新型冠状病毒假病毒制备方法的优化及应用

该文旨在建立一种稳定高效的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)假病毒构建方法,并将所制备的假病毒用于评估抗体中和水平。通过比较不同穿梭质粒、质粒配比以及转染试剂对假病毒滴度的影响,优化制备高滴度假病毒的条件;通过制备不同的SARS-CoV-2突变株假病毒,测试该方法的稳定性;利用所制备的假病毒对SARS-CoV-2抗体的中和能力进行评价,测试该方法的可靠性。优化结果表明,当使用Lipofectamine^TM3000作为转染试剂时,pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP?psPAX2?pcDNA3.1-S以0.300μg?0.225μg?0.240μg的质量比转染获得的假病毒滴度最高。进一步,发现利用该方法包装的三种突变株的假病毒均可达到较高滴度。利用该方法制备的假病毒可以用于SARS-Co V-2抗体的中和活性检测,测得IC₅₀值为0.126μg/m L。该研究成功建立了一种简单高效的制备新型冠状病毒(SARS-CoV-2)假病毒的方法,其可用于体外评估SARS-CoV-2抗体中和活性,为研发SARS-CoV-2相关疫苗和药物的体外评...     

HIV-1假病毒应用的优势与弊端

HIV-1假病毒是携带一种外源性病毒包膜且仅能复制一代的病毒颗粒,其膜蛋白易于改造与检测,生物学过程易于量化、安全性高,不需要在BSL-3实验室进行研究,常用于研究HIV-1调节基因和功能、评估中和抗体、筛选抗病毒药物和疫苗以及HIV-1耐药性检测等。但HIV-1假病毒与野生型病毒之间存在必然的差异,在构建和表达过程中,HIV-1假病毒会存在复杂生物背景、质粒和转染试剂、细胞培养条件、产量和检测不均一等弊端,因此,有必要对HIV-1假病毒应用优势和弊端进行全面综述。     

三种丙型肝炎包膜感染性假病毒颗粒的制备及初步应用研究

本研究构建携带HCV代表株H77(1a)、中国HeBei株(1b)以及JFH-1株(2a)丙型肝炎病毒完整的E1-E2包膜糖蛋白基因的表达质粒,间接免疫荧光法及Western blot验证了其在细胞膜(293细胞)上的正确表达.三种包膜质粒分别与慢病毒包装质粒pHR'CMV△8.2及携带EGFP报告基因的自灭活(Self-Inactivating,SIN)转移质粒pCS-CG共转染293FT细胞,产生三种不同基因型的丙型肝炎包膜感染性假型(pseudotyped)病毒颗粒,免疫荧光与Western blot分析验证了E1/E2包膜糖蛋白在假病毒颗粒上的表达与掺人,利用p24 ELISA法及感染性实验对HCV假病毒进行滴定.从上清中获得的HCV假病毒可以在体外感染肝癌细胞系Huh7及Huh7-CD81(且后者上的感染效率约为前者上的2～3倍);利用针对HCV E2蛋白的具有广谱交叉中和活性的单克隆抗体AP33建立了基于上述假病毒颗粒的丙肝病毒体外中和抗体滴定方法,并应用于丙型肝炎患者体内的中和抗体水平的研究.本研究成功包装了包括中国流行株在内的3种不同基因型的HCV包膜感染性假病毒颗粒并建立了基于假病毒颗粒的HCV体外中和抗体检测方法,为研究HCV感染早期特性及特异抗病毒药物的体外筛选提供了有效模型,并可用于HCV感染者体内及HCV基因工程疫苗免疫后中和抗体水平的分析.     

HIV-1假病毒包装的重要影响因素分析

[目的]分析影响HIV-1假病毒包装的主要因素,建立该假病毒包装的优化条件.[方法]用单因素分析对比的方法,比较了对病毒包装效果有重要影响的转染试剂、转染试剂与质粒的数量、培养基血清类型、细胞周期阶段对于病毒包装效果的影响.[结果]对45批150盘病毒包装结果分析显示,使用PEI转染试剂成本低,转染效果好,其N/P在8-40均可以产生高活性的包装病毒;用进口血清包装时,相对于国产血清结果重复性高;细胞周期处于S及G2/M期时转染质粒相对于S以及G0/G1期有较高的病毒活性.[结论]用PEI为转染试剂可以包装出高活性的病毒,包装获取高活性病毒可以通过质粒与PEI梯度比例以及血清类型构成多个组合策略来实现.     

突变MARCH作用靶点在假病毒产率提升中的应用

抗病毒药物、中和抗体和预防性疫苗是应对新发、再发高致病性和高感染性病毒(如新冠病毒)最有效的策略。然而,涉及上述活病毒的实验操作必须在包含生物安全3级和4级设施的实验室中开展。为了便于评估上述抗病毒制品,研究者开发了基于人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)和水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)骨架的假病毒包装系统。该系统同时包含靶标病毒的囊膜蛋白表达质粒,使包装好的假病毒具备与野生型病毒相似的受体吸附和膜融合功能。鉴于此,在特定的包装系统中,囊膜蛋白的包装过程对假病毒产率和感染性影响巨大。研究发现膜相关泛素连接酶家族蛋白(membrane-associated RING-CH,MARCH)能够降解病毒囊膜蛋白,下调假病毒产率和感染性。讨论了囊膜蛋白胞内域赖氨酸修饰对假病毒产率影响的研究进展,以期提高囊膜蛋白表达量和加工成熟效率,促进抗病毒药物研发、抗体筛选、疫苗创制和病毒受体鉴定。     

含组氨酸纯化标签的假病毒表达载体的构建与应用

为了RNA类病毒进行核酸检测提供一种更稳定、更方便的全程监控技术,本文研究了含组氨酸纯化标签的假病毒监控内标和阳性对照的制备方法．通过基因工程手段将6个组氨酸插入MS2噬菌体包膜蛋白的β-发夹环结构中,成功构建带组氨酸纯化标签假病毒的通用表达载体．外源基因序列插入载体后,经诱导表达与镍离子亲和层析纯化后,可获得高浓度、高纯度的假病毒,在4 ℃和-20 ℃条件下,可用SM缓冲液稳定保存1年以上．     

整合狂犬病病毒G蛋白的假病毒构建及应用

目的 构建表达狂犬病病毒(rabies virus, RABV)G蛋白的假病毒,为RABV中和抗体检测及疫苗的研发提供有效实验工具。方法 通过无缝克隆技术构建表达RABV G蛋白的假病毒p-RABV-G,通过抗体中和试验评估狂犬疫苗接种者体内的中和抗体水平。结果 成功在293T细胞内进行假病毒p-RABV-G的包装,p-RABV-G可以表达G蛋白,并能高效感染Huh7.5细胞。4位狂犬疫苗接种者21 d的血清对p-RABV-G的抑制效果处于最优水平,在1∶625倍数的稀释条件下对p-RABV-G的抑制率高达95.79%、98.26%、98.42%和98.88%。结论 成功构建表达RABV G蛋白的假病毒p-RABV-G可用于狂犬疫苗的开发与中和抗体的筛选。在狂犬疫苗接种后的111 d,本文调查的4位接种者中的其中3位体内血清仍可对p-RABV-G产生抑制效果。     

新型冠状病毒假病毒的制备及血浆中和抗体检测

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引发新型冠状病毒肺炎（COVID-19）全球大流行。由于SARS-CoV-2生物安全管理的要求,高效制备获得高滴度的新型冠状病毒假病毒对基于S蛋白研发疫苗、中和抗体、病毒入侵抑制剂药物以及人群血清学调查等十分重要。本研究基于慢病毒系统,对制备新型冠状病毒假病毒过程中的重要参数进行优化,用Western Blot检测假病毒S蛋白和p24蛋白的表达及假病毒包装情况,用荧光素酶报告系统检测假病毒感染入侵效率。利用制备好的假病毒对恢复期血浆的中和抗体水平进行检测。结果显示骨架质粒与野生型Spike质粒为2∶1比例,在转染后48h收集上清为SARS-CoV-2野生型假病毒包装的最佳条件。与野生型相比,恢复期血浆对四种突变株的中和抗体滴度均降低,对B.1.351株中和能力最弱,B.1.617.2株其次,重型患者恢复期血浆对野生型和突变株的中和抗体滴度高于轻型与普通型患者。本研究优化了新型冠状病毒假病毒包装的实验室条件,评估了COVID-19患者恢复期血浆对野生型及四种突变株的中和抗体水平,提示未来对突变株的免疫逃逸进一步加强监测的重要性。     

沙鼠脑缺血模型特点及应用的研究进展

脑缺血因其高的发病率而成为近年来研究的热点。用于研究脑缺血的动物模型较多,其中沙鼠因大脑基底动脉环先天性发育不完全而成为脑缺血研究的较理想模型。沙鼠脑缺血模型在研究单侧脑缺血和全脑缺血方面都具有独特的优势,在研究脑缺血后脑区的病理变化、再灌注损伤机制及开发脑保护药方面都得到十分广泛的应用。本文针对不同脑缺血模型尤其是沙鼠模型的制作方法、优缺点及应用领域,将近年来国内外相关研究文献进行较为系统的梳理和综述。     

两种高危型HPV假病毒的构建及其在血清中和抗体测定中的应用

目的 构建人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)16型(HPV16)和18型(HPV18)假病毒,探索优化假病毒制备的条件,并利用制备的假病毒评价HPV疫苗血清抗体的中和活性。方法 将优化后的HPV16和HPV18 L1、L2和EGFP基因片段分别插入pcDNA3.1+载体中,通过多质粒共转染293FT细胞制备假病毒。对转染试剂、多质粒共转染比例、转染时间和细胞裂解时间进行摸索优化,通过测定假病毒的滴度,确定假病毒制备的最佳条件。收获的假病毒用30%的碘克沙醇作为介质进行超速离心纯化,纯化后的假病毒用于电镜观察。利用假病毒中和试验对制备的原核表达复性蛋白HPV16 L1免疫血清以及HPV16和HPV18病毒样颗粒(virus-like particles, VLP)免疫血清进行中和活性评价。结果 成功构建了假病毒,并确定了假病毒制备的最佳条件:pL1∶pL2∶pEGFP等3种质粒共转染比例为1∶0.1∶0.5,总量为4μg;转染时间为72 h,细胞裂解时间为24 h时获得的假病毒滴度最高。透射电镜观察结果显示,HPV16和HPV18假病毒颗粒基本呈规则圆形,形态上与天然病毒颗粒相似。中和试验结果显示,当用原核表达复性蛋白HPV16 L1免疫血清中和HPV16假病毒时,并不能抑制假病毒的感染活性;但HPV16和18 VLP免疫血清能明显的抑制HPV16和HPV18假病毒的感染活性。结论 成功构建并制备了2种高危型HPV假病毒,并可用于中和试验评价HPV疫苗血清抗体的中和活性。     

RNA干扰技术的应用新进展

RNA干扰（RNA interference,RNAi）被发现十年来在生物研究领域已经得到了长足的发展,并且已经初步显示出了巨大的潜力。本文综述了介导SiRNA方法的研究及其在基础研究、疾病模型建立和药物研究中的最新应用进展。     

DNA疫苗研究进展

DNA疫苗是20世纪90年代初出现的一种新型疫苗,近年来发展迅速,在预防和治疗病毒性疾病及肿瘤等方面效果显著。同传统的疫苗相比,DNA疫苗具有免疫效果好、生产成本低、临床应用方便等优点,但同样存在安全性的担忧。对DNA疫苗的发展及其作用机制、优势进行了综述,并对DNA疫苗的安全性提出了自己的观点与看法,可供DNA疫苗的研究者参考。     

植物代谢组学的研究方法及其应用

代谢组是指某一生物或细胞在一特定生理时期内所有的低分子量代谢产物.植物代谢组学是指对植物抽提物中代谢组进行高通量、无偏差全面分析的技术.近年来,植物代谢组学研究取得了很大进展.本文介绍了其含义、历史沿革及研究方法,并用典型实例阐释了它的应用方向.     

林木抗病基因工程研究进展

植物抗病性是当前植物病理学中研究的热点和难点之一。着重讨论植物抗病机制、抗病基因的转化方法及其在林木抗病基因工程中的应用情况,并对现阶段林木抗病基因工程中存在的主要问题和应用前景进行了讨论。     

脂肪酶抑制剂应用于抗肥胖的研究进展

肥胖易引发各种慢性代谢疾病,肥胖在全球的迅速流行引起了人们的关注。脂肪酶抑制剂作为一种作用于肠道内的减肥药物,不进入血液,不会产生中枢神经性副作用,不影响矿物质代谢,是近年来研究的热点。而各种植物提取物作为脂肪酶抑制剂的来源,具有非常巨大的潜力,以其更高的安全性,更广泛的来源,日后必将在新型减肥药品或保健品开发中占有重要的一席之地。本文主要就脂肪酶抑制剂的性质和应用于减肥领域的进展作一简要综述。     

基因工程技术在食品工业中的研究进展

综述基因工程技术在改善食品原料品质、改良食品工业用菌种和食品加工性能、生产酶制剂和保健食品方面的应用,同时对转基因食品及其安全性问题进行了总结归纳,最后对基因工程技术在食品中的发展前景进行展望。     

低植酸作物突变体研究进展

植酸是玉米(Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)、大麦(Hordeum vulgare)、水稻(Oryza sativa)和大豆(Glvcine max)等籽粒中广泛存在的一种有机酸(6-肌醇磷酸),其与K 、Ca2 、Mg2 和Fe3 等金属离子形成的植酸盐是微量营养元素的重要贮存形式.植酸及植酸盐不能被人和非反刍动物所吸收利用;植酸摄入体内后还会和其他来源的微量营养元素结合形成植酸盐,造成这些营养元素的生物有效性下降,从而造成微量元素缺乏症.此外,大量的植酸及植酸盐随粪便排出,造成严重的环境污染,尤其是水体富营养化.由于土壤中缺乏分解微生物,即使畜禽粪便作有机肥还田仍不能被作物吸收利用.近年来,利用理化诱变与转基因技术已成功地获得了玉米、大麦、水稻和大豆等作物的低植酸突变体.本文对植酸的生物合成过程、低植酸突变体的诱发与研究、低植酸突变体的遗传特征与可能机理及营养评价进行了综述,并对低植酸作物的应用前景进行了简要分析.