Nylon Filter Arrays Reveal Differential Expression of Expressed Sequence Tags in Wheat Roots Under Aluminum Stress

To enrich differentially expressed sequence tags (ESTs) for aluminum (A1) tolerance, cDNA subtraction libraries were generated from Al-stressed roots of two wheat (Triticum aestivum L.) nearisogenic lines (NILs) contrasting in Al-tolerance gene(s) from the Al-tolerant cultivar Atlas 66, using suppression subtractive hybridization (SSH). Expression patterns of the ESTs were investigated with nylon filter arrays containing 614 cDNA clones from the subtraction library. Gene expression profiles from macroarray analysis indicated that 25 ESTs were upregulated in the tolerant NIL in response to A1 stress. The result from Northern analysis of selected upregulated ESTs was similar to that from macroarray analysis. These highly expressed ESTs showed high homology with genes involved in signal transduction, oxidative stress alleviation, membrane structure, Mg^2 transportation, and other functions. Under A1 stress, the Al-tolerant NIL may possess altered structure or function of the cell wall, plasma membrane, and mitochondrion. The wheat response to A1 stress may involve complicated defense-related signaling and metabolic pathways. The present experiment did not detect any induced or activated genes involved in the synthesis of malate and other organic acids in wheat under Al-stress.     

黄瓜抗黑星病相关基因的差异表达分析

以抗黑星病黄瓜材料HX1为试材,接种黑星病菌（Cladosporium cucumerinum）2h、8h、20h、32h和72h的叶片作为试验方（Tester）,相应的未接种叶片作为对照方（Driver）,利用SSH技术,构建了黑星病菌侵染初期的正向和反向cDNA-SSH文库。用巢式引物PCR检测插入片段,获得了200个阳性克隆,通过测序,除去重复序列,共得到105个Unique ESTs。与非冗余蛋白数据库进行BLASTx比对,结果显示,17条ESTs未找到同源序列,88条非重复序列和已知基因的同源性较高,占全部ESTs序列的83.8%,其中86条ESTs与非冗余蛋白数据库已知功能的蛋白具有高度的相似性。结合高密度点阵膜杂交差异筛选,阳性率为75.0%。经初步分析这些序列的功能,差异表达的ESTs功能涉及能量和基础代谢、信号转导、蛋白和核酸代谢、光合作用及逆境中特异表达的基因等方面。为研究黄瓜抗黑星病基因提供了依据。     

通过小麦Ms2近等基因系的抑制缩减杂交分析揭示小穗和花药中差异表达基因

以Ms2近等基因系处于减数分裂期的可育小穗cDNA作为驱动因子(driver),以同一时期的不育小穗cDNA作为测验因子(tester)进行缩减杂交(SSH),将扩增后的缩减杂交产物进行克隆,构建了一个包含882个重组克隆的SSH文库.分别以可育小穗和不育小穗的cDNA为探针与SSH文库克隆进行反式Northern杂交,结果显示接近90%的克隆在不育小穗中呈上调表达.对文库中21个克隆插入片段的序列相似性分析表明其中有18个与来源于穗部或减数分裂期的花药cDNA同源.13个克隆的编码产物与已知功能的蛋白质同源,其中5个参与碳代谢活动,4个参与胞内分子的运输,2个蛋白产物参与染色体的构成及染色体的结构变化,1个是生长素抑制蛋白,1个是转录因子.用中国春缺体四体材料对9个克隆进行了染色体定位,其中一个克隆定位于第四染色体同源群,与Ms2所在的染色体同属一个同源群.通过搜索水稻的同源BAC(bacterial artificialchromosome)和PAC(P1 artificial chromosome)克隆,推测另外11个克隆的染色体位置,其中4个克隆可能位于第四染色体同源群.用RNA点杂交对11个克隆进行表达谱分析,其中8个克隆在不育株的小穗和花药中呈上调表达.     

小麦花粉特异性表达的cDNA的分离及表达特性

应用抑制差示杂交和5′/3′RACE PCR方法分离了小麦(Triticum aestivum L.)花粉特异性表达的全长cDNA(TaPSG719,GenBank:AY451238)),该基因全长1 172 bp,5′非编码区序列长达329 bp,包含多个上游可译框架(uORF);该基因编码1 88个氨基酸的蛋白质,大小约20 kD,等电点为12.1.Northern杂交和RT-PCR分析表明该基因在成熟花粉特异表达,而在小孢子、叶片、根和未成熟的种子、幼茎和子房等组织几乎检测不到.进一步研究小麦花粉发育过程的表达水平表明,TaPSG719在单核和双核小孢子阶段不表达,在开花前5 d(已完成有丝分裂)开始表达并迅速增强达到高峰,但随着花粉的成熟表达水平逐渐下降.表明TaPSG719是一个花粉中晚期特异性表达基因.经BLAST同源性分析表明,与目前已登录的基因没有显著的同源性.Southern杂交表明TaPSG719可能为一个多拷贝基因.为研究TaPSG719 cDNA 5′非编码区序列的uORF对可译框架的翻译的影响,构建不同缺失或突变的表达载体,采用麦胚体外翻译系统,结果显示含uORF的5′非编码区序列能显著抑制蛋白质的翻译水平,表明TaPSG719基因表达至少部分是在翻译水平上调控.     

小麦花粉特异性表达的cDNA的分离及表达特性

应用抑制差示杂交和5′/3′RACE PCR方法分离了小麦(Triticum aestivum L.)花粉特异性表达的全长cDNA(TaPSG719,GenBank:AY451238)),该基因全长1172 bp,5′非编码区序列长达329 bp,包含多个上游可译框架(uORF);该基因编码188个氨基酸的蛋白质,大小约20 kD,等电点为12.1。Northern杂交和RT-PCR分析表明该基因在成熟花粉特异表达,而在小孢子、叶片、根和未成熟的种子、幼茎和子房等组织几乎检测不到。进一步研究小麦花粉发育过程的表达水平表明,TaPSG719在单核和双核小孢子阶段不表达,在开花前5d(已完成有丝分裂)开始表达并迅速增强达到高峰,但随着花粉的成熟表达水平逐渐下降。表明TaPSG719是一个花粉中晚期特异性表达基因。经BLAST同源性分析表明,与目前已登录的基因没有显著的同源性。Southern杂交表明TaPSG719可能为一个多拷贝基因。为研究TaPSG719 cDNA 5′非编码区序列的uORF对可译框架的翻译的影响,构建不同缺失或突变的表达载体,采用麦胚体外翻译系统,结果显示含uORF的5′非编码区序列能显著抑制蛋白质的翻译水平,表明TaPSG719基因表达至少部分是在翻译水平上调控。     

抑制性消减杂交技术在禽类差异表达相关基因筛选中的应用进展

抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)是目前被广泛用于寻找差异表达基因方面的一种技术,因其具有假阳性率低、灵敏度高、重复性好、特异性强等特点而被大多数研究者所采用。该技术的优势在于可以在转录水平对不同环境、不同生理条件下的组织或细胞进行基因差异表达方面的研究。随着近年来分子生物学的不断发展,对差异表达基因的筛选及克隆已逐渐成为研究的热点。本文主要对抑制性消减杂交技术在鹅、鸭和鸡这三种常见禽类的生产性能、抗病机理以及品种差异等方面研究中的应用进行综述,从而为采用抑制性消减杂交技术研究生命活动的分子作用机制提供更多的参考。     

SSH 法结合定量 PCR 技术研究双肌臀猪 肌肉组织的差异表达基因

利用抑制性消减杂交技术 (suppression subtractive hybridization , SSH) 成功地构建了双肌臀与非双肌臀大白猪肌肉组织差异表达的消减 cDNA 文库,获得有效克隆 686 个. 对整个文库测序分析,共获得 587 条有效序列. 利用 BLAST 在线软件与 GenBank、 GenBank EST 和 Tigr Porcine EST 等数据库进行同源序列比较,发现其中有 11 个未知新序列,可能代表“双肌臀”大白猪肌肉组织特异表达的新基因. 对文库中所包含的兰尼啶受体基因 (RYR1)、钙依赖性蛋白激酶 基因 (CAMK2)、人类胰岛素生长因子结合蛋白 -7 基因 (IGFBP7),以及 695号、 882号和480号3个新基因进行了实时荧光定量 PCR 检测,结果显示： RYR1、 CAMK2 及 IGFBP7 基因在双肌臀猪肌肉组织 RNA 池中的表达量,分别为对照的非双肌臀猪肌肉组织 RNA 池中表达量的 1.87、 1.90 和 1.85 倍; 695 号、 882 号和 480 号 3 个新的 ESTs 在双肌臀猪肌肉组织 RNA 池中的表达量为非双肌臀猪肌肉组织 RNA 池中表达量的 1.48、 1.44 和 1.78 倍. 这提示我们,上述基因的上调表达很可能与猪双肌臀性状的发生有密切的关系,可以作为研究该性状的候选基因.     

宽果苁菔适应昼夜变化ESTs的分离与分析

以流石滩地区植物广布种宽果苁菔为实验材料,应用磁珠介导的抑制消减杂交方法,分离昼夜差异基因。随机挑选了136个差异ESTs克隆并进行测序,测序结果使用Blast2go程序进行功能注释和分析。结果表明绝大部分ESTs功能与稳定细胞状态和抗性响应相关,其次与物质能量代谢和信号传导相关,宽果苁菔适应昼夜变化过程的机制非常复杂,本研究为进一步研究高山植物适应流石滩恶劣环境的机制奠定了基础。     

拟耧斗菜昼夜差异表达ESTs的分离与分析

应用磁珠介导的抑制消减杂交方法,以青藏高原白马雪山流石滩地区植物拟耧斗菜为实验材料,分别在白天与夜晚采样,以白天样品为目标,晚上样品为驱动样品,分离昼夜差异表达的基因。随机挑选了96个差异ESTs克隆并进行测序,测序结果进行blastx网上数据库比对、Blast2go功能注释和KEGG代谢路径分析。结果表明：绝大部分ESTs功能与物质能量代谢、生物合成、蛋白和核酸结合、转移酶活性相关,还有少数与逆境胁迫相关等。这为进一步研究高山植物逆境适应的分子机制奠定了基础。     

玉米耐铝毒基因的分离

以抑制消减杂交（SSH）为手段,以玉米对铝敏感的自交系Mo17和耐铝的自交系TL94B为材料,分别构建它们的正向和反向消减文库,分别筛选获得了124、47、103和64个阳性克隆。对文库的鉴定表明,插入片段分布在0.25-1．0kb之间,阳性克隆率在18％左右。对338个阳性克隆进行测序,得到232种表达序列标签（EST）,其中70．2％的EST可推测其功能。结果表明,玉米的铝离子胁迫反应涉及胁迫因子的信号传导、响应基因的转录表达与调控、物质的合成与运输、细胞结构和功能的改变等。     

条锈菌诱导的小麦抗病与感病近等基因系SSH文库构建及分析

为分析条锈菌诱导下的小麦抗病与感病近等基因系之间差异表达的基因,以接种小麦条锈菌CY26小种的抗病近等基因系Yr4/6×Taichung 29幼苗叶片cDNA作为实验方,接种CY26的感病亲本Taichung 29幼苗叶片cDNA为驱动方,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了一个包含1 300余克隆的消减文库。对文库中600个克隆进行了反向Northern点杂交筛选,对获得的阳性克隆进一步进行了Northern杂交验证,获得显著差异的克隆12个。经测序和BlastX分析,其中6个差异表达序列的推测产物分别为亮氨酸重复序列蛋白、过氧化氢酶、硫氧还蛋白、RNA结合蛋白、抗坏血酸过氧化物酶和热激蛋白。除亮氨酸重复序列为信号传导类蛋白外、其他几个均为抗病防御类蛋白。     

用基因芯片技术分析铝胁迫下小麦的基因表达谱

目的:采用基因表达谱分析方法,探讨小麦耐铝的分子机理。方法:利用抑制消减杂交(SSH)技术,以小麦的铝敏感品种Chisholm及其耐铝近等基因系Chisholm-T(其耐铝性来自小麦品种Atlas66)的根尖为材料,构建了2个铝胁迫后的SSHcDNA文库,共含有1628个表达序列标签(EST),利用这些EST制作了小麦根系的cDNA基因芯片。以cDNA基因芯片为平台,在铝胁迫后6h、1d、3d和7d,分别比较Chisholm和Chisholm-T之间的基因表达谱差异。结果:在各个时间点,耐铝和不耐铝小麦材料之间约有5%的EST表现出差异表达。对所有差异表达的EST进行测序分析,序列数据经Pipe-Online2.0进行毗连序列群(contig)拼接,发现只有8.3%的重复序列。结论:SSH是一种非常有效的差减和均一化的建库方法。对有功能注释的差异表达基因进行功能分类分析,表明这些基因参与了植物体内的电子传递、信号传导、植物保护和次生物质的代谢活动。     

单眼视网膜摘除后鸽左右前脑基因的差异表达

利用消减抑制杂交（SSH）技术分析左眼视网膜摘除后成鸽左右前脑基因差异表达情况,对14个重线子经反Northern杂交去除假阳性,最终获得4个阳性重组子,对阳性重组子进行克隆和测序,其中PFB／SSH－8片段长226bp,它的138bp与人CaM I基因外显子有85％的同泊性,PFB／SSH－15片段长252bp,与nexin I alpha非表达序列有低的同源性,另外2个片段未发现有同源物。     

Differential Gene Expression in a Marine Sponge in Relation to Its Symbiotic State

The molecular mechanisms involved in the establishment and maintenance of sponge photosymbiosis, and in particular the association with cyanobacteria, are unknown. In the present study we analyzed gene expression in a common Mediterranean sponge (Petrosia ficiformis) in relation to its symbiotic (with cyanobacteria) or aposymbiotic status. A screening approach was applied to identify genes expressed differentially in symbiotic specimens growing in the light and aposymbiotic specimens growing in a dark cave at a short distance from the illuminated specimens. Out of the various differentially expressed sequences, we isolated two novel genes (here named PfSym1 and PfSym2) that were up-regulated when cyanobacterial symbionts were harbored inside the sponge cells. The sequence of one of these genes (PfSym2) was found to contain a conserved domain: the scavenger receptor cysteine rich (SRCR) domain. This is the first report on the expression of sponge genes in relation to symbiosis and, according to the presence of an SRCR domain, we suggest possible functions for one of the genes found in the sponge-cyanobacteria symbiosis.     

铝胁迫下柱花草SSH文库构建及表达序列标签分析

柱花草栽培种热研2号（Stylosanthes guianensis‘Reyan2’）对铝毒有较强的耐受性。为了鉴定其在铝胁迫下的诱导基因,利用抑制消减杂交（SSH）技术构建在300μmol·L-1铝胁迫下正向cDNA文库。挑选插入片段大于300bp的600个克隆进行测序,共获得504条表达序列标签（EST）。序列重复性分析表明,其中12.1%的EST只有1次重复,61.4%的EST有2-16次重复,重复出现次数较高的EST是细胞色素P450（53次,占10.5%）、病原诱导型胰蛋白酶抑制剂（44次,占8.7%）和衰老相关蛋白（37次,占7.3%）。BLASTX分析显示,504条EST中有97种非冗余基因,其中包括46条功能已知基因和51条功能未知序列。46条功能已知EST中有30个为已报道铝胁迫相关基因,16个是新发现的铝胁迫相关基因。SSHcDNA文库提供的信息为阐明柱花草耐铝毒的分子机制提供了重要线索。     

利用抑制性扣除杂交技术克隆水稻磷饥饿诱导基因

磷素是植物生长所必需的重要元素.在缺磷环境中,植物能够调节自身的形态、生理生化和基因表达水平来适应环境的变化.为研究水稻(Oryza sativa L.)耐低磷胁迫的分子机理,采用抑制性扣除杂交技术(SSH)构建磷饥饿诱导的水稻根系扣除cDNA文库.通过文库筛选和测序获得18个已知基因和47个功能未知基因.这些基因参与了不同的代谢过程,包括磷吸收和转运、信号传导、蛋白质合成和降解、碳水化合物代谢和胁迫反应.Northern杂交结果表明,在磷饥饿胁迫下这些基因呈现不同的表达模式,并且不同代谢过程中的基因对磷饥饿有着不同的反应.     

Identification of over-expressed genes in human renal cell carcinoma by combining suppression subtractive hybridization and cDNA library array

To isolate the over-expressed genes in human renal cell carcinoma (RCC) and analyze its molecular basis of carcinogenesis, we used the mRNA from human RCC tissues as tester and that from the matched normal kidney tissues as driver to construct the suppression subtractive hybridization library. 379 of the subtracted clones were arrayed onto a nylon membrane and the over-expressed genes were then screened by hybridizing the filter with radioactively labeled cDNA from RCC and matched normal kidney tissues. 67 clones over-expressed in RCC by a factor of 6 or more were sequenced and its identities were analyzed in GenBank database. 4 clones were previously unknown fragments and 2 clones represent KIAA genes. The rest clones were the known genes and some of them were RCC-related, including vascular endothelial growth factor, vimentin and tissue factor. Most of the known genes were the RCC-related genes previously unknown, including zinc ribbon domain-containing 1 protein (ZNRD1), pituitary tumor transforming gene1 (PTTG1). Northern blot and semi-quantitative RT-PCR confirmed that the mRNA levels of the 3 novel fragments and 1 KIAA and 3 known genes were significantly higher in RCC than in the matched normal kidney tissues. Immunohistochemical and Western blot analysis for PTTG1 and ZNRD1 revealed increased protein level in RCC. The over-expressed genes in RCC are the potential molecular targets for diagnosis and therapy and it is very important to understand the molecular mechanism of RCC through the profile of over-expressed genes.     

利用抑制性扣除杂交技术克隆水稻磷饥饿诱导基因

磷素是植物生长所必需的重要元素。在缺磷环境中,植物能够调节自身的形态、生理生化和基因表达水平来适应环境的变化。为研究水稻(Oryzn sativa L.)耐低磷胁迫的分子机理,采用抑制性扣除杂交技术(SSH)构建磷饥饿诱导的水稻根系扣除cDNA文库。通过文库筛选和测序获得18个已知基因和47个功能未知基因。这些基因参与了不同的代谢过程,包括磷吸收和转运、信号传导、蛋白质合成和降解、碳水化合物代谢和胁迫反应。Northern杂交结果表明,在磷饥饿胁迫下这些基因呈现不同的表达模式,并且不同代谢过程中的基因对磷饥饿有着不同的反应。     

普通小麦不同优势杂交种及其亲本苗期根系基因的差异表达

为探讨小麦 (TriticumaestivumL .)杂种优势形成的分子机理 ,选用普通小麦品种 (系 ) 3338、6 5 5 4和 2 410TD及其强优势杂种A(3338× 6 6 5 4)和无优势杂种B(2 410TD× 6 5 5 4) ,采用mRNA差异显示技术 ,对生长至三叶一心的根系 (初生根 )基因表达差异进行了比较研究。结果发现 ,小麦杂种一代苗期根系基因表达较亲本明显不同 ,表现为数量水平和质量水平上的差异 ,且差异表达基因的数目远高于我们以苗期叶片为材料的研究结果 ,表明小麦杂交种与其亲本间的基因差异表达与所研究的组织和器官有关。比较分析发现 ,在强优势杂种组合A中 ,超亲表达和偏高亲表达基因所占比例均明显高于无优势杂种组合B。以家族特异基因替代随机引物进行的差异显示结果表明 ,MADS_box家族基因在小麦杂交种和亲本苗期根系中存在着显著的表达差异 ,且差异表达类型以杂种特异表达和亲本基因在杂种一代沉默为主 ,说明MADS_box家族基因可能与小麦的杂种优势形成具有重要关系。对杂种和亲本基因表达差异与杂种优势的关系进行了分析和讨论     

普通小麦不同优势杂交种及其亲本苗期根系基因的差异表达

为探讨小麦(Triticum aestivum L.)杂种优势形成的分子机理,选用普通小麦品种(系)3338、6554和2410TD及其强优势杂种A(3338×6654)和无优势杂种B(2410TD×6554),采用mRNA差异显示技术,对生长至三叶一心的根系(初生根)基因表达差异进行了比较研究.结果发现,小麦杂种一代苗期根系基因表达较亲本明显不同,表现为数量水平和质量水平上的差异,且差异表达基因的数目远高于我们以苗期叶片为材料的研究结果,表明小麦杂交种与其亲本间的基因差异表达与所研究的组织和器官有关.比较分析发现,在强优势杂种组合A中,超亲表达和偏高亲表达基因所占比例均明显高于无优势杂种组合B.以家族特异基因替代随机引物进行的差异显示结果表明,MADS-box家族基因在小麦杂交种和亲本苗期根系中存在着显著的表达差异,且差异表达类型以杂种特异表达和亲本基因在杂种一代沉默为主,说明MADS-box家族基因可能与小麦的杂种优势形成具有重要关系.对杂种和亲本基因表达差异与杂种优势的关系进行了分析和讨论.