Kras突变基因真核表达载体的构建及在不同肝细胞株中的表达

目的：构建携带突变Kras基因,以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告基因的重组真核表达载体,并导入两种不同的肝细胞株中表达。方法：PCR扩增突变Kras目的基因,将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。并利用脂质体转染人肝癌细胞株Huh7．5和鸡肝癌细胞株LMH,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察Kras-EGFP融合蛋白在细胞中的表达;用WesternBlotting方法验证Kras蛋白水平的表达。结果：酶切和测序证实pEGFP—N1-Kras重组质粒构建正确,将EGFP报告基因融合在突变的Kras基因的3’端;在Huh7．5和LMH中均观察到了绿色荧光,转染率分别为19％和53％;WesternBlott—ing也检测到融合蛋白的表达。结论：通过基因克隆方法成功构建了pEGFP—N1-Kras重组质粒载体,并且在Huh7．5和LMH中均稳定表达,为下一步筛选针对突变Kras基因的靶向药物奠定了基础。     

杆状病毒转移载体的构建及绿色荧光蛋白在斜纹夜蛾幼虫中的表达

为构建斜纹夜蛾核型多角体病毒 （SpltMNPV）的重组病毒,以该病毒日本C3株基因组DNA为PCR扩增模板,根据GenBank SpltMNPV中国G2株基因序列,设计了两对引物分别扩增多角体蛋白基因的5′端侧翼序列（含启动子）和3′端侧翼序列（含终止子）,将这两个片段依次克隆于pUC18质粒载体后,再将绿色荧光蛋白(GFP)基因亚克隆到上述载体的多角体蛋白基因启动子和终止子之间,获得转移载体pSplt-gfp。将pSplt-gfp与野生型SpltMNPV 基因组DNA共转染Spli细胞,通过同源重组和有限稀释法筛选,获得了以gfp基因替代多角体蛋白基因的重组病毒SpltMNPV-gfp。SpltMNPV-gfp感染Spli细胞和斜纹夜蛾幼虫,分别在感染24h和48h后可发现绿色荧光蛋白的表达。该重组病毒的获得,为建立斜纹夜蛾核型多角体病毒表达体系奠定了基础。     

大鼠大麻素Ⅰ型受体绿色荧光融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠大麻素型Ⅰ受体绿色荧光融合蛋白真核表达载体并观察其在细胞中的表达。方法:大鼠CB1基因序列设计引物,以大鼠脑组织为模板扩增CB1基因编码区片段,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N3中,构建重组融合蛋白表达载体pCB1-EGFP。将pCB1-EGFP质粒转染HeLa细胞,通过观察EGFP报告基因的表达以及免疫荧光,Western Blot方法鉴定CB1可在真核细胞中过表达情况。结果:构建重组融合蛋白表达载体pCB1-EGFP,单双酶切和测序验证正确。将pCB1-EGFP质粒转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察到融合表达的绿色荧光蛋白,且呈胞膜表达。免疫荧光试验也证明重组载体转染后,CB1基因和GFP共同定位于胞膜部分。Western Blot实验证明表达CB1蛋白。结论:成功构建了高表达的CB1-EGFP融合蛋白真核表达载体。     

copGFP和PuroR双标记基因慢病毒融合表达载体的构建及应用*

目的: 构建具有绿色荧光蛋白(copGFP)和嘌呤霉素抗性基因(PuroR)融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体,检测其嘌呤霉素抗性和绿色荧光蛋白表达的特性。方法: 从pCDH-CMV-MCS-copGFP载体中扩增copGFP编码区DNA序列,从pLKO.1载体中扩增Puro^R编码区DNA序列,运用重组PCR方法,扩增copGFP与Puro^R基因融合编码序列并克隆至经BamH Ⅰ+Sal Ⅰ双酶切的pCDH-CMV-MCS-copGFP载体片段中,构建含copGFP和Puro^R融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体;载体的融合标签序列进行测序确证;将该载体用辅助包装质粒PLP1、PLP2、VSVG在293T细胞中包装成慢病毒后感染肝癌细胞MHCC97H,检测感染细胞对嘌呤霉素的抵抗作用以及绿色荧光蛋白的表达情况;为验证该载体表达外源目的基因的有效性,将Sp1编码区DNA序列插入该载体中包装成慢病毒,用对照及表达Sp1的慢病毒感染肝癌细胞MHCC97H,感染细胞经1 mg/ml嘌呤霉素筛选7 d后获得稳定感染细胞株,提取稳定感染细胞的总RNA及总蛋白,分别运用RT-qPCR和Western blot方法检测Sp1在对照及表达Sp1的慢病毒感染的肝癌MHCC97H细胞中的mRNA和蛋白表达水平的差异。结果: 成功构建含copGFP和Puro^R融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体;该载体与辅助质粒包装出的慢病毒感染肝癌细胞后,感染细胞同时具有嘌呤霉素抗性和表达绿色荧光蛋白特性;将Sp1编码序列插入该载体,包装慢病毒并肝癌细胞,Sp1 的mRNA水平对照细胞相比分别升高3.3倍,蛋白水平升高2.2倍(P＜0.01)。 结论: 成功构建含copGFP和Puro^R融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体,该载体编码的融合双标记基因具有嘌呤霉素抗性和绿色荧光蛋白表达的特性,可高水平表达长片段的目的基因。     

大鼠miR-126慢病毒表达载体的构建及其在肝星状细胞中的表达

目的：肝星状细胞（hepaticstellatecell,HSC）激活并发生表型改变是肝纤维化形成的关键,本实验期待通过构建慢病毒mo—miR．126,并体外转染Hsc,为研究miR．126在肝纤维化中的作用奠定实验基础。方法：PCR扩增miR-126的前体,构建miR．126的重组表达载体pCDH．CMV-MCS．EFl．copGFP-miR．126,脂质体法转染包装细胞293TN细胞,包装产生慢病毒,以293TN细胞绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）的表达水平测定病毒滴度,构建重组慢病毒（Lentivims,LV）载体（Lv．miR．126）,体外转染活化的HSC．T6,荧光显微镜观察荧光阳性细胞百分率,real—timePCR检测miR一126转入水平。结果：经PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建携带大鼠miR一126基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293TN呈绿色荧光,并测得滴度108〉ifu／ml。荧光显微镜下HSC的荧光阳性率在95％以上。Real—timePCR检测证实miR-126转染后获得了较高的表达。结论：成功构建大鼠慢病毒载体Lv—miR-126,并可在体外高效稳定表达,为本研究后续对miR-126靶点验证和功能研究奠定实验基础。     

绿色荧光蛋白基因TuMv病毒表达载体的构建

本研究通过设计引物进行PCR扩增得到绿色荧光蛋白GFP基因,将PCR产物酶切以后与芜菁花叶病毒表达载体相连,得到的阳性克隆通过多对引物组合进行PCR验证及序列测定,说明GFP基因已经连接到该病毒表达载体中,而且没有发生碱基误配及错配。该GFP表达载体的构建为进一步利用TuMv的全长cDNA侵染性克隆进行外源基因的转化奠定了基础。     

基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成中多位点缺失突变的校正方法

目的:建立一种PCR方法,以快速校正基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的多位点缺失突变。方法:用PCR方法合成基孔肯雅病毒非结构蛋白基因;对测序的克隆进行序列比对,分析不同克隆上缺失突变发生的位置,以保守区域互相重叠的寡核苷酸为上下游引物、以该区域测序正确的克隆为模板进行PCR扩增,得到所需片段,再将这些片段用PCR方法进一步组装成完整的基因序列并进行测序。结果:测序结果表明,经过2次PCR扩增,校正了基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的5个位点缺失突变。结论:得到序列正确的基孔肯雅病毒非结构蛋白基因。在进行基因合成过程中如发生多位点缺失突变,可利用该方法同时对以上突变进行校正,无须再合成引物,降低了实验操作难度,并提高了实验效率。     

慢病毒载体介导RAB27A基因过表达对人HepG2肝癌细胞增殖的影响

目的：构建RAB27A基因慢病毒表达载体,并研究RAB27A 对人HepG2肝癌细胞增殖能力的影响。方法：以pEGFP-C1-RAB27A质粒为模板,PCR扩增出融合绿色荧光蛋白的RAB27A基因全长,酶切后插入穿梭载体pENTR/U6,再应用Gateway技术,基因重组到表达载体pHAGE-EF1α-puro-DEST上,构建得到重组慢病毒表达载体pHAGE-GFP-RAB27A-puro。测序鉴定序列正确后,将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转HEK-293T细胞进行慢病毒包装。收集并浓缩培养上清以获得慢病毒颗粒感染HepG2细胞。荧光显微镜下观察HEK-293T细胞和慢病毒感染HepG2细胞绿色荧光强度;Western blot检测稳定感染HepG2细胞株RAB27A 蛋白表达水平;CCK8和平皿克隆形成实验检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞增殖活力的变化;流式细胞术检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞周期分布情况。结果：经双酶切及测序结果证实重组慢病毒表达载体构建正确;浓缩后病毒滴度较高;重组慢病毒感染HepG2细胞后,细胞外源RAB27A的蛋白表达水平显著上调,HepG2细胞的增殖活力和克隆形成能力受到明显抑制（P<0.01）,S期细胞分布比例明显降低（P<0.01）。结论： RAB27A 基因重组慢病毒表达载体构建成功,外源过表达RAB27A 基因可显著抑制HepG2细胞增殖能力。RAB27A在肝细胞癌发生发展和迁移中扮演了重要角色。     

大鼠微小RNA miR-16的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的克隆微小RNArno—miR-一16,构建其慢病毒表达载体pLV—miR-16并包装成慢病毒颗粒,为进一步研究miR一16的功能奠定了实验基础。方法从大鼠细胞基因组中用PCR的方法扩增miR-16的前体,构建了miR-16的重组表达载体pLV—miR-16,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物（pPACK—GAG、pPACK—REV和pVSV）共转染包装细胞293TN细胞,包装产生慢病毒,以293TN细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达水平测定病毒滴度。结果经PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建携带大鼠miR-16基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293TN呈绿色荧光,并测得10^8〉ifu／ml。结论成功构建大鼠慢病毒载体pLV—miR-16,为深入研究rno—miR-16的生物学功能奠定了基础。     

胆汁三烯结合蛋白在大肠杆菌中的表达、复性与纯化

目的：合成胆汁三烯结合蛋白（BBP）基因并在大肠杆菌中表达,获得重组BBP纯化制品。方法：根据天然BBP的基因序列和大肠杆菌偏好密码子设计并合成BBP基因的引物,PCR扩增优化的BBP基因序列,克隆至载体pEasy-T3;测序正确后,将该序列克隆至表达载体pET-32a上,构建表达质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG诱导下表达融合蛋白;采用Ni柱纯化融合蛋白。结果：PCR扩增获得了优化后的BBP基因序列,构建了表达载体pET-32a-BBP;SDS-PAGE分析表明表达的融合蛋白相对分子质量为20×10^3,以包涵体形式存在,占全菌蛋白的40%以上;变性、复性后经Ni2＋柱纯化,获得纯度达98%以上的重组蛋白。结论：优化并合成了BBP全基因序列,获得了高纯度重组融合蛋白,为进一步鉴定其生物活性及筛选小分子的研究奠定了基础。     

一种基于EGFP的、安全的抗HIV药物评价系统

目的：建立基于EGFP的、安全的抗人免疫缺陷病毒（HIV）药物评价系统。方法：用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因替代HIV感染性克隆质粒pUC18-HIV-NL4-3中的部分包膜基因（env）,构建重组假病毒质粒pUC18-NL4-3-EGFP,将其与水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）真核表达载体共转染人胚肾293FT细胞,观察绿色荧光蛋白的表达,同时用该细胞培养上清进一步感染其他293FT细胞培养物。为了检验该假病毒系统能否用于抗病毒药物的评价,在假病毒复制和感染过程中加入不同浓度的抗HIV药物AZT（Zidovudine）,采用荧光显微镜检测和流式细胞仪定量检测,分析AZT对假病毒的抑制作用。结果：假病毒质粒pUC18-NL4-3-EGFP能够在转染细胞和再感染细胞中有效地表达绿色荧光蛋白基因,不同浓度的AZT能以剂量依赖方式抑制假病毒的感染和报告基因的表达。结论：建立了一种基于EGFP表达和检测的、安全的HIV假病毒复制和感染系统,该系统可以用于抗HIV药物的筛选和评价。     

乙型肝炎病毒蛋白和绿色荧光蛋白的共表达研究

目的：构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的乙型肝炎病毒（HBV）真核表达载体,并研究其在真核细胞和小鼠体内的共表达。方法：以质粒pBR322-HBVadr2．0和pCX-EGFP为基础,构建含有双拷贝HBV全基因组DNA和EGFP基因的真核表达载体pCX-EGFP-HBVadr2．0,分别转染真核细胞和小鼠肝组织,建立体外、体内表达系统,研究GFP和HBV基因的表达。结果：构建了真核表达载体pCX-EGFP-HBVadr2．0,EGFP和HBV病毒蛋白在体内和体外均可表达。结论：构建的pCX-EGFP-HBVadr2．0真核表达载体可以GFP作为HBV存在与否的报告基因,提高了培育检测转基因小鼠的效率,为转基因小鼠的制备及后续研究奠定了基础。     

介导大鼠结缔组织生长因子基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

目的：构建介导大鼠结缔组织生长因子（CTGF）基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,为进一步包装慢病毒载体奠定基础。方法：以大鼠CTGF基因为靶基因,根据RNA干扰（RNAi）序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,并对质粒进行PCR及测序鉴定。结果：CTGF的短发夹RNA（shRNA）片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4个插入序列与设计的靶基因片段完全一致。结论：构建了能够表达4个含CTGF靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导CTGF基因沉默的慢病毒载体奠定了基础。     

大鼠过氧化物酶体增生因子激活受体γ基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的：构建大鼠过氧化物酶体增生因子激活受体γ（peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma）基因慢病毒表达载体,获得可供转染的滴度,为进一步研究该基因在肝星状细胞活化（Hepaticstellatecells,HSC）及肝纤维化中的作用机制提供物质基础。方法：大鼠PPAR-γ基因序列进行PCR扩增,与经AgeI酶切后的pGC-FU-3FLAG载体连接产生慢病毒载体表达质粒pGC-fu-3flag-PPARG,转化DH5α,PCR筛选阳性克隆,测序并转入293T细胞Western blot鉴定,而后将pGC-fu-3flag-PPARG,pHelper 1.0,pHelper 2.0三质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,收集上清浓缩病毒测定病毒滴度。结果：DNA测序及Westernblot鉴定证实构建的大鼠PPAR-γ基因慢病毒表达载体pGC-fu-3flag-PPARG正确,浓缩慢病毒悬液的滴度为2×108TU/ml。结论：成功构建携带大鼠PPAR-γ基因的重组慢病毒表达载体。     

人尿激酶型纤溶酶原激活因子截短型突变体与绿色荧光蛋白在真核细胞HEK293F中的融合表达

目的:构建人尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)截短型突变体与绿色荧光蛋白(EGFP)分泌型融合表达载体并在真核细胞中表达。方法:采用PCR法,分别以质粒pIRES2-EGFP和重组质粒pcDNA3.1(+)/uPA为模板,扩增出带BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点的EGFP及带NheⅠ和HindⅢ酶切位点的uPA截短体基因片段,先后将EGFP和截短型uPA基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,转入HEK293F细胞,用G418对转染细胞进行加压筛选,通过共聚焦显微镜观察和ELISA方法鉴定表达产物。结果:DNA测序结果显示,uPA不同截短型突变体基因片段与EGFP基因融合的真核表达载体构建成功,共聚焦显微镜观察发现HEK293F细胞中有绿色荧光且定位于细胞质中,ELISA检测到HEK293F细胞培养上清中分泌型融合蛋白的表达。结论:构建了uPA截短型突变体与EGFP分泌型融合表达载体并在真核细胞中表达,为后期研究uPA的相互作用蛋白及其生理功能奠定了基础。     

AKT2基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建丝/苏氨酸蛋白激酶2（AKT2）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法：利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果：成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论：成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。     

CXCR4慢病毒载体的构建及其在人脐带血间充质干细胞的表达

目的：构建趋化因子CXC亚族CXCR4的慢病毒表达载体并观察其转染人脐带间充质干细胞后的表达。方法：用逆转录PCR方法获取CXCR4基因编码区片段,将构建的慢病毒载体质粒pLVTHM-EGFP-CXCR4与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染293T细胞,包装生产慢病毒。用相同滴度的慢病毒转导等量间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSCs）,后采用Real time PCR检测CXCR4 mRNA、Western Blot方法检测蛋白质的表达。结果：PCR、酶切和测序结果表明成功的构建了CXCR4基因重组慢病毒载体。同时用该慢病毒载体转染MSCs后可有效地增加MSCs中CXCR4的表达。结论：成功构建了CXCR4的慢病毒表达载体并能在MSCs中表达,为进一步研究其在干细胞移植中的应用奠定基础。’     

K-Rasa^G12D基因突变体慢病毒载体的构建及其鉴定

目的：构建K-RasGl2D基因突变体慢病毒载体。方法：从病人组织中提取RNA通过RT—PCR反转录获得cDNA作为K-RasGl2D基因模板,通过PCR法扩增出K-RasGl2D基因突变体片段。将酶切的片段克隆入真核表达载体pCDH-CMV—MCS—EF1-RFP中,构建K-RasG12D基因突变体逆转录病毒真核表达载体。将连接产物转化至感受态大肠埃希菌DH5a,挑取转化平板上的细菌克隆,在抗生素培养液中培养过夜后进行PCR鉴定。经测序正确后转染293T细胞系,利用重组质粒PCR及串联基因表达的检测等方法对目的基因的转录与表达进行分析与鉴定。结果：所构建的K-RasGl2D突变体基因逆转录病毒真核表达载体经PCR鉴定和测序鉴定正确,转染293T细胞后可以观察到可检测到高强度表达的RFP荧光信号。结论：成功构建了重组真核表达载体,为下一步建立稳定转染细胞系及进一步研究K-Ras突变在癌症发病中的作用奠定了基础。     

人Cuedc2真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的:构建人Cuedc2的真核表达载体,并进行体外验证。方法:提取人卵巢癌细胞总RNA,通过RT-PCR的方法其反转录为cDNA;以之为模板,利用PCR获得Cuedc2的编码区,纯化后克隆入pcDNA3.1myc-his(-),利用菌落PCR及DNA测序进行鉴定。最后,采用瞬时转染的方法,将所构建的重组CUEDC2真核表达载体通过脂质体转染HEK293细胞,48h后通过western blot检测Cuedc2蛋白的表达。结果:Cuedc2编码区cDNA正确地插入真核表达载体pcDNA3.1myc-his(-)中,western blot检测证实其在HEK293细胞中表达,而空载体转染的细胞为阴性,表明所构建的pcDNA3.1myc-his(-)-Cuedc2能够在体外有效表达。结论:本研究成功地克隆了人Cuedc2 cDNA,构建了重组真核表达载体,并在HEK293细胞中有效表达,为进一步研究人Cuedc2的功能及其与肿瘤的关系奠定了实验基础。     

多拷贝异种化前列腺干细胞抗原融合基因片段的构建及真核表达

目的：构建一系列含有人前列腺干细胞抗原（PSCA）主要T细胞表位的多拷贝异种化融合基因片段,并分别在人胚肾293T细胞中表达。方法：通过重叠延伸PCR法合成单拷贝异种化PSCA基因片段PSCA1,随即应用同尾酶法将该片段串联形成2、3、4拷贝异种化PSCA基因片段PSCA2、PSCA3和PSCA4,并将上述4种基因片段分别插入真核表达载体pCI-Fc-GPI中,构建最终目的片段1～4拷贝异种化PSCA-Fc-GPI（即PSCA1-Fc-GPI～PSCA4-Fc-GPI）,随即分别将重组质粒pCI-PSCA1-Fc-GPI～PSCA4-Fc-GPI体外转染293T细胞,利用间接免疫荧光和流式细胞仪检测其表达情况。结果：测序证实PSCA1片段与设计一致,酶切鉴定证明目的基因片段PSCA1-Fc-GPI～PSCA4-Fc-GPI构建成功;间接免疫荧光和流式细胞仪的检测结果显示,在293T细胞中1～4拷贝异种化PSCA融合基因片段均获得较好表达。结论：构建了目的基因片段PSCA1-Fc-GPI～PSCA4-Fc-GPI,为以PSCA为靶抗原的抗前列腺癌DNA疫苗的构建及功能研究奠定了重要基础。