HeLa细胞中与组织型转谷氨酰胺酶相互作用蛋白质的筛选

组织型转谷氨酰胺酶 (tissuetransglutaminase ,tTG ,TGII)是转谷氨酰胺酶家族成员之一 ,多数细胞凋亡过程中均有tTG表达水平的升高。为研究tTG在细胞凋亡过程中发挥作用的机制 ,利用Gal 4酵母双杂交系统筛选了HeLa细胞中与tTG相互作用的蛋白质 ,获得了 17个阳性酵母克隆。序列测定显示其中 1个克隆所含cDNA序列编码TIA 1相关蛋白 (TIA 1 relatedprotein ,TIAR )C端 12 9个氨基酸残基序列 ,GST下拉 (pull down)实验也证实tTG与TIAR能相互作用 ,而且这种相互作用需要Ca2 参与作用。这些结果提示tTG可能通过其Ca2 依赖的转谷氨酰胺活性对TIAR进行修饰从而影响TIAR的功能 ,可能在细胞凋亡中发挥着一定的作用。     

重组水疱性口炎病毒疫苗的研制现状

水疱性口炎病毒引起的水疱性口炎是一种人兽共患病。该病毒可刺激感染的宿主产生细胞、体液和黏膜免疫应答,是一种有希望的疫苗载体,可表达病毒、细菌和寄生虫的多种蛋白。以水疱性口炎病毒为载体的病原体疫苗包括埃博拉病毒(rVSV-GP)、马尔堡病毒(rVSV-G)、Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(rVSV-env/gag)、猴免疫缺陷病毒(rVSV-Gag)、猴逆转录病毒2型(rVSV-env)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(rVSV-St19)、猪流行性腹泻病毒(rVSVSt19)、呼吸道合胞病毒(rVSV-G/F)、尼帕病毒(rVSV-G/F)、拉沙病毒(rVSV-GPC)、淋巴细胞脉络膜炎病毒(rVSVGP)、柯萨奇病毒B3型(rVSV-VP1)、肠道病毒71型(rVSV-VP1)、口蹄疫病毒(rVSV-VP1)、人乳头瘤病毒16型(rVSV-E7)、棉尾兔乳头瘤病毒(rVSV-L1/E7)、汉坦病毒(rVSV-GPC)、辛诺柏病毒(rVSV-GPC)、安第斯病毒(rVSVGPC)、克里米亚-刚果出血热病毒(rVSV-GPC)、巨细胞病毒(rVSV-gB)、单纯疱疹病毒2型(rVSV-gD)、禽流感病毒(rVSV-HA/NP)、乙型肝炎病毒(rVSV-MS)、基孔肯雅病毒(rVSV-E2)、诺如病毒(rVSV-VP1)、蓝舌病毒8型(rVSVVP2)、博尔纳病病毒(rVSV-GPC)、牛痘病毒(rVSV-L1R/B5R)、结核分支杆菌(rVSV-Ag85A/TFP846)、溃疡分枝杆菌(rVSV-Mu13720)、鼠疫耶尔森菌(rVSV-LcrV)和曼氏血吸虫(rVSV-SmHSP70)等,本文将综述这些水疱性口炎病毒介导的病原体疫苗的研制现状。     

TMPRSS2重组蛋白阻断SARS-CoV-2假病毒的感染

为了探究Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(type II transmembrane serine protease, TMPRSS2)重组蛋白阻断严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)侵染宿主的能力,在体外构建假病毒感染细胞的体系,使用SARS-CoV-2 S (spike glycoprotein)蛋白携带水疱性口炎病毒(ΔG-VSV/荧光素酶)感染细胞,利用293F细胞体外纯化酶活及自身剪切位点突变的TMPRSS2重组蛋白,发现纯化的剪切位点R255Q和酶活位点S441A双突变的TMPRSS2重组蛋白,能够有效降低S蛋白与宿主细胞表面TMPRSS2的结合,进而阻断SARS-CoV-2假病毒对Calu3肺癌细胞系的感染。实验结果表明,使用突变的TMPRSS2重组蛋白竞争性结合病毒的刺突蛋白S,同抑制TMPRSS2蛋白酶的活性一样,都能阻断S蛋白的切割活化,抑制病毒与宿主细胞的膜融合,最终达到阻止病毒入侵的目的,这为阻断SARS-CoV-2感染提供了新的潜在靶点和思路。     

水稻矮缩病病毒粒子装配模型

水稻矮缩病病毒(RDV)具有多种蛋白质和RNA构成的核衣壳结构, 但是特异性的RNA与蛋白质、蛋白质与蛋白质之间的相互作用和结合, 即有关病毒粒子的装配机理还没有完全阐明. 从细胞内和细胞外两个研究层次详细研究了RNA与蛋白质相互结合情况, 研究发现, P7蛋白能特异并牢固地与RDV基因组的全部12条双链RNA结合; 推定为RNA聚合酶的P1蛋白、鸟苷酰转移酶的P5蛋白和P7蛋白被包裹在病毒核内, 根据体外结合实验, 它们能与病毒转录产物mRNA结合; 从病毒感染的组织中能够提取得到完整的、有感染活性的病毒粒子, 以及缺失P1, P5, P7蛋白和基因组双链RNA, 没有感染活性的空壳病毒粒子; 在病毒粒子中P7蛋白能够与P1蛋白和P3内衣壳蛋白形成蛋白复合物. 这些结果揭示了RDV病毒粒子装配的一种可能的模型, 即核心蛋白和病毒mRNA首先相互结合形成一个整体, 以筛选和富集病毒RNA, 接着包装成为完整的、具有感染活性的病毒粒子.     

PCBP1在基因表达过程中的功能和作用机理

Poly（C）-binding protein 1 （PCBP 1）是一种RNA结合蛋白,其蛋白质相对分子质量约为38000。PCBP1含三个KH（hnRNP K homology）结构域,这些结构域对其结合RNA有重要作用。PCBP1的功能主要是参与基因转录及转录后调节,如前体mRNA的剪切、mRNA稳定性、mRNA翻译过程的沉默或增强等。本文主要对PCBP1参与的信号通路以及与人类疾病的关系进行综述,试图阐明PCBP1的生物学功能和作用机理。     

乳杆菌DM9811发酵液提取物中RNA组分对水泡性口炎病毒抑制作用研究

目的通过乳杆菌DM9811发酵液提取物中RNA组分对水泡性口炎病毒(VSV)抑制作用研究,探讨其在抵抗肠道病毒性感染性疾病方面的作用。方法应用50%细胞感染计量法(TCID50)、免疫荧光法、ELISA和MTT法探讨不同浓度的RNA组分对VSV的抑制作用。结果 RNA组分200μg/mL浓度时与对照比较,RNA组分具有竞争性抑制VSV感染作用,细胞存活率为(90.9±3.67)%,并具有阻断VSV侵入细胞作用,细胞存活率为(96.6±1.47)%。但RNA组分对病毒生物合成的抑制作用不明显。此外RNA组分具有诱导BALB/c小鼠脾细胞产生IFN-α作用,并呈现一定的剂量依赖关系。结论乳杆菌DM9811发酵液提取物中RNA组分对VSV具有明显抑制作用。     

表达猪瘟病毒E2蛋白的BacMam病毒的构建及其免疫原性分析

含具有哺乳动物细胞活性的启动子的重组杆状病毒(BacMam病毒)可有效转导多种哺乳动物细胞,并被广泛用于开发新型非复制型载体疫苗．将水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)基因插入多角体启动子下游,得到经修饰的杆状病毒转移载体,将对虾白斑综合症病毒(WSSV)ie1启动子控制下的猪瘟病毒E2基因表达盒插入此载体中,构建了BacMam病毒BacMam/G-ie1-E2,以其感染Sf9细胞和转导HeLa细胞,通过间接免疫荧光试验和Western blot分析检测E蛋白的表达,同时用BacMam病毒直接免疫小鼠,用检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法检测免疫小鼠血清抗体,用基于CFSE和WST-8的淋巴细胞增殖试验评价其细胞免疫应答．结果显示,BacMam/G-ie1-E2能同时在昆虫细胞和哺乳动物细胞中高效表达E2蛋白,免疫小鼠能诱导产生针对猪瘟病毒的特异性抗体,免疫小鼠脾细胞经猪瘟病毒刺激后能诱导特异性的淋巴细胞增殖．这表明,由BacMam病毒介导的基因转移有望用于开发针对猪瘟病毒的非复制型载体疫苗．     

鸡γ干扰素成熟蛋白基因的表达及其产物抗病毒活性测定

以血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆出鸡γ干扰素成熟蛋白的基因,把它与非融合表达载体pRLC相重组.通过对阳性宿主菌的不同时间的诱导摸索出最佳表达时间.把表达产物进行变性,复性,纯化后加入鸡胚成纤维细胞上,用水疱性口炎病毒进行攻毒,测出鸡重组γ干扰素的活性单位为1.0×106U/mL,获得了满意结果.     

鸡γ干扰素成熟蛋白基因的表达及其产物抗病毒活性测定

以血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆出鸡干扰素成熟蛋白的基因,把它与非融合表达载体pRLC相重组。通过对阳性宿主菌的不同时间的诱导摸索出最佳表达时间。把表达产物进行变性,复性,纯化后加入鸡胚成纤维细胞上,用水疱性口炎病毒进行攻毒,测出鸡重组干扰素的活性单位为1.0?06U/mL,获得了满意结果。     

辛酸盐灭活静注人免疫球蛋白中脂包膜病毒效果验证的研究

选用不同核酸类型的脂包膜病毒,其中RNA病毒为水疱性口炎病毒(VSV),DNA病毒为伪狂犬病毒(PRV),将两种指示病毒分别用于验证一定浓度的辛酸盐对某一厂家生产的人血静脉注射用丙种球蛋白(IVIG)的病毒灭活效果。结果表明,液体IVIG在辛酸钠(0.7±0.2mmol/g蛋白)、pH(5.1±0.1)、29.5~30.5℃,孵放90min可灭活VSV和PRV,两种指示病毒的灭活效果分别为≥4.00~4.12和≥5.25~5.75log TCID50/0.1ml。因此,辛酸盐是一种安全、有效、快速的灭活脂包膜病毒的灭活剂。     

HCV 1a／1b型嵌合体能在HepG2细胞内复制与表达

采用HCV 1a／1b嵌合体cDNA构建表达质粒转染HepG2细胞,以免疫组化和Westem blotting检测HCV蛋白表达,RT-PCR检测HCV正、负链RNA,研究丙型肝炎病毒(HCV) 1a和1b型嵌合体全长cDNA在HepG2细胞中的复制和表达。结果证明,转染细胞中检测到分子量约70kDa的HCV NS3蛋白,转染细胞连续传20代,仍能检测到HCV正、负链RNA。表明该HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达,HCV1b型的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)可以起始含1a型非编码区的病毒复制。HCV5′端非翻译区第11、12、13、34和35位核苷酸改变可不影响其与核糖体结合。3′非翻译区9400,9403和9407位核苷酸改变,9435位缺失“A”,9409,9410位及9495,9496,9497位分别插入“TT”和“AAT”可不影响RdRp的生物活性。本研究对阐明HCV复制和翻译机制有重要意义。     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白的研究进展

核衣壳蛋白(N蛋白)是SARS冠状病毒(SARS-CoV)的结构蛋白,与病毒RNA结合形成核衣壳,是主要的抗原分子。最近的亚定位研究表明,它主要定位到细胞质,核仁内也有较少的分布。SARS-CoVN蛋白参与SARS-CoVRNA合成的调控以及核衣壳的形成,并能结合人亲环素(hCypA)解离病毒核心,激活AP-1信号转导途径,类泛素蛋白化干扰宿主细胞分裂,在缺乏生长因子的情况下诱导细胞凋亡。     

HCV 1a/1b型嵌合体能在HepG2细胞内复制与表达

采用HCV 1a/1b嵌合体cDNA构建表达质粒转染HepG2细胞,以免疫组化和Western blotting检测HCV蛋白表达,RT-PCR检测HCV正、负链RNA,研究丙型肝炎病毒(HCV)1a和1b型嵌合体全长cDNA在HepG2细胞中的复制和表达.结果证明,转染细胞中检测到分子量约70 kDa的HCV NS3蛋白, 转染细胞连续传20代, 仍能检测到HCV正、负链RNA.表明该HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达,HCV 1b型的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)可以起始含1a型非编码区的病毒复制. HCV 5′端非翻译区第11、12、13、34和35位核苷酸改变可不影响其与核糖体结合.3′非翻译区9400,9403和9407位核苷酸改变,9435位缺失"A",9409,9410位及9495,9496,9497位分别插入"TT"和"AAT"可不影响RdRp的生物活性.本研究对阐明HCV复制和翻译机制有重要意义.     

TAR RNA结合蛋白在HIV-1感染中的作用

TARRNA结合蛋白是细胞中双链RNA结合蛋白家族成员之一.它可以结合HIV-1TARRNA,并与Tat协同作用激活LTR表达,进而促进病毒的转录与翻译.TRBP也是将干扰素抗病毒通路与RNA干扰免疫通路相连的一种细胞蛋白.在干扰素诱生的PKR反应中,TRBP通过直接抑制PKR的自磷酸化、与PKR竞争通用的RNA底物或与PACT形成异源二聚体等机制抑制细胞内的PKR反应,从而降低了PKR介导的对病毒表达的抑制作用.TRBP与Dicer和Ago2等组成的RNA诱导沉默复合体,在RNA干扰中发挥着关键作用并调控随后的序列特异性降解.在HIV-1感染中,TRBP更倾向于促进病毒的表达与复制,因此TRBP也成为控制HIV-1感染的新靶点.     

干扰YAP1对食管癌Eca-109细胞生物学功能的影响

该文研究Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)对Eca-109细胞生物学功能的影响。构建针对YAP1基因的sh RNA慢病毒载体,转染Eca-109细胞,采用q PCR和蛋白印迹法检测转染前后Eca-109细胞中YAP1 m RNA和蛋白以及P53蛋白的表达情况;流式细胞仪检测细胞周期、凋亡情况;CCK-8实验检测细胞的增殖情况变化。结果显示,慢病毒转染组细胞内YAP1 m RNA和蛋白表达量低于空白对照组和空病毒转染组,p53基因表达量高于空白对照组和空病毒转染组;Eca-109细胞增值率从第3 d开始低于对照组(P0.05);慢病毒转染组细胞G1期比例增高(P0.05),早期凋亡率增加(P0.05),以上差异均有统计学意义。结果表明,干扰YAP1可诱导Eca-109细胞凋亡,降低Eca-109细胞的增殖能力,且其抗凋亡的作用可能部分与p53基因相关。     

Scirpusin A和scirpusin B体外抗人类免疫缺陷病毒1型的作用

Scirpusin A和scirpusin B是从药用植物中发现的2种天然茋类二聚体,具有一定的抗病毒效应。本研究利用人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)包膜和水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜的HIV假病毒及实验室适应株HIV-1ⅢB,在体外评价2种药物的抗病毒效果并初步探讨其作用机制。研究发现,scirpusin A和scirpusin B不仅能在体外有效抑制HIV假病毒感染TZM-bl细胞(一种HIV-1易感细胞),还能抑制实验室适应株HIV-1ⅢB。Scirpusin B的作用优于scirpusin A。对实验室适应株HIV-1ⅢB,scirpusin B的半数抑制浓度(IC50)为1.33μmol/L,scirpusin A的IC50为4.77μmol/L。此外,scirpusin A和scirpusin B还能抑制VSV-G包膜假病毒,提示其作用可能与病毒在细胞内的复制过程相关。Scirpusin A在病毒进入细胞后仍可发挥抑制作用,但具体机制尚待深入研究。     

结构域B在鼠冠状病毒S蛋白的抗原性及膜融合中的作用

棘突(spike, S)蛋白是冠状病毒表面必不可少的跨膜糖蛋白,在病毒进入宿主细胞时具有结合受体和诱导膜融合的双重作用。大部分冠状病毒S蛋白的受体结合域位于S1-CTD(即相对应的结构域B),而经典的乙型冠状病毒模型鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus, MHV)的受体mCEACAM1a与S1-NTD(即相对应的结构域A)结合,其结构域B的作用仍未完全清楚。本研究通过构建结构域B和S2膜融合元件的缺失突变体,并使其在鼠神经母细胞瘤细胞系Neuro-2a内成功表达,证实了结构域B对病毒S蛋白导致的细胞-细胞间膜融合是必需的。用不同方法处理的病毒颗粒作为抗原免疫小鼠,所获得的多克隆抗体进一步显示,结构域B不但是S蛋白的主要抗原决定簇,而且能诱导中和抗体明显抑制病毒感染和S蛋白介导的膜融合作用。此结果为阐述不同冠状病毒的致病性与感染性差异提供了新思路。     

沉默FBI-1基因对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响

本研究旨在观察短发夹状RNA (short hairpin RNA, shRNA)介导的人类免疫缺陷病毒短转录诱导物连接因子1 (FBI-1)基因沉默对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响。用qRT-PCR和Western blot分别检测FBI-1、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3和Survivin的mRNA和/或蛋白的表达水平;采用shRNA干扰技术沉默MDA-MB-231细胞中FBI-1基因的表达;用CCK-8法以及克隆形成实验检测细胞增殖;用流式细胞术检测细胞凋亡;用裸鼠皮下成瘤实验检测细胞的成瘤能力。结果显示,MDA-MB-231细胞的FBI-1 mRNA和蛋白的表达水平明显高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A;经shRNA靶向沉默FBI-1基因表达后,细胞增殖能力明显降低,细胞凋亡率显著增高,伴随Bcl-2和Survivin蛋白表达明显下调、Bax蛋白表达显著上调和Caspase 3活化,MDA-MB-231细胞的裸鼠皮下成瘤能力受抑制。以上结果提示,靶向沉默FBI-1基因表达可以抑制MDA-MB-231细胞增殖,诱导细胞凋亡并抑制细胞的裸鼠皮下成瘤能力。     

猪γ干扰素的表达及其抗病毒活性的安全检测

为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性,本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒(VSV△G*G)为指示病毒,分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素(PoIFN-γ)在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示:由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性,其抗病毒活性为105IU/mL,原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性,其抗病毒活性为32IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒(VSV*GFP)所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致,表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品,使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。