口服脂质体包裹Ag85A DNA疫苗诱导抗体的产生

制备脂质体包裹的Ag85A口服DNA疫苗,并观察小鼠口服后所诱生的抗体产生情况。用脂质体包襄重组质粒pcDNA3．1／mye—HisA—Ag85A制备口服DNA疫苗,并用脂质体包裹空质粒pcDNA3．1／myc—HisA作为对照。将C57BL／6小鼠随机分为3组,即生理盐水组、空质粒组和重组质粒DNA疫苗组。分别将生理盐水、空质粒和重组质粒DNA疫苗以灌胃方式投给各组小鼠,共免疫3次,每次间隔14d,末次免疫后14d处死小鼠,ELISA法检测血清中Ag85A特异性抗体水平,放射免疫法测定肠组织中分泌型IgA（sIgA）含量。重组质粒组血清中Ag85A特异性抗体滴度为1：160,空质粒组和生理盐水组血清中均未捡出Ag85A特异性抗体。重组质粒组肠组织中slgA含量（0．3761±0．0456）μg／mL较空质粒组（0．2374±0．0414）μg／mL和生理盐水（0．1993±0．0899）μg／mL组显著增高（P〈0．05）,而空质粒组和生理盐水组未见有意义的变化（P〉0．05）。口服脂质体包裹Ag85ADNA疫苗可诱导外周特异性抗体的产生和肠道黏膜局部sIgA的水平的升高。     

分枝杆菌Ag85A DNA疫苗对膀胱癌小鼠细胞免疫功能的影响

为探讨分枝杆菌Ag85A DNA疫苗能否提高荷膀胱癌小鼠保护性免疫应答水平,将1×10^6个MBT-2细胞注射于C3H/HeN小鼠的右侧背部皮内,待肿瘤长至直径约5～8 mm时,将动物随机分成实验组、空质粒组和空白对照组3组,分别于小鼠双侧股四头肌内注射Ag85A-V1 Jns.tPA质粒,V1 Jns.tPA质粒总量0.1 mL（100μg）,或生理盐水0.1 mL,每14 d 1次,共3次,末次免疫后第14天分别检测T细胞亚群数量、NK细胞活性、FasL mRNA表达情况、淋巴细胞增殖水平及肿瘤重量。结果显示,实验组较空白质粒组和空白对照组免疫指标均无明显增高（P〉0.05）,提示肌肉注射Ag85A DNA疫苗不能明显提高荷瘤小鼠免疫功能。     

真核表达编码Ag85A基因重组体的构建

抗原85复合体（Ag85）是BCG合成的能够刺激机体产生细胞免疫和体液免疫的多种成分之一,Ag85A是抗原85复合体组成成分之一,可显著刺激细胞免疫功能增强。为研究经口接种Ag85A的DNA疫苗的免疫效应,根据结核分枝杆菌Ag85A的基因序列自行设计了一对PCR引物,以人型结核杆菌H37Rv标准毒力株的DNA为模板,经过PCR扩增出Ag85A目的基因,纯化PCR产物TA克隆入载体pUCm-T载体,蓝白斑筛选将回收的PCR产物用限制性核酸内切酶Xhol和BamHI双酶酶切后,经T4DNA连接酶作用,与真核表达载体pCDNA3．1^＋连接,筛选得到的阳性克隆经DNA测序鉴定证实为Ag85A基因,且被克隆到载体pCDNA3．1^＋中的CMV启动子的下游,成功构建并鉴定的真核表达载体pCDNA3．1^＋携带Ag85A基因的重组体,命名为pCDNA3．1^＋／Ag85A。将其转化大肠埃希菌并使之大量扩增,并采用无内毒素提取质粒方法收集此重组质粒DNA．即为可经口途径喂饲小鼠的结核杆菌Ag85A的DNA疫苗,为口服DNA疫苗的临床应用研究奠定基础。     

小鼠对结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫反应

目的研究结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫原性。方法将40只BALB/c小鼠随机分成4组,NS组、BCG组、pcDNA-HspX组和pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX组,每组10只。BCG组只在0周时皮内注射卡介苗1次。NS组、pcDNA-HspX组及融合基因组分别于0、2、4周肌肉注射生理盐水和重组质粒DNA,共免疫3次。在免疫的第2周,4周及最后一次免疫后2周检测体血清中的总IgG水平。同时,最后一次免疫后2周,取脾细胞检测细胞免疫反应。结果构建的融合基因重组质粒DNA免疫动物后能产生针对结核杆菌特定抗原的特异性细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性。结论结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因可作为DNA疫苗进行保护作用的研究。     

用小鼠模型分析可溶性表达结核分枝杆菌Ag85A的免疫原性

【目的】可溶性表达结核分枝杆菌Ag85A蛋白,并评价其免疫原性。【方法】利用冷休克表达质粒和含有伴侣质粒的大肠杆菌对Ag85A蛋白进行可溶性原核表达,并进行纯化与鉴定,通过C57BL/6小鼠模型对Ag85A蛋白的免疫原性,包括诱导机体特异性体液免疫应答和细胞免疫应答水平进行分析。【结果】重组菌诱导后裂解上清中检测到可溶性Ag85A蛋白的表达,经过亲和层析纯化收获了纯度在90%以上的Ag85A蛋白,Western blot鉴定显示其具有较好的免疫反应性。Ag85A蛋白免疫小鼠后,血清中可以检测到高水平的Ig G抗体效价,其中Ig G2b水平要高于Ig G1。通过特异性多肽、蛋白刺激脾脏和腹股沟淋巴结细胞可分泌高水平的IFN-γ、TNF-α等Th1型细胞因子。【结论】实现了Ag85A蛋白的可溶性表达,免疫特性评价显示Ag85A蛋白可诱导机体产生强烈的特异性体液免疫应答及Th1型的细胞免疫应答,从而为其进一步免疫学功能的研究奠定了重要基础。     

结核分枝杆菌Ag85A口服脂质体DNA疫苗安全性的初步验证

对重组pcDNA3.1＋/Ag85A DNA阳离子脂质体疫苗的安全性进行初步评价,为临床经口接种DNA疫苗提供理论和实验依据。取质粒存在最丰富的2个部位,即脾、小肠,提取基因组中DNA,并以此为模板进行PCR扩增。分析质粒重组体是否与基因组DNA整合,同时将受试动物实验组与对照组在受试期间体重、食量、一般活动等方面比较;受试小鼠脏器重量与对照组进行比较。结果显示,质粒重组体并未与基因组DNA整合,同时受试动物实验组与对照组之间,无论受试期还是恢复期之间体重、食量、一般活动等方面未见明显改变。受试小鼠脏器重量与对照组相比,无明显差别,从而证明脂质体pcDNA3.1＋/Ag85A DNA未与宿主基因组整合,间接说明pcDNA3.1＋/Ag85A DNA疫苗对免疫动物并没有潜在的致癌作用。     

结核杆菌抗原85A与小鼠白细胞介素21共表达DNA疫苗的构建及其免疫效应研究

目的:利用真核表达质粒pRSC,构建结核杆菌抗原85A(Ag85A)与小鼠白细胞介素21(mIL21)共表达重组体pRSC-mIL21-Ag85A,为研究新型结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。方法:从质粒pcDNA3.1-mIL21中经PCR扩增出mIL21基因,并插入质粒pRSC中构成pRSC-mIL21;再从pIRES-Ag85A质粒中经PCR扩增出Ag85A基因,构建于pRSC-mIL21重组质粒上,成为共表达DNA疫苗pRSC-mIL21-Ag85A。结果:经酶切、基因测序证实,该疫苗构建正确并能成功表达目的基因。共表达DNA疫苗免疫小鼠后,CTL活性、特异性淋巴细胞增殖水平及小鼠血清特异性抗体均呈有意义的提高。结论:结核杆菌Ag85A与mIL21共表达DNA疫苗能诱导小鼠免疫反应,为进一步研究DNA疫苗抗结核杆菌攻击的免疫防护效应奠定了基础。     

用小鼠模型分析表达牛结核分枝杆菌Ag85B重组腺病毒的细胞免疫特性

【目的】构建表达牛结核分枝杆菌抗原Ag85B重组腺病毒rAd-Ag85B,并用小鼠模型分析其细胞免疫特点。【方法】采用PCR方法,扩增结核分枝杆菌Ag85B的编码基因fbpB,测序后构建pDC516-Ag85B重组质粒。利用脂质体将pDC516-Ag85B与pBHGfrtΔE1,3FLP共转染Ad293细胞包装成重组病毒rAd-Ag85B。空斑纯化后用电镜负染、目的基因转录和蛋白表达进行rAd-Ag85B验证。同时将rAd-Ag85B和rAd(wtAd)分别经皮下注射免疫BALB/c小鼠,二免二周后取小鼠脾脏细胞,进行CD69表面分子表达、淋巴细胞增殖和ELISPOT实验分析。【结果】在电镜下能观察到包装的重组病毒粒子,且在转录和蛋白水平上验证了rAd-Ag85B构建成功。免疫试验结果显示,rAd-Ag85B能激活CD4+T和CD8+T细胞表面分子CD69的表达,并引起淋巴细胞增殖。ELISPOT表明rAd-Ag85B呈现Th1免疫特点。【结论】成功构建的rAd-Ag85B能引起机体针对PPD蛋白或Ag85B多肽的Th1免疫应答。     

针对潜伏结核感染的 A39 DNA 疫苗构建及其免疫原性研究

选取结核分枝杆菌潜伏相关抗原Rv2029c、结核分枝杆菌优秀抗原Ag85A和Rv3425,构建针对潜伏感染的结核分枝杆菌DNA疫苗pVAX1／Ag85A-Rv3425-Rv2029c （A39）,并对其免疫原性进行研究。首先用聚合酶链反应（PCR）扩增Ag85A基因,构建重组质粒pVAX1／Ag85A （A）;PCR扩增 Ag85A-Rv3425连接片段,插入pVAX1载体,构建重组质粒pVAX1／Ag85A-Rv3425（A3）;PCR扩增Rv2029c基因,插入A3,构建重组质粒pVAX1／Ag85A-Rv3425-Rv2029c （A39）。将构建成功的重组质粒转入 HEK293T细胞,蛋白免疫印迹法验证质粒在真核细胞中得到表达。在大肠埃希菌BL21中成功表达和纯化去除信号肽的Ag85A、Rv3425和Rv2029c蛋白。用质粒免疫C57BL／6小鼠,共分为5组：PBS、pVAX1、A、A3和A39组,采用电脉冲导入免疫,每2周免疫1次,共3次,用酶联免疫斑点检测（ELISPOT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术等方法检测细胞免疫和体液免疫水平。结果显示,A39免疫小鼠后,能引发强烈的细胞免疫反应﹝γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素2（IL-2）高水平分泌﹞,外周血CD4＋／CD8＋ T细胞比值增加,CD8＋穿孔素＋ T细胞比例增加。结果表明,构建的A39 DNA疫苗能引发强烈的免疫反应,显示出良好的抗结核潜力,可作为结核分枝杆菌新型候选疫苗。     

结核杆菌Ag85B基因疫苗的免疫保护效果研究

为研究结核杆菌Ag85B基因疫苗的免疫原性和免疫保护效果,将雌性C57BL/6N小鼠32只,随机分为4组,即结核杆菌Ag85B基因疫苗组、BCG组、pcDNA3.1( )组和PBS组.取各免疫组小鼠脾细胞培养上清检测细胞因子水平;同时进行CTL杀伤活性检测;进一步用结核杆菌H37Rv国际标准强毒株静脉注射攻击小鼠,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,对小鼠部分肺和脾组织作病理切片,HE染色观察组织病变程度,Z-N染色检查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果.结果表明,结核杆菌Ag85B基因疫苗对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护效果,能够诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,细胞因子IFN-γ和IL-1分泌增加,IL-4分泌减少,CTL特异性活性增加;使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少,组织病变明显减轻.     

结核分枝杆菌Ag85A DNA的克隆与原核表达

抗原85(Ag85)复合体是BCG合成分泌的可刺激机体产生细胞免疫和体液免疫应答。Ag85A是抗原85复合体组成成分之一,可显著刺激细胞免疫功能增强。研究构建了高效表达的pTrcHisB-Ag85A基因重组质粒,并将其转化至大肠埃希菌TOP10中进行重组蛋白的表达,筛选转化物,SDS-PAGE进行蛋白表达的分子量检测,并通过Western Blotting方法,应用抗Ag85A的单克隆抗体进一步确认重组Ag85A蛋白的表达,建立了Ag85A的原核表达体系,为进一步制备出有效的重组Ag85A疫苗奠定基础。     

Differential immunogenicity and protective efficacy of DNA vaccines expressing proteins of Mycobacterium tuberculosis in a mouse model

BALB/c mice were vaccinated three times (2-week intervals) with plasmid DNA separately encoding antigen Ag85B, ESAT-6 or Ag85A from Mycobacterium tuberculosis. The protective efficacy of these DNA vaccines against intravenous M. tuberculosis H37Rv challenge infection was measured by counting bacterial loads in spleen and lung and recording changes in lung pathology. The splenocyte proliferative response to the corresponding antigens and antigen-specific interferon (IFN)-γ secreted by splenocytes of the vaccinated mice were also detected. We found a clear hierarchy of protective efficacies among the three DNA vaccines tested in this study. Plasmid DNA encoding Ag85A provided the strongest protection and showed the least change in lung pathology, followed by plasmid DNAs encoding Ag85B and ESAT-6. However, DNA-85B reduced comparative bacterial load in lung tissue, as did DNA-85A. Compared to the control group, protective efficacies conferred by different DNA vaccines were consistent with the lymphoproliferative responses to the corresponding antigens as well as the secretions of antigen-specific IFN-γ. Our study demonstrates that both Ag85A and Ag85B are the most promising of the candidate antigens tested for future TB vaccine development.     

Ag85ADNA疫苗对荷瘤鼠Th1细胞免疫功能的影响

为了探讨肌肉注射Ag85A DNA疫苗能否在肿瘤宿主,一个低细胞免疫应答的机体内激发Th1型细胞免疫应答,将6~8周龄BALB/c雌性小鼠随机分成实验组(Ag85A-V1Jns.tPA组),空质粒组(V1Jns.tPA组)和生理盐水组3组,将生长旺盛的Meth-A细胞接种于各组小鼠右侧背部皮下,每只小鼠2×105个细胞,1d后于小鼠大腿肌肉内分别注射100μL Ag85A-V1Jns.tPA(1 g/L),V1Jns.tPA(1 g/L)或生理盐水。每10 d 1次,共3次,于末次注射后第8 d,无菌取脾,分离细胞进行培养。检测NK细胞活性以及脾细胞培养上清中IFN-γ含量。结果显示:实验组平均NK细胞杀伤率以及脾细胞培养上清中IFN-γ含量较空质粒组和生理盐水组均显著增高,而空质粒组和生理盐水组之间未见有意义的变化。提示肌肉注射Ag85A DNA疫苗可以提高Meth-A纤维肉瘤荷瘤小鼠Th1细胞免疫功能。     

共表达结核杆菌Ag85A-ESAT-6融合抗原与IL-21核酸疫苗的构建及免疫效果研究

目的：构建结核杆菌Ag85A-ESAT-6融合抗原与细胞因子IL-21共表达核酸疫苗pIRES-IL-21-Ag85A-ESAT-6,研究其对小鼠免疫功能的影响。方法：用PCR方法分别扩增出Ag85A和IL-21编码基因,并先后插入质粒pIRES-ESAT-6中,构成共表达核酸疫苗pIRES-IL-21-Ag85A-ESAT-6;免疫小鼠后,通过CTL和NK细胞杀伤活性和脾细胞增殖试验,以及小鼠血清抗体、IFN-γ和IL-4的检测,评价该核酸疫苗的免疫效果。结果：pIRES-IL-21-Ag85A-ESAT-6核酸疫苗免疫鼠的CTL活性、脾细胞增殖反应、IFN-γ水平及血清抗体产生明显高于对照组,差异有显著性意义。结论：pIRES-IL-21-Ag85A-ESAT-6核酸疫苗能够诱导小鼠产生有效的免疫反应,可作为新型结核疫苗的候选组分。     

Protection of mice with a divalent tuberculosis DNA vaccine encoding antigens Ag85B and MPT64

Tuberculosis (TB) remains to be a major challenge tothe public health in the world. It is estimated that, through-out the world, 15 individuals are affected by TB and 6 ofthem die from it every minute [1]. Drug resistance andcoinfection with HIV, which ut…