苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种YBT-1765中稳定质粒pBMB175的克隆和功能分析

从苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种YBT_1765中克隆得到一个大小约15.2kb的质粒pBMB175,构建了该质粒的限制性图谱,通过功能验证,将其最小的复制区定位在一个1151bp的片段上。分析了包含有这个复制区的一个大小为4152bp的核苷酸序列,该片段包含有3个编码框(ORF1、OFR2和ORF3)。氨基酸序列同源性比较发现,ORF1(767AA)与UvrD_旋促酶、重组酶RecD和RecB家族具有20%～30%的相似性;ORF2(149AA)没有发现与任何已知序列具有同源性;ORF3(83AA)与pGI3中一个未知功能的蛋白(ORF7)具有34%的相似性。通过缺失及序列比较分析推测ORF2可能编码一种新的复制蛋白。因此pBMB175的复制类型可能属于一类新的复制家族。利用最小复制区构建的重组质粒在无抗生素选择压力下可稳定遗传40多代,具备构建稳定遗传质粒载体的潜力。     

杨树木质素合成酶c3h基因的克隆及其序列分析

根据CYP98A3(GenBank登录号为AY064170)cDNA序列保守区设计引物,从正在分化的2年生‘欧美杨107’次生木质部提取的总RNA经RT-PCR扩增出一基因片段,然后与pMD20-T载体连接。重组质粒经限制性内切酶酶切、特异引物PCR扩增和测序鉴定。结果表明,扩增片段长度为994bp,其中包含一个长为495bp的开放阅读框,编码的氨基酸序列(登录号为CAP47423)与NCBI中AY064170的CYP98A3编码氨基酸序列的相似性为91%,初步断定其为CYP98A3家族中的一员,其cNDA序列GenBank登录号为AM920690。参照国内外已发表的部分植物的c3h基因序列,构建了c3h的遗传进化树,分析了不同植物c3h的遗传进化关系。     

棒杆菌质粒pXZ10145复制功能区定位

将棒杆菌质粒pXZ10145或pNAT65的不同酶切片段装入大肠杆菌质粒pACYCl77中构建了pTSK系列重组质粒。转化棒状类细菌的实验结果确定了质粒pXZ10145上复制必需区的位置。质粒pXZ10145复制最小必需区定位在NaeI-NruI的1.2kb片段上,在这个片段上只有一个约940碱基的阅读框架。它编码一个质粒复制因子,以对位作用方式协助那些不能自我复制但复制起始区仍保持完整的pTSK质粒在棒状类细菌中复制。质粒pXZ10145复制起始区在一个NaeI-SalI的0.3kb片段上,位于已确定的复制因子编码框架中。     

溶藻弧菌质粒pVAE259全序列测定与分子生物学特征分析

【目的】获得溶藻弧菌环状质粒pVAE259全序列,分析其分子生物学特征并探索该质粒可能具备的功能。【方法】使用酶切、克隆测序的方法获得pVAE259的全序列,利用软件分析DNA序列和可能的编码蛋白,推测质粒的生物学信息。【结果】pVAE259为闭合环状质粒,全长6,075 bp,GC含量为42.16%。在NCBI中比对发现pVAE259与Vibriosp.41隐蔽性质粒pPS41具有较高的相似性。我们在序列中找到一个oriT位点,另外全序列的4118-5494 bp推测为质粒复制区域。pVAE259中存在7个氨基酸序列长度大于100的开放式阅读框(ORF):ORF1-ORF7。其中ORF1编码蛋白属于释放酶超级家族(Relaxase Super-family)蛋白,在NCBI数据库中它与大肠杆菌(Escherichia coli)的MobA-like蛋白最相似;ORF2编码蛋白属于复制酶超级家族(Replicase Super-family),它与嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的复制蛋白RepA最相似;ORF5与伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)质粒pHE1的转移蛋白MobC相似。【结论】根据上述结果及相关文献分析,pVAE259可能是具有转移能力的质粒,该质粒是否影响宿主菌的表型性状还不清楚。     

朱砂叶螨HSP90基因克隆及原核表达

采用RT-PCR及RACE技术克隆朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus的热激蛋白90(HSP90)基因, 并进行序列分析, 得到一条长2 595 bp的cDNA序列, 该序列开放阅读框（open reading frame, ORF）为2 169 bp, 编码722个氨基酸, 分子量约为83.45 kDa, 理论等电点为4.81, 3′非编码区（untranslated region, UTR）为249 bp, 5′UTR为177 bp。通过Antheprot分析发现5个HSP90家族的签名序列及胞质HSP90特征序列MEEVD。同源性分析表明, 朱砂叶螨HSP90编码区核苷酸序列和其他已知的HSP90, 尤其是节肢动物昆虫的HSP90, 具有很高的相似性。将鉴定正确的原核重组表达质粒pET43a-TcHSP90, 转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(origami) 进行原核表达, 应用SDS-PAGE和Western blotting技术分离并检测融合蛋白, 结果表明构建的原核表达质粒可以在宿主菌中稳定、正确表达。朱砂叶螨TcHSP90基因的克隆、原核表达, 为进一步研究HSP90的性质和功能的研究提供有用的实验材料。     

一个融合魏斯氏菌隐蔽质粒的序列分析

从融合魏斯氏菌(Weissella confusa QJ012)中发现一个隐蔽质粒(p QJ012),测序结果显示该质粒大小为1489 bp,碱基G+C含量为42.8%。BLAST结果显示该质粒的核苷酸序列同pJY33和pKLCA的同源性分别为93%、92%。ORF1编码一个282个氨基酸残基的复制蛋白(Rep),其氨基酸序列与质粒pJY33和pKLCA的同源性分别为91%、85%。根据复制蛋白、dso和sso的序列特征,推定pQJ012的复制方式为滚环复制,是滚环复制pT181家族成员。质粒pQJ012可能构建为良好的表达载体。     

链霉菌质粒pSGL1最小复制子序列测定及分析

质粒ｐＳＧＬ１（７．４ｋｂ）是从球孢链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）中分离得到的一个高拷贝质粒,已证明其最小复制子位于Ｓａｕ３ＡＩ酶切的２０ｋｂ片段上。对该片段进行亚克隆,测序后数据表明该片段是一个新序列。仅有一个开放阅读框架（ＯＲＦＲ）位于最小复制子中,推测其编码的蛋白质含有滚环复制质粒复制酶的特定序列。     

戊型肝炎病毒开放读框2的克隆及表达载体的构建

戊型肝炎病毒（HEV）为单股正链RNA病毒,整个基因组有3个开放性阅读框架（ORF）,ORF2（全长约1.98kb）是主要结构基因编码区。将经过PCR获得的ORF2基因插入非分泌型酵母穿梭质粒pPIC3,构成受醇氧化酶（AOX2）的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,重组质粒经酶切线性化后转化酵母细胞GS115,经过鉴定可挑取与酵母染色体发生交换的重组体,用于进一步的真核表达。     

含质粒复制起始区ori44的苏云金芽胞杆菌解离载体的构建

将苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430的解离酶识别位点res分别插入克隆载体pRSET B和pUC19得到质粒pBMB1201和pBMB1202。这两个质粒分别经BamHI/Hin dⅢ和EcoRI/HindⅢ双酶切回收含res位点的小DNA片段,与穿梭载体pHT3101经EcoRI/HindⅢ双酶切后加收的含大肠杆菌复制起始区、氨苄青霉素抗性基因和红霉素抗性基因的3．3kb片段连接,获得重组质粒pBMB1203。封闭pBMB1203两res位点外的BamHI和EcoRI位点后,得到解离载体pBMB1204。将来源于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种YBT－1520的质粒复制起始区ori44片段插入pBMB1204的两res位点之间,得到解离穿梭载体pBMB1205。该解离载体插入壮观霉素抗性基因后电转化无晶体突变株,在辅助质粒所提供的解离酶作用下可发生解离消除抗性基因,解离频率为100％,解离后的质粒稳定性为93％。利用解离穿梭载体pBMB1205可在用抗性筛选到转化子后特定消除抗性标记基因和其它非苏云金芽胞杆菌DNA片段。     

猪圆环病毒2型ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑患断奶仔猪多系统消耗综合症(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出ORF2全基因(702bp).将此片段克隆入pGEM-T easy载体,筛选获得重组质粒pTORF2,并对此质粒中的插入序列进行了测序分析,结果表明本试验克隆的ORF2与美国PCV-2分离株AF264039的核苷酸及氨基酸序列同源性均达到100%,与其他PCV-2毒株同源性分别为92.3%～98 6%和92.3%～96.6%.重组质粒pTORF2经BamH I、EcoR V双酶切,回收ORF2基因,转移入真核表达载体pSec-Tag2/HygroB的相应酶切位点之间,构建成重组质粒pSecTagORF2.此重组表达载体的构建成功为进一步研究ORF2编码蛋白的生物学活性及建立PCV诊断试剂盒打下基础.     

猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析

参照国外发表的猪Ⅱ型圆环病毒(porcine circovirus type 2,PCV-2)全基因组序列,设计一对PCV-2特异性引物,用该室分离的PCV-2豫A株感染PK-15细胞,从中提取PCV-2复制型基因组DNA,并以之为模板进行PCR扩增.回收PCR产物,构建重组测序质粒T-PCV-2.测序结果表明,猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组为1767bp,与GenBank收录的PCV-2国外分离株核苷酸的同源性可高达97%.序列分析表明,复制型豫A株的基因组包含10个读码框架,其中ORF1、ORF2是其两个最主要的读码框架,分别编码314、234个氨基酸.豫A株和PCV-1间的ORF1、ORF2的氨基酸序列同源性分别为85%、66%,与其它PCV-2毒株间的ORF1氨基酸同源性均在98%以上,而ORF2的氨基酸同源性为92%～97%.     

植物乳杆菌KLDS1.0728质粒p141的分子分析

对分离自植物乳杆菌KLDS1.0728的质粒p141进行了全序列测定,结果显示,该质粒全长为3597bp,平均G+Cmol%值为38%,并利用DNAMAN6.0软件得到该质粒限制性内切酶图谱。经NCBI网站ORFFinder软件分析确定其编码序列即ORF为15个,通过与公共数据库比对,发现可以识别功能的ORF有2个,其中包括质粒复制所必需的rep基因,p141的rep基因与已知序列的植物乳杆菌WCFS1内源质粒pWCFS101以及植物乳杆菌内源质粒pM4的复制蛋白基因相似性高达91%。根据rep基因的相似性比较,判断p141的复制模式归属于RCR模式的GroupIII组,即pC194家族。另外,还发现质粒p141中存在mob基因,表明该质粒具有水平转移能力。但没有发现Tn4430转座子以及转座酶基因topl和topA,所以可以判断该质粒的基因比较稳定。此外,还发现该质粒序列中存在一定的与质粒复制和转移调控以及蛋白质表达等有关的重复序列,其对调控质粒的拷贝数有一定意义。     

甘蔗花叶病毒3’末端基因的克隆及外壳蛋白序列分析比较

选取我国SCMV优势株系A株系的分离物SCMV-CA为材料,经过病毒和病毒RNA的提纯,反转录获得病毒cDNA,并克隆到载体pUC19的SmaI位点上,筛选得到多个重组质粒。选取其中一个克隆SCMV-CA54进行测序,得到一个全长为1296 bp的核苷酸序列。这段序列由一个长为1044 bp的开放阅读框架（ORF）和一个长279 bp的3’末端非编码区序列（3'-UTR）及poly(A)尾巴组成。这个ORF包括病毒完整的外壳蛋白（CP）及部分核内含体蛋白b（NIb）基因序列。将所得序列同已知SCMV亚组中各株系分离物的核苷酸和氨基酸进行同源性比较,结果表明该序列与其它株系分离物CP核苷酸序列的同源性介于63.7%～77.6%之间,氨基酸的同源性介于64%～89%之间。根据马铃薯Y病毒属的序列同源性划分标准,SCMV-CA与其它株系或分离物的同源性关系均介于种与株系划分标准之间。这是我国首次报道SCMVCP基因序列。     

苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB165的克隆与分析

以pBeloBAC11为载体,成功构建了苏云金芽胞杆菌YBT-1765的基因组人工染色体(BAC)文库和质粒BAC文库.根据已克隆的包含复制子ori165在内的3.6kb片段中编码复制蛋白Rep165的核苷酸序列设计探针,通过染色体步移方式,对质粒文库和基因组文库进行筛选,得到13个覆盖YBT-1765菌株中质粒pBMB165不同区域的克隆子.通过Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切分析,建立了质粒pBMB165的物理图谱和线状重叠连锁图,并测算出该质粒的大小为82kb.根据部分核苷酸序列初步统计了pBMB165上转座因子的存在机率.YBT-1765菌株基因组文库的构建和物理图谱的绘制为克隆苏云金芽胞杆菌大质粒提供了一套可行的方案,成功解决了大质粒难克隆的问题.     

植物乳杆菌PC518质粒pLP224的发现以及pMV158家族质粒的保守性和多样性分析

【背景】植物乳杆菌含有丰富的天然质粒,分析这些质粒的序列特征有利于分析质粒所携带的遗传信息。【目的】分析从植物乳杆菌PC518分离的新质粒pLP224,聚类分析其所属家族质粒的保守性与多样性。【方法】提取植物乳杆菌PC518的质粒,酶切后构建质粒DNA文库,测序和BLAST鉴定文库中的新序列;通过反向PCR完成质粒全序列测定,注释新质粒;使用进化树软件MEGA X构建质粒的Rep蛋白进化树,并分析结合序列的变化。【结果】从植物乳杆菌PC518分离出一个质粒pLP224,大小为1 766 bp,其中(G+C)mol%含量为41.39%,与已知质粒的最大序列相似性为86.85%。推定其复制方式为滚环复制,属于pMV158家族成员。17个pMV158家族质粒的Rep蛋白分析表明：pMV158家族质粒的Rep蛋白进化距离越近,其dso位点的结合序列相似性越高,进化距离越远则其序列相似性越低。【结论】 pLP224是pMV158家族的新成员。pMV158家族质粒在dso位点的切开序列上保守,在结合序列上多样。其Rep蛋白随结合序列变化而不同。这种差异有利于pMV158家族不同成员在同一宿主的共存,是家族成员持续存在并稳定进化的基础。     

细菌质粒pLS1家族的滚环式复制

根据单链起点Ａ（ＳＳＯＡ）或复制起始序列的同源性,将滚环复制（ＰＣ）质粒分为几个不同的家族。由于ｐＬＳ１质粒家族ＰＣ的调控机理不同于其他质粒家族,且在过去几年中该家族成员已增加到８个。事实上,由于ｐＬＳ１质粒不需要组成型复制子,该家族已成为诱人的克隆载体,不仅用于各种基因的克隆,还用于研究革兰氏阳性细菌基因与革兰氏阴性细菌基因之间的互补性。     

甘蔗花叶病毒3‘末端基因的克隆及外壳蛋白序列分析比较

选取我国SCMV优势株系A株系的分离物SCMV－CA为材料,经过病毒和病毒RNA的提纯,反转录获得病毒cDNA,并克隆到载体pUC19的SmaⅠ位点上,筛选得到多个重组质粒,选取其中一个克隆SCMV－CA54进行测序,得到一个全长为1296bp的苷酸序列,这段序列由一个长为1044bp的开放阅读框架（ORF）和一个长279bp的3‘末端非编码区序列（3‘-UTR)及poly（A）尾巴组成。这个ORF包括病毒完整的外壳蛋白（CP）及部分核内含体蛋白（b(NIb）基因序列,将所得序列同已知SCMV亚组中各株系分离物的核苷酸和氨基酸进行同源性比较,结果表明该序列与其它株系分离的CP核苷酸序列的同源性介于63.7％－77.6％之间,氨基酸的同源性介于64％－89％之间。根据马玲薯Y病毒属的序列同源性划分标准,SCMV－CA与其它株系或分离物的同源性关系均介于种与株系进分标准之间,这是我国首次报道SCMV CP基因序列。     

3株肠道病毒71型毒株的全基因组序列分析

目的：对获得的3株肠道病毒71（EV71）型毒株进行全基因组序列测定,并对其进化特点及分型进行初步分析。方法：提取病毒RNA,反转录得到eDNA,PCR分段扩增覆盖病毒全长序列的6个重叠片段（不包括多聚腺苷酸尾）;用软件将3株EV71的备片段序列进行拼接、编辑和校正,随后进行氨基酸翻译及序列比较;用MEGA4.1软件构建系统进化树。结果：获得了3株EV71的全长序列：GDV103株基因组全长7404 nt,包括741bp的5’端非编码区（UTR）、6582bp的病毒基因组编码区（ORF）及81bp的3’UTR;安徽株（Anhui2007）基因组全长7405nt,包括742bp的5＇UTR、6582bp的ORF及81bp的3＇UTR;VR1432株基因组全长7408nt,包括743bp的5’UTR、6582bp的ORF及83bp的3’UTR长。经同源性比对和进化树分析,证实GDV103和安徽株EV71属于C基因型的C4基因亚型。而VR1432株则属于C基因型的C2基因亚型。结论：获得了3株EV71的全长基因组序列,并进一步探讨了其型别,为下一步的干扰素保护宴,哈重定了基础．     

苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种质粒复制子oril65的克隆

以苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种菌株（Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis)YBT-1765作为出发菌株,克隆了一个包含复制子的EcoRI酶切片段,大小约为11kb,称为oril65。这是国内外从此亚种中克隆到的第一个复制子,缩小到8kb左右后仍然能够复制。杂交结果显示,此复制子来源于菌株YBT-1765可以检测到的分子量最大的质粒,以此复制子构建的穿梭载体pBMB6071在不同受体菌中的稳定性差异很大,其中在以色列亚种无晶体突变株4Q7中,传40后代,稳定性100%,质粒pBMB6071与含ori1030和ori2062在库斯塔克亚种无晶体突变株BMB171中是相容的。     

圈卷产色链霉菌分化相关基因——saw1的结构和功能

用双脱氧链终止法进行了分化基因——saw1的双链测序.结果表明在1500bp的DNA片段中有一个完整的开读框架(ORF),其编码区是在419bp至1252bp处.其产物与已知的天蓝色链霉菌whiG的氨基酸序列有89%的同源性.当把1500bp的saw1DNA片段插入到链霉菌表达质粒载体pIJ702后,构建的重组质粒转化天蓝色链霉菌孢子形成缺陷突变株C71,可使C71形成孢子和灰色色素.用基因破坏的策略进一步研究了该基因的生物学功能,结果表明saw1在圈卷产色链霉菌气生菌丝到孢子形成的发育转变中有重要作用,是分化中控制孢子发育起始的一个重要基因.