枯草杆菌克隆体系的研究

为了重组基因能良好地表达,需要发展多种克隆体系。本文综述了枯草杆菌作为克隆载体的优点,枯草杆菌中天然质粒的筛选,异源质粒的引入,一系列重组质粒的构建,噬菌体载体的发展,DNA分子与转化的关系,原生质体的转化及外源基因在枯草杆菌体系中的表达等方面的研究概况。     

枯草杆菌克隆体系的研究

为了重组基因能良好地表达,需要发展多种克隆体系。本文综述了枯草杆菌作为克隆载体的优点,枯草杆菌中天然质粒的筛选,异源质粒的引入,一系列重组质粒的构建,噬菌体载体的发展,DNA分子与转化的关系,原生质体的转化及外源基因在枯草杆菌体系中的表达等方面的研究概况。     

促DNA修复多效蛋白诱导因子pprI逆转录病毒载体系统的构建及其鉴定

目的:为实现耐辐射球菌pprI基因在哺乳动物细胞中的稳定遗传与表达,构建重组逆转录病毒载体质粒pLXIN-pprI。方法:将目的基因pprI亚克隆经过双酶切后定向连接到pLXIN质粒上,构建逆转录病毒重组质粒pLXIN-pprI。将pLXIN-pprI转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,氨苄青霉素筛选后抽提获得重组质粒pLXIN-pprI,双酶切及DNA测序鉴定。结果:酶切鉴定及测序结果显示结果与预期相符,pprI基因成功插入pLXIN逆转录病毒载体中。结论:重组逆转录病毒载体质粒pLXIN-pprI构建成功,为实现耐辐射球菌pprI基因在哺乳动物细胞中的重组与表达奠定了基础。     

抗黄曲霉毒素B1单链抗体在Sf9昆虫细胞中的表达与性质分析

目的:在原核表达抗黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)单链抗体(single chain Fv fragment,scFv)研究的基础上,为进一步了解和提高抗AFB1 scFv的活性,利用Sf9昆虫细胞表达抗AFB1 scFv,并对其活性进行探索研究。方法:构建pFastBac 1-scFv2E6VHVL重组质粒,将重组质粒转化Escherichia coli (E. coli) DH10Bac细胞,进行蓝白斑筛选,挑取阳性克隆。提取相应的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid侵染Sf9昆虫细胞,表达scFv,利用镍亲和层析法纯化scFv,并以ELISA检测scFv活性。结果:蓝白斑筛选后,经菌落PCR和测序验证挑取的白斑阳性单克隆含有正确的单链抗体基因。提取相应的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid侵染Sf9昆虫细胞,通过Western blot检测得知抗AFB1 scFv在Sf9昆虫细胞中成功表达。AFB1对scFv的抑制中浓度(IC₅₀)为30μg/ml。结论:与E. coli BL21(DE3)表达系统相比,scFv灵敏度转好,但仍有较大提升空间。     

大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达

本文用穿梭质粒载体pSE-3,进行了大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达。把含有1.6kb葡萄糖异构酶基因的pX1200(4.3kb)质粒与pGEM-3(2.9kb)质粒分别用EcoRI酶解,T4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101(Xy1~-,Neo(?)),得到的重组质粒被命名为pX1203(7.2kb);将pX1203与穿梭质粒载体pSE-3分别用HindⅢ酶解,T_4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101,在含有新霉素的木糖培养基上筛选到转化重组体,其重组质粒被命名为pSE×100(10.6kb);把pSE×100转化变铅青链霉菌TK54的原生质体,在硫链丝菌肽(50μg/ml)和新霉素(50μg/ml)的平皿上得到了重组体。经质粒提取,酶切分析,再转化和葡萄糖异构酶活性测定,结果表明,大肠杆菌的葡萄糖异构酶基因确实已在链霉菌中克隆和表达。     

抗对虾白斑综合症病毒单链抗体A1基因在酵母中表达及其与抗原结合活性

通过PCR从噬菌粒载体上扩增一种抗对虾白斑综合症病毒 (WSSV)的单链抗体A1(ScFvA1)基因 ,并构建于大肠杆菌 酵母穿梭质粒载体pPIC9K上。经PCR ,酶切 ,测序鉴定重组克隆 ,发现重组成功。将重组质粒pPIC9K ScF vA1转化毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115中 ,利用甲醇诱导 ,将单链抗体A1在酵母中进行了初步表达。经SDS PAGE电泳 ,发现其大小约为 32KD ,通过ELISA实验 ,证明表达上清液中的单链抗体具有很高的WSSV结合活性。     

一个体外构建的重组质粒——pCBI

构建了质粒pBR322和pCRI 的重组质粒——pCBI。已通过转化技术将其送入大肠杆菌,在含有四环素和卡那霉素的培养基中筛选了转化子。在细菌培养液内加入氯霉素使转化子中的重组质粒扩增。采用琼脂糖凝胶电泳法及水溶性两相抽提法纯化重组质粒。重组质粒pCBI 的电泳速度低于两个亲本质粒。用限制酶EcoRI 降解重组质粒,在凝胶电泳上看到两条带,它们的位置分别对应于pBR322线性DNA和pCRI 线性DNA。电镜观察到环状pCBI DNA 并测得其长度为5.77±0.30微米,折合分子量为(11.9±0.6)×10~6道尔顿。     

一株中华绒螯蟹呼肠孤病毒RNA1 cDNA文库构建及其RNA聚合酶基因部分序列分析

在中华绒螯蟹体内分离一株呼肠孤病毒（命名为EsRV905株）,采用Trizol试剂提取病毒核酸,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,碎胶法回收基因组各节段。随机引物法合成第一节段的cDNA文库,胶回收试剂盒去除小片段,平端连接于载体,化学转化,利用蓝白斑筛选阳性克隆子,酶切鉴定重组质粒。从基因组第一节段的重组质粒中选择2个插入片段为1.5kb的质粒测序,结果得到包括RNA聚合酶主要特征性结构的一段序列。结果说明,这株蟹呼肠孤病毒的RNA聚合酶定位于基因组第一节段。     

一株中华绒螯蟹呼肠孤病毒RNA1 cDNA文库构建及其RNA聚合酶基因部分序列分析

在中华绒螯蟹体内分离到一株呼肠孤病毒(命名为EsRV905株).采用Trizol试剂提取病毒核酸,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,碎胶法回收基因组各节段.随机引物法合成第一节段的cDNA文库,胶回收试剂盒去除小片段,平端连接于载体,化学转化,利用蓝白斑筛选阳性克隆子,酶切鉴定重组质粒.从基因组第一节段的重组质粒中选择2个插入片段约为1.5kb的质粒测序,结果得到包括RNA聚合酶主要特征性结构的一段序列.结果说明,这株蟹呼肠孤病毒的RNA聚合酶定位于基因组第一节段.     

甲型H1N1流感病毒HA基因在昆虫细胞中的截短表达

目的:利用Bac-to-Bac Baculovirus Expression System表达重组HA蛋白,Western blot及IFA方法鉴定其表达。方法:采用PCR方法扩增A/California/04/2009(H1N1)HA基因,将其克隆到pFastBacHT A载体上,重组质粒pFastBacHT-HA经双酶切及测序鉴定正确后,转化阳性重组载体进入E.coli DH10Bac感受态细胞中,通过Bluo-gal蓝白斑筛选、PCR鉴定获得重组转座子rBacmid-HA。从重组转座子中提取rBacmid-HA质粒DNA转染sf 9昆虫细胞,制备重组杆状病毒。重组杆状病毒感染sf 9细胞表达重组蛋白,Western blot及IFA鉴定重组蛋白表达情况。结论:成功构建了甲型H1N1流感病毒HA基因的昆虫杆状病毒表达载体,该表达载体转染昆虫细胞后制备的重组杆状病毒病毒滴度较高,重组杆状病毒表达的重组蛋白经Western blot 及IFA 鉴定后具有良好的免疫反应原性。     

酒类酒球菌mleP基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

苹果酸通透酶具有协助苹果酸 乳酸发酵 (MLF)的重要功能。以酒类酒球菌 (Oenococcusoeni)优良菌系Oenococcus Lee SD 2a的总DNA为模板 ,用PCR方法克隆到苹果酸通透酶基因mleP ,构建了重组质粒pBMmleP。序列分析表明克隆到的基因序列与已报道的序列同源性为 99%。为使目的基因在酿酒酵母中表达 ,以大肠杆菌 酿酒酵母穿梭质粒YEp35 2为载体 ,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件 ,构建了重组表达质粒YEpmleP ,并转化酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)YS5 8。酵母转化子用含有亮氨酸、组氨酸和色氨酸的YNB平板筛选鉴定。获得的转化子在添加了L 苹果酸 (5g L)的培养基中培养 4d ;取培养液上清用HPLC检测 ,结果显示重组转化子YSP的培养液中L 苹果酸剩余含量均低于空载体转化子YS35 2 ,因此所得酵母重组转化子对苹果酸的转运能力有所提高     

布鲁菌抗原的快速克隆与高效表达

目的:通过Gateway技术构建布鲁菌抗原表达载体,并筛选出高效可溶性表达载体。方法:以山羊布鲁菌16M株染色体DNA为模板,扩增4个布鲁菌抗原基因BMEI2002、BMEI1069、BMEI1483和BMEI0748,利用GatewayBP反应将基因克隆到入门载体pDONR201中,构建重组质粒,然后用Gateway LR反应将基因重组到3种表达载体(pDEST17、pHXGWA、pHGGWA)中,构建相应的重组表达质粒,将重组质粒转化大肠杆菌ER2566(DE3)并诱导表达,分析利用3个不同载体所表达蛋白的表达量及表达形式。结果:利用BP反应构建了4个基因的重组质粒,用LR反应将这些基因分别克隆到表达载体,构建得到了相应的表达载体;诱导表达后的可溶性分析显示,含6×His和TRX标签的pHXGWA所表达的蛋白在表达量和可溶性方面均优于pDEST17和pHGGWA。结论:通过Gateway技术实现了布鲁菌抗原的快速克隆,筛选到的pHXGWA可作为后续大规模克隆表达载体,为布鲁菌抗原的大规模克隆表达和保护性抗原的筛选奠定了基础。     

λ DNA酶切片段与pUC19克隆载体的构建与鉴定

目的:构建λDNA片段/p UC19重组质粒并鉴定。方法:将克隆质粒p UC19和λDNA进行Hind III酶切、碱法提取质粒,琼脂糖凝胶电泳纯化鉴定、紫外分光光度测定,T4DNA连接酶切产物、冰Ca Cl2转化E.coli DH5α菌株使之成为感受态细胞、蓝白斑筛选法筛选并鉴定重组转化子。结果:1所提质粒p UC19电泳获得预期的3条带,经由标准DNA Markar比对准确,提取浓度满足酶切需要。2酶切质粒p UC19电泳获得预期的1条带,λDNA片段电泳获得的4条带,经由标准DNA Markar比对准确。3培养皿不同区域出现数量不等的蓝色、白色菌斑。结论:应用质粒p UC19可成功构建λDNA片段/p UC19重组质粒。经鉴定,该克隆载体能够导入菌株E.coli DH5α,转化效率较高。     

鼻咽癌CD44抑制表达细胞株的建立

目的:构建CD44新剪接变异体siRNA质粒表达载体,建立CD44新变异体抑制表达的鼻咽癌细胞株.方法:合成CD44新变异体特异性干扰DNA片段,干扰DNA片段亚克隆于带绿色荧光蛋白的pGenesil -1.3质粒表达载体中,双酶切和测序鉴定重组表达质粒载体;采用脂质体将重组表达质粒载体转染入鼻咽癌5 -8F细胞系,进行G418筛选;Western blot分析CD44表达.结果:重组CD44干扰DNA片段质粒表达载体的碱基序列和插入方向正确;细胞转染效率达70％;G418筛选获得GFP表达的单克隆鼻咽癌5 -8F细胞株;Western blot分析表明CD44表达受抑制.结论:建立了CD44新变异体抑制表达的鼻咽癌细胞株,为CD44新变异体在鼻咽癌中的生物学功能提供了基础.     

虎源流感病毒HA 基因的系统发生分析及其在杆状病毒系统中的表达

通过对虎源流感病毒A/ Tiger/ Harbin/01/ 2003 (H5N1)的HA 基因进行克隆与序列测定,证明该基因全长为1 731 bp,读码框由1 707个碱基组成,编码568 个氨基酸。对HA 基因的进化分析表明,该基因与H5 亚型流感病毒的HA 基因同源性最高,其HA 裂解位点由6 个碱性氨基酸插入序列(RRRKKR)组成,符合高致病性禽流感病毒的分子特征。将HA 基因克隆入杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ,构建重组质粒pFastBac-HA;再将该重组质粒转化DH10 Bac 感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-HA;将Bacmid-HA 转染sf9 细胞,获得重组杆状病毒。经Western-blotting 检测,HA 蛋白在重组杆状病毒中获得表达。用感染重组病毒的sf9 细胞免疫小鼠,2 次免疫后2 周可诱导小鼠产生1∶ 8 ～1∶ 16 的血凝抑制抗体,表明虎源流感病毒的HA 基因在重组杆状病毒系统中得到了正确表达。     

表达猪瘟病毒石门株E0基因重组鸡痘病毒的构建及动物免疫试验

应用PCR从质粒pMD18-T-E0中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组鸡痘病毒表达载体FPV-P11上,进一步构建出重组鸡痘病毒转移载体FPV-pSY-E0.用脂质体将该质粒转染至鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)后,通过蓝斑纯化实验筛选出重组鸡痘病毒FV282-CSFV-E0.PCR证实E0基因已整合至鸡痘病毒基因组中,Western blot检测到重组病毒感染CEF细胞中E0蛋白的表达.重组病毒3次腹腔接种小鼠,ELISA检测血清抗体滴度高达1∶4 096.重组病毒免疫猪3次之后,接种猪瘟病毒强毒进行攻毒试验,结果对免疫组产生75%的保护率,为研制猪瘟活载体疫苗奠定了基础.     

表达增强绿色荧光蛋白重组乳酸菌的构建

以乳酸乳球菌通用表达载体pMG36e为基本骨架,将增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)插入该载体组成型表达强启动子p32的下游,构建了eGFP标记的乳酸菌表达载体pMG36e-eGFP。重组质粒电击转化一株乳酸乳球菌BLCC02-0018。筛选阳性转化子,通过连续荧光强度检测,验证eGFP基因能否在重组菌中稳定表达。重组表达质粒pMG36e-eGFP酶切及测序结果与预期片段大小相符,表明成功构建了重组乳酸菌表达载体pMG36e-eGFP;对阳性转化子进行蓝光激发,可见明显的绿色荧光,且荧光稳定性强,连续传代30代仍可见荧光,结果表明已经成功构建表达增强型绿色荧光蛋白的重组乳酸乳球菌,为下一步研究乳酸菌在动物体内的分布定殖规律打下了基础。     

重组质粒在减毒沙门氏菌中的稳定性及其对细菌侵袭力的影响

将含有外源基因的重组真核表达质粒pcDNA3-F和pCI-F转化减毒鼠伤寒门氏菌,探讨质粒类型和插入片段对重组质粒在细菌内的稳定性和细菌侵袭力的影响。结果表明,外源质粒可降低减毒沙门氏菌在体外的增殖能力和侵袭力,也影响细菌在鸡体内的存活力;就质粒类型而言,pCI的影响大于pcDNA3,而以携带外源基因的重组质粒影响较为显著;外源基因插入也影响质粒在宿主菌内的稳定性。提示利用减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗研究时,要考虑质粒类型与其在宿主菌内稳定性的关系、携带外源基因重组质粒对载体菌侵袭力和存活力的影响等问题。     

PTK重组质粒的构建与表达

目的构建并表达出PTK重组蛋白,以鉴定酪氨酸蛋白激酶(PTK)的活性,筛选酪氨酸激酶的抑制剂。方法从PTK重组克隆载体上切下目的基因片段Abl-PTK使其连接到表达载体pGEX4T-2上,转化大肠杆菌DH5a,筛选鉴定出正确的转化子。转化菌株经IPTG诱导后进行表达并进行SDS-PAGE分析。结果经酶切和诱导表达鉴定,重组质粒pGEX4T-2-PTK构建成功,并高效表达了58KD的GST-PTK融合蛋白。结论PTK基因被成功地重组至融合蛋白表达载体中,并在大肠杆菌中获得高效表达。该研究为进一步纯化、鉴定PTK的活性,筛选PTK的抑制剂奠定了基础。     

小麦G—型细胞质雄性不育的育性恢复因子Rf3的研究Ⅱ.总体DNA构建提莫菲维小麦基因组文库

分别用ＰｓｔⅠ、ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏＲⅠ三种限制性内切核酸酶切割提莫菲维小麦基因组ＤＮＡ,再与用相应酶处理的载体ｐＵＣ１１９连接,然后转化到大肠杆菌菌系ＤＨ５α之中。转化效率为１．２×１０４／μｇ。经α互补检测,初步筛选重组子。随机挑取单菌落分别培养,提取质粒,经琼脂糖凝胶电泳和斑点杂交,最后确定重组子,重组率为４３．８％。粗略地估计了克隆片段在基因组中的拷贝数