采用多种抗原测定静注人免疫球蛋白(pH4)中抗体Fc段生物学活性的初探

目的初步探讨采用多种抗原测定静注人免疫球蛋白(IVIG)(pH4)中抗体的Fc段生物学活性,了解IVIG中抗体的Fc段生物学活性。方法采用补体活化的经典途径中免疫复合物激活补体的方法,将不同浓度的麻疹病毒、风疹病毒、乙肝表面抗原(HBsAg)、破伤风类毒素、脑膜炎球菌P64k外膜蛋白和白喉类毒素6种抗原分别致敏人O型血红细胞形成红细胞-抗原结合物;然后,6种致敏红细胞分别与IVIG孵育,与特异性抗体形成红细胞-抗原-抗体复合物;最后,此复合物与补体反应,在541 nm波长处读取吸光值,并绘制溶血反应动力学曲线,分别计算IVIG中针对上述6种抗原IgG的Fc段生物学活性。采用此方法,用6种抗原致敏的红细胞测定IVIG的Fc段生物学活性10次,验证此方法的重复性。结果麻疹病毒、风疹病毒、HBsAg、破伤风类毒素和脑膜炎球菌P64k外膜蛋白致敏的红细胞分别与供试品和补体反应后,测定的溶血反应动力学曲线较平缓,而白喉类毒素致敏的红细胞与供试品和补体反应后,测定的溶血反应动力学曲线下降明显,呈典型的"S"型曲线。计算结果显示,IVIG中针对此六种抗原的抗体Fc段生物学活性相对于参考品均大于80%。Fc段生物学检测方法重复性较好。结论采用多种抗原分别致敏红细胞,可以用来检测IVIG中多种抗体的Fc段生物学活性,为深入了解IVIG制品中的多种抗体的Fc段生物学活性奠定了基础。     

静注人免疫球蛋白中白喉抗体效价对其Fc段生物学活性检测结果影响的分析

目的分析静注人免疫球蛋白(IVIG)中白喉抗体效价对其Fc段生物学活性检测的影响。方法检测20批IVIG的白喉抗体效价水平和Fc段生物学活性结果,进一步探讨白喉抗体效价与Fc段生物学活性的关系。结果20批IVIG中白喉抗体效价水平均符合中国药典的要求,在3~60 HAU/g之间,其中有两批IVIG的白喉抗体效价水平相对较高,其他18批IVIG的白喉抗体效价水平变化趋势不明显。20批IVIG的Fc段生物学活性均较高,在60%~140%之间。白喉抗体效价水平高者,其Fc段生物学活性并非高,反之亦然。结论 IVIG的Fc段生物学活性与其白喉抗体效价水平无明显的相关性。     

丙种免疫球蛋白Fc段糖基化及其生物学活性和功能

丙种免疫球蛋白是血清中重要的糖蛋白,在IgG Fc的297位天冬酰胺位点存在重要的糖基化,连接的糖链能维持IgG重链构像并调节Fc和FcγR结合能力,异常的糖链改变某些蛋白质的抗原特性,激活补体,介导炎症引起免疫失衡.多种疾病都可能伴有异常糖苷化或因缺少糖苷化酶引起.糖苷的功能结构研究已取得一定进展,进一步研究IgG的Fc段不同糖基化对IgG晶体结构及其生物学功能的影响将有助于设计新型生物制品.本文就近年来丙种免疫球蛋白Fc段糖基化及生物学活性与功能、糖蛋白寡糖链等研究进展作一综述.     

重组腺相关病毒2型/人肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAV2/hTNFR:Fc)的构建和生物学活性研究

为研究腺相关病毒2型载体应用于类风湿性关节炎进行基因治疗的可行性,首先构建携带人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段融合基因的重组2型腺相关病毒(rAAV2／hTNFR：Fc),并对其生物学活性进行研究。以RT—PCR分别从U937和人淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAV1载体质粒进行重组病毒生产,在进行重组病毒理化分析后,以TNFa细胞毒中和试验来研究该重组病毒的生物学活性。结果显示：所构建的重组病毒rAAV2／hTNFR：Fc基因结构与预期一致;病毒在体外感染BHK-21细胞后,含TNFR：Fc融合蛋白的表达上清可以有效中和人、大鼠、小鼠TNFα对L929的细胞毒性。所研究构建的重组腺相关病毒可以用来作为阻断TNFα的手段,进行类风湿性关节炎的基因治疗研究。     

抗体Fc片段特异寡核苷酸配基介导的实时定量免疫PCR

目的:利用小鼠IgG抗体Fc片段高特异、高亲和寡核苷酸配基,构建实时定量免疫PCR检测方法,提高抗体检测的灵敏度。方法:用SELEX技术从随机寡核苷酸文库中筛选抗体Fc片段特异寡核苷酸配基,设计合成信标序列,通过不对称PCR法,制备IgG Fc片段的核酸信标配基分子;32P标记核酸信标配基,采用琼脂糖凝胶阻滞双显色法鉴定核酸信标配基与IgG Fc片段结合的亲和力和特异性;制备IgG Fc特异性寡核苷酸信标配基-抗体复合检测分子,构建小鼠IgG Fc片段特异核酸信标配基介导的实时定量免疫PCR检测方法。结果:制备了IgG Fc片段的核酸信标配基分子;凝胶阻滞放射自显影和考马斯亮蓝二次染色结果显示该核酸信标配基分子与IgG Fc片段具有高度亲和力和活性,而且只与非变性IgG结合,与变性IgG不结合;IgG Fc片段的特异核酸信标配基与IgG结合形成复合检测分子,有效完成了信号传递和实时定量PCR信号放大过程。结论:初步建立了一种全新的核酸信标配基介导的免疫PCR检测方法,可有效提高现有IgG类抗体免疫检测的灵敏度和特异性。     

鱼类Fc受体研究

Fc受体是免疫细胞表面一种重要受体分子,通过与免疫球蛋白Fc段结合触发多种生物学功能,是联系体液免疫和细胞免疫的桥梁。部分硬骨鱼中已经发现了Fc受体,在斑马鱼、斑点又尾鲴和鲤鱼中都克隆到了Fc受体的γ亚基,在鲨鱼和大西洋鲑中证明有能够与免疫球蛋白结合的Fc受体存在,并在斑点叉尾鲴、河豚和虹鳟中存在着类似α亚基的Fc受体。对鱼类Fc受体的发现和研究必将为了解鱼类的免疫机制及免疫进化提供重要的资料。     

IgG Fc糖链与功能的关系及疫苗接种的调节作用

免疫球蛋白G(immunoglobulin G,Ig G)是免疫系统的重要成分,是B细胞产生的糖蛋白,糖基化位点位于Fc段第297位氨基酸天冬酰胺上。糖链组成具有不均一性,末端组分变化可以影响抗体功能,并受多种因素的调节,如疫苗接种可以调节Fc段糖链修饰,进而影响抗体与Fc受体或补体的结合,从而对抗体的功能产生影响。本文就Ig G Fc糖链的组成、糖链与功能的关系、疫苗接种对糖链修饰的调节及对功能的影响作一综述。     

绵羊红细胞的质量对静脉注射用人免疫球蛋白抗补体活性测定的影响

为了分析IVIG抗补体活性测定出现负值与绵羊红细胞质量的关系。采用CH50试验测定IVIG ACA时,在被检样品和其他试验条件相同的情况下,比较了被污染的和未污染的绵羊红细胞对IVIG抗补体活性测定的影响。结果显示,使用被污染的绵羊红细胞(作为试验材料时所得的)检测10份样品ACA(%)均为负值;使用未污染的绵羊红细胞未出现负值。提示被污染的绵羊红细胞干扰了抗补体活性测定,从而引起CH50试验结果出现偏差。     

眼镜蛇毒中一个新的抗补体蛋白的分离纯化和性质研究

免疫性疾病、急性肺损伤、缺血再灌注损伤等病征的发生与补体异常激活密切相关。抗补体药物研究是新药开发的热点之一。本研究旨在从中华眼镜蛇毒中发现并分离纯化获得新的抗补体活性蛋白质,并对其理化性质和生物学活性加以研究。在抗补体活性追踪的指导下,采用蛋白质层析技术对眼镜蛇毒进行分离纯化;利用MALDI-TOF-MS、SDS-PAGE和葡聚糖凝胶过滤法测定目标蛋白质的纯度及分子量;等电聚焦凝胶电泳法测定其等电点;采用Edman降解法测定目标蛋白质的N-端氨基酸序列;测定目标蛋白质对补体经典途径和旁路途径的抑制活性以及可能的机制;采用MTT法和SRB法检测目标蛋白质对肿瘤细胞的杀伤作用;测定目标蛋白质对多种来源红细胞的溶血活性;采用KB平板扩散法检测抗菌活性。结果表明,通过SP Sephadex C-25阳离子交换层析和RP-HPLC C18反相层析,从中华眼镜蛇毒中分离纯化获得一个均一的抗补体蛋白质,将其命名为CTX-CI。还原性SDS-PAGE测得CTX-CI的表观分子量为12.7 kD,凝胶过滤法测得分子量为9.7 kD,MALDI-TOF-MS测得精确分子质量为7.0 kD;变性条件下测得CTX-CI的等电点为9-81;N-端氨基酸序列为LKCH。相关活性测定结果表明,CTX-CI能有效抑制人血清补体经典途径,其IC50为0.046 g/L,但对补体旁路途径无明显抑制作用;机制研究表明,CTX-CI能抑制补体经典途径C3转化酶的形成。同时,CTX-CI对肿瘤细胞株A549、K562和MCF-7细胞表现出抑制作用,其IC50分别为0.32 g/L、0.58 g/L、0.63 g/L;对豚鼠红细胞有轻微的溶血作用;能抑制枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的生长。综上所述,本研究从中华眼镜蛇毒中分离纯化出一个新的抗补体蛋白质CTX-CI,其理化性质和生物学活性表明其属于细胞毒素,CTX-CI能明显抑制补体经典途径,其机制与抑制经典途径C3转化酶的形成有关。     

静脉注射人免疫球蛋白中IgG含量的测定方法的比较

目的:对IgG的检测方法———紫外分光光度法和免疫单扩散方法进行比较。方法:采用紫外分光光度法和免疫单扩散法对样品进行IgG含量测定,然后对结果进行分析。结果:两种方法测定的结果差异无显著性(P>0.05)。紫外分光法操作更方便、快捷,准确。     

两种HSV-1及猴B病毒相关抗体测定方法的比较

目的以人单纯疱疹病毒（HSV-1）做为抗原,利用空斑法和IFA法比较猴BV和人HSV-1阳性血清两种不同血清的中和能力的差异,建立一种实用、准确、可靠的病毒毒力的检测方法。方法首先,将HSV-1病毒悬液作连续的10倍稀释,取1 mL接种于已经长成单层的Vero-E6细胞上,用1%甲基纤维素覆盖,待其出现蚀斑后计数,算出病毒悬液中每毫升所含蚀斑单位,即滴定出HSV-1的TC ID50。同时,用免疫荧光方法（IFA）对猴和人疱疹阳性血清进行滴定,得到其血清的效价。其次,用滴定出的病毒液分别与两种阳性血清体外中和后,接种到单层的Vero-E6细胞上,用1%甲基纤维素覆盖,待其出现蚀斑后计数。最后,计算出其蚀斑减少率。结果用1%甲基纤维素作覆盖层的蚀斑数量平均为10-5PFU,能形成115-116个/mL蚀斑,形状呈黍米大小的规则圆形,其蚀斑边缘清晰。IFA滴定的人HSV-1阳性血清与猴BV阳性血清的中和抗体均为1∶80。人HSV-1和猴BV两种阳性血清的空斑减少率均为100%。结论确定了利用1%甲基纤维素做为覆盖层可得到清晰可靠的蚀斑,由此方法检测到用人HSV-1可以代替猴B病毒,筛查猴B病毒抗体。且为将来进行药物筛选和中和实验中利用病毒空斑法建立方便、可靠的方法。     

人免疫球蛋白中肠道病毒71型中和抗体效价的测定

采用经典微量细胞病变法,应用近两年分离自中国手足口病(HFMD)高发区的3株肠道病毒71型(EV71)病毒株,对中国不同血液制品厂家生产的35批人免疫球蛋白制品进行抗-EV71中和效价检测。结果显示,3株不同EV71病毒株间的抗-EV71中和效价差异均在4倍以内,差异无显著的统计学意义(F=2.323,P0.05)。根据这3株毒株检测结果判定,35批人免疫球蛋白的抗-EV71均为阳性,肌肉注射用免疫球蛋白(简称肌丙)的抗-EV71-GMTs(525.9)显著高于静脉注射用免疫球蛋白(简称静丙)的GMTs(252.3,F=66.518,P0.01)。30批静丙的抗-EV71-GMTs中和效价分布在128.0~384.0之间。应开展原料血浆中抗-EV71中和效价的筛选,研制高效价的EV71特异性免疫球蛋白制品,用于HFMD的治疗和预防。     

金溶胶基底的 SERS 增强效果的实验研究

本文以结晶紫作为探针分子,研究了以金溶胶膜、pH ＝6以及 pH ＝13的金溶胶溶液为活性基底的表面增强拉曼光谱的增强效果。采用化学还原法制备金溶胶,加入氢氧化钠改变其 pH 值,并以自组装法制备金溶胶膜。通过比较金溶胶膜、pH ＝6及 pH ＝13时金溶胶溶液的增强因子以及在这三种金溶胶基底上结晶紫的检测限,分析不同活性基底增强效果的差异。三种活性基底的增强因子分别可达到5．9×103、1．5×105、2．3×107,pH ＝13的金溶胶溶液有最佳的增强效果。以这三种金溶胶为基底对结晶紫进行表面增强拉曼光谱探测,可得到检测限为70．7 nmol／L、9．6 nmol／L、1．8 nmol／L。结果表明,金溶胶溶液的增强效果明显优于金溶胶膜,而通过改变金溶胶体系的 pH 值可以改变金纳米颗粒的聚合程度及对探测物的吸附特性从而获得更高灵敏度的活性基底。     

大鼠IgA肾病模型的建立及血清中IL-6、FN、NO的检测

目的建立大鼠IgA肾病（IgAN）模型,测定大鼠血清中的白介素-6（IL-6）、纤维结合蛋白（FN）、一氧化氮（NO）,探讨这些指标水平的变化与IgAN免疫损伤的相关性,为临床治疗提供动物实验研究依据。方法24只大鼠被随机分成3组,每组8只。模型组和治疗组用免疫复合物法复制;正常对照组用生理盐水。10周后,治疗组大鼠被给予雷公藤多甙片3周。留取所有大鼠血清测定IL-6、FN、NO;留取所有大鼠尿液测定红细胞（RBC）、总蛋白量（TPR）;留取所有大鼠肾组织作病理学检查。结果模型组中大鼠尿液中RBC、TPR含量较治疗组及正常对照组显著增高（P〈0．01）;血清中的IL-6、FN的水平较治疗组及正常对照组显著增高（P〈0．01）;血清中的NO水平较治疗组及正常对照组显著降低（P〈0．01）。治疗组的大鼠肾组织病理损伤程度较模型组明显减轻（P〈0．01）。结论血清中的IL-6、FN及NO的水平与RBC数、TPR及肾组织病理损伤程度相关,它们可作为观察IgAN治疗效果的重要指标,也可作为IgAN严重性的预测指标。下调血中的IL-6、FN及上调NO的水平,可减少IgA与FN免疫复合物的形成,从而改善肾组织的免疫损伤。     

益气活血中药复方对CVB3大鼠心肌细胞感染模型ATP6基因表达的影响

目的：研究益气活血中药复方对CVB3大鼠心肌细胞感染模型ATP6（ATP synthase F0 subunit 6）基因表达的作用机制。方法：本实验用新生2-3dWistar大鼠心肌细胞,建立CVB,病毒感染模型,通过改良的抑制性消减杂交技术（SSH）,克隆了受CVB,攻击的心肌细胞中被中药（益气活血中药复方）调控的基因。结果：ATP6基因,在中药组中高表达,而病毒组中表达减弱或抑制。结论：益气活血中药复方能影响受CVB,病毒攻击的宿主细胞ATP6基因的表达,有效保护心肌、阻断病程进度,从而实现治疗病毒性心肌炎的目的。     

Determination of Fc function with frozen red blood cells.

The Fc function of immunoglobulins is commonly determined by an assay based on monitoring immunoglobulin induced, complement mediated red cell lysis. This assay requires a continuous source of fresh red cells. We have shown that the assay can be successfully performed with frozen red cells. The possibility of access to a stored standard stock of red cells will improve the convenience of performing the assay and could contribute to improved assay reproducibility.     

Both the Fab and Fc domains of IgG are essential for ROS emission from TNF-α-primed neutrophils by IVIG

Intravenous immunoglobulin (IVIG) is currently a very important therapeutic used for not only infectious diseases, but also for autoimmune diseases such as idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP). Untoward reactions of IVIG have been thought to result from complement activation by aggregated IgG in IVIG. In addition, the aggregates have been known to activate neutrophils, which may result in the untoward reactions. However, the effect and mechanism of IVIG on neutrophils remain unclear. In this study, we investigated the activation of neutrophils by IVIG in terms of their reactive oxygen species (ROS) emission to elucidate the mechanisms. IVIG-induced ROS emission from purified neutrophils was remarkably augmented by TNF-α priming of the cells. The ROS emission from TNF-α-primed neutrophils occurred by activation with whole gammaglobulin (GG) molecules, but not F(ab')(2), Fc, or a mixture of F(ab')(2) and Fc. ROS emission by GG was inhibited by the F(ab')(2) fragment and an inhibitory antibody against FcγRIII. These results suggest that binding of IVIG to not only surface antigen(s), but also FcγRIII on neutrophils, is involved in IVIG-induced ROS emission from TNF-α-primed neutrophils, and contribute to the untoward reactions of IVIG.     

High dose intravenous immunoglobulin repertoire versus anti-D. Disproportions in quantity and quality.

Here we consider certain therapeutic effects that intravenous administration of pooled high dose immunoglobulin and anti-D IgG share. Despite million-fold difference in doses such an effect occurs at least in idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP). We postulate that spontaneous bleeding events may remit even when platelet numbers show refractoriness. We also mention the possible sparing of anti-D antibody-coated red blood cell (RBC) destruction and, finally, an acceleration of fibrotic involution. Fc receptors (FcRs) play a central role; beyond the well-established interactions with the immunoglobulin Fc fragment, FcRs are supposed to display special cognitive properties that enable them to pick out the therapeutic molecules from the recipient's IgG pool. Such subtle selection suggests some disarray in the host. On the other hand it may explain why the often-encouraging outcome of IVIG therapy remains unpredictable.