal KCNQ1 mutation M520R alters protein trafficking

The long QT-syndrome is characterized by a prolongation of the QT-interval and tachyarrhythmias causing syncopes and sudden death. We identified the missense mutation M520R in the calmodulin binding domain of the Kv7.1 channel from a German family with long QT-syndrome. Heterologous expression of the mutant did not reveal any whole-cell currents independent of the auxiliary subunit KCNE1. Co-expression of the wild-type Kv7.1 channels and the mutant showed that the mutant did not have a dominant negative effect. In immunocytochemical assays of transfected COS-1 cells wild-type Kv7.1 showed an immunopositive labeling of the plasma membrane. For M520R no plasma membrane staining was visible, instead a strong signal in the ER was observed. These results indicate that the LQT1 mutation M520R leads to ER-retention and dysfunctional trafficking of the mutant channel resulting in haploinsufficiency.     

Dkk3心脏特异表达转基因小鼠心脏功能分析

目的建立心脏特异表达Dkk3转基因模型小鼠,研究Dkk3对心脏发育及和心肌病的调节作用。方法把Dkk3基因插入心肌特异启动子-αMHC下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立C57BL/6J Dkk3转基因小鼠,PCR鉴定转基因小鼠基因型,采用Northern blot检测Dkk3在心脏组织中的表达,HE染色和超声检查转基因小鼠心脏结构和功能。结果建立了3个不同表达水平的Dkk3转基因小鼠品系。转入的Dkk3基因在心脏组织的表达水平均高于同龄对照小鼠。组织学分析显示Dkk3小鼠室壁变厚,心腔减小,心肌细胞排列轻度紊乱。超声检查显示心室壁变厚,收缩期容积和舒张期容积显著减小,射血分数,短轴缩短率增加。结论Dkk3过表达导致转基因小鼠室壁变厚,心腔减小,心肌细胞排列轻度紊乱,心肌舒张功能轻度失调。     

Biophysical properties of mutant KCNQ1 S277L channels linked to hereditary long QT syndrome with phenotypic variability

Hereditary long QT syndrome (LQTS) is associated with ventricular torsade de pointes tachyarrhythmias and sudden cardiac death. Mutations in a cardiac voltage-gated potassium channel, KCNQ1, induce the most frequent variant of LQTS. We identified a KCNQ1 missense mutation, KCNQ1 S277L, in a patient presenting with recurrent syncope triggered by emotional stress (QTc = 528 ms). This mutation is located in the conserved S5 transmembrane region of the KCNQ1 channel. Using in vitro electrophysiological testing in the Xenopus oocyte expression system, the S277L mutation was found to be non-functional and to suppress wild type currents in dominant-negative fashion in the presence and in the absence of the regulatory ß-subunit, KCNE1. In addition, expression of S277L and wild type KCNQ1 with KCNE1 resulted in a shift of the voltage-dependence of activation by − 8.7 mV compared to wild type I_Ks, indicating co-assembly of mutant and wild type subunits. The electrophysiological phenotype corresponds well with the severe clinical phenotype of the index patient. However, investigation of family members revealed three patients that exhibit asymptomatic QT interval prolongation (QTc = 493-518 ms). In conclusion, this study emphasizes the value of biophysical testing to provide mechanistic evidence for pathogenicity of ion channel mutations identified in LQTS patients. The inconsistent association of the KCNQ1 S277L mutation with the clinical presentation suggests that additional genetic, epigenetic, or environmental factors play a role in defining the individual clinical LQTS phenotype.     

Congenital long QT syndrome caused by the F275S KCNQ1 mutation: Mechanism of impaired channel function

Congenital long QT syndrome is characterized by a prolongation of ventricular repolarization and recurrent episodes of life-threatening ventricular tachyarrhythmias, often leading to sudden death. We previously identified a missense mutation F275S located within the S5 transmembrane domain of the KCNQ1 ion channel in a Chinese family with long QT syndrome. We used oocyte expression of the KCNQ1 polypeptide to study the effects of the F275S mutation on channel properties. Expression of the F275 mutant, or co-expression with the wild-type S275 polypeptide, significantly decreased channel current amplitudes. Moreover, the F275S substitution decreased the rates of channel activation and deactivation. In transfected HEK293 cells fluorescence microscopy revealed that the F275S mutation perturbed the subcelluar localization of the ion channel. These results indicate that the F275S KCNQ1 mutation leads to impaired polypeptide trafficking that in turn leads to reduction of channel ion currents and altered gating kinetics.     

心脏特异表达Calponin 1转基因小鼠的心脏功能分析

目的建立心脏特异表达Calponin 1转基因小鼠,研究Calponin 1对心脏发育及心肌病的调节作用。方法利用心脏特异启动子α-MHC构建转基因表达载体,显微注射法建立Calponin 1转基因小鼠,PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western Blot检测Calponin 1在心脏组织中的表达,心脏超声检测转基因小鼠的心脏结构和功能,HE染色和Masson染色检测转基因小鼠心脏的病理改变。结果 Calponin 1在野生型小鼠心脏中有表达,在扩张型心肌病小鼠的心脏组织表达降低。通过显微注射法,建立了2个心脏组织Calponin 1基因高表达的转基因小鼠系。与野生型小鼠相比,Calponin 1转基因小鼠收缩期左室内径（LVID,systolic）增加28%（P〈0.01,n=12）,舒张期左室内径（LVID,diastolic）增加16.2%（P〈0.01,n=12）,收缩期左室后壁厚度（LVPW,systolic）减小15.7%（P〈0.01,n=12）,舒张期左室后壁厚度（LVPW,diastolic）减小21%（P〈0.01,n=12）,射血分数（ejection fraction,EF）降低11.5%（P〈0.01,n=12）,短轴内径缩短率（fraction shortening,FS）降低14.6%（P〈0.05,n=12）。转基因小鼠心脏组织病理H＆E染色和Masson染色显示,转基因小鼠心室扩张,心肌细胞不均匀肥大,细胞间隙变大,心肌间质纤维增多。结论 Calponin 1在心脏特异过表达引起转基因小鼠心脏左室内径增加,收缩期容积和舒张期容积显著增大,心室壁变薄,射血分数及短轴缩短率降低等扩张性心肌病表型,推测Calponin 1是参与心肌病病理发生的基因之一。