β-1,3-葡聚糖酶的研究和应用

β-1,3-葡聚精酶的生产菌种由冻土毛霉经紫外线诱变获得,据正交试验确定培养条件。经硫酸铵盐析和SephadexG-100柱层析,酶得到纯化,并对酶的性质进行了研究。酶对酵母自溶有明显促进作用,使自溶产物的游离氨基氮含量、还原糖含量、总蛋白质得率、干物质得率均得以提高。     

细菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶分子改造和表达策略

β-1,3-1,4-葡聚糖酶作为一种饲料和食品添加剂有着广泛用途。迄今在杆菌、梭菌、瘤胃细菌、真菌、高等植物中都发现了β-1,3-1,4-葡聚糖酶。综述了细菌来源β-1,3-1,4-葡聚糖酶的性质、结构、分子改造与表达研究进展。     

甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的电子克隆与分析

以高粱β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase gene)cDNA序列为探针,搜索甘蔗EST数据库,而后通过电子克隆技术,拼接获得甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因ScBG。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、卷曲螺旋、亚细胞定位、信号肽、功能域及高级结构等方面进行了预测和分析。结果表明:ScBG基因全长1270bp,包含一个长达1011bp的完整开放读码框(open reading frame,ORF),编码336个氨基酸,分子量为34.8KD,理论等电点为4.98。该蛋白质很可能是胞外定位的诱导物释放型酸性葡聚糖酶,是一种稳定的分泌蛋白,且可信度达最高等级1。该蛋白属于糖苷水解酶第17家族,含有N端信号肽,在第7～29位氨基酸处含有跨膜信号区,在第31～321位氨基酸处含有糖苷水解酶17家族结构域,含2个主要的功能结构域。10个物种ScBG蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,甘蔗ScBG基因编码蛋白与高粱β-1,3-葡聚糖酶基因的编码蛋白的同源性最高,达79.82%。以上研究结果为ScBG基因下一步的分子克隆、功能鉴定和应用提供基础。     

血浆β-1,3-D-葡聚糖对深部真菌感染诊断的研究

目的观察血浆β-1,3-D-葡聚糖对深部真菌感染诊断的作用。方法将2005年8月～2006年6月北京友谊医院145例患者(标本182份)分为深部真菌感染组和无深部真菌感染组,分析比较两组葡聚糖水平;使用ROC曲线确定最佳临界值。结果深部真菌感染组的葡聚糖水平64.7±86.0(25.5)pg/ml明显高于对照组6.3±21.0(0.0)pg/ml(P<0.001);血浆葡聚糖用于诊断深部真菌感染的ROC曲线下面积为0.887(95%的置信区间为0.795～0.979),使用临界值13.7pg/ml诊断深部真菌感染的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为88.9%、90.2%、50.0%和98.7%;Kappa值0.588(P<0.05)。结论血浆葡聚糖水平可用于诊断深部真菌感染,本研究中使用GKT-5MSet动态真菌检测试剂盒检测血浆葡聚糖水平诊断深部真菌感染的最佳临界值为13.7pg/ml,使用此临界值对深部真菌感染进行诊断在本研究中的一致性较好。     

甜菜几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性与其对丛根病抗性的关系

应用比较生理学方法,以抗丛根病(rhizomania)性不同的4个甜菜品种为材料,研究了丛根病地和无丛根病地上抗、感病品种的几丁质酶(chitinase)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)活性与甜菜抗丛根病的关系.抗病品种在病地和无病地上皆比感病品种具有较高的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,表明这两种酶与甜菜抗丛根病性有关;另外,病地上两种酶的活性均不同程度地高于无病地上,是病原物侵染诱导抗性的表现.     

不同信号肽对胞外β-(1,3)-葡聚糖酶在巴斯德毕赤酵母中表达的影响

目的:在胞外β-(1,3)-葡聚糖酶成熟肽的N端添加不同类型的信号肽,研究不同信号肽对其在巴斯德毕赤酵母中表达水平的影响。方法:通过融合PCR方法将α成熟交配因子(MFα)、成熟交配因子Pre肽(αPre)和共翻译转运信号肽(Bip信号肽)等3种信号肽的DNA片段连接至胞外β-(1,3)-葡聚糖酶成熟肽基因的5′端,利用PCR扩增包含其自身信号肽的胞外β-(1,3)-葡聚糖酶基因,将上述4种基因片段分别插入pPIC9质粒,再转化巴斯德毕赤酵母GS115宿主菌并诱导表达;测定胞外β-(1,3)-葡聚糖酶的活性,检测其表达水平。结果:目前在毕赤酵母中已广泛使用的MFα信号肽介导的胞外β-(1,3)-葡聚糖酶表达水平最高,其次是αPre,Bip信号肽介导的该酶表达水平是酶自身信号肽介导的表达水平的2倍。结论:共转运信号肽能够提高胞外β-(1,3)-葡聚糖酶的表达水平。     

解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达

目的:克隆解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA)使其在解淀粉芽孢杆菌CICIM B4081中高效表达,并对重组酶进行酶学性质研究.方法:以解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)染色体DNA为模板,经过PCR扩增得到了大小约为0.8kb的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA),构建了重组表达质粒pQ-bglA,通过电转化的方法将其转化人解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)中.结果:得到了能高效表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶的重组解淀粉芽孢杆菌.在250mL摇瓶条件下,重组菌分解地衣多糖的胞外最高酶活达到了1515.7U/mL,重组酶的最适作用温度为55℃,最适反应pH值为6.5.结论:重组菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活为原始菌株的11.84倍,实现了bglA基因在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达.     

青稞中β-1,3-葡聚糖酶的纯化及其抗血清的制备

萌发的青稞种子经醋酸钠缓冲液抽提,50％～85％硫酸铵分级沉淀,DEAE—Cellulose52、CM—SepharoseFastFlow离子交换层析和SephadexG-75分子筛层析,得到具活性的β-1,3-葡聚糖酶。SDS—PAGE检测显示分子量27kDa左右的主带（95％）。将纯化的β-1,3．葡聚糖酶对新西兰兔进行免疫制备抗血清,双向免疫扩散测定效价为1：64。免疫印迹分析表明纯化的β—1,3-葡聚糖酶免疫杂交带亦在27kDa处。     

呼吸科肺部真菌感染患者血清1,3-β-D葡聚糖检测分析

【摘 要】 目的 为了解血清1,3-β-D葡聚糖在呼吸科肺部真菌感染患者的检测水平,探究血清1,3-β-D葡聚糖对肺部真菌感染患者的诊断及治疗监测的效果。方法 对2011年至2013年东阳市横店集团医院的呼吸科就诊的50例肺部真菌感染患者作为实验组,而以30例非真菌的肺部感染患者及30例健康人群作为对照组,分析三组人群血清1,3-β-D葡聚糖的检测水平,同时对实验组中真菌半定量检测结果与血清1,3-β-D葡聚糖比较分析。结果 试验组血清1,3-β-D葡聚糖明显高于两组对照组(P<0.01),而非真菌的肺部感染组与健康人群组之间差异无统计学意义（P>0.05）; 针对肺部真菌感染组的分析,发现痰液中真菌半定量培养阳性程度与患者血清1,3-β-D葡聚糖的水平呈现出正相关,痰液真菌培养半定量3+组血清1,3-β-D葡聚糖水平显著高于1+组和2+组(P<0.01)。结论 呼吸科肺部真菌感染患者血清1,3-β-D葡聚糖水平明显增高,且与痰液真菌培养阳性程度正相关,可作为临床肺部真菌感染诊断及疗效监测的指标之一。     

藤黄节杆菌β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达

以藤黄节杆菌基因组为模板,克隆获得β-1,3-葡聚糖酶基因,分别构建至原核表达载体pET-28a(+)与pBAD18上,诱导获得高效表达,粗酶液对酵母多糖的裂解活性达到161 U/mL。在裂解酵母试验中,粗酶液也表现出较高的活性。研究中得到一株突变株,其对于研究β-1,3-葡聚糖酶在裂解酵母中多糖结合域的地位和作用有着重要的价值。     

啤酒废酵母中β-1，3-葡聚糖的提取工艺

研究采用酶-碱法从经超声波处理的废酵母残渣中提取β-1,3-葡聚糖的工艺,通过正交试验得出理想的酶处理工艺条件：酶添加量208U／g,温度50℃、pH6,酶解8h,蛋白质去除率为62．82％,每L废酵母液中可回收0．348g多肽、氨基酸的蛋白水解液;碱处理工艺条件：用30mL质量分数为2％ NaOH溶液在70℃处理酶解后的沉淀物5h。所得β-1,3-葡聚糖纯度为90．50％,得率为11．00％,经紫外光谱、薄层层析和性质分析为高纯度的β-1,3-葡聚糖。     

中国裸燕麦β-葡聚糖含量的鉴定研究

对来源于中国13个省（区）1010份和国外引进的4份裸燕麦品种（系）进行了β-葡聚糖含量的鉴定研究。结果表明,中国裸燕麦β-葡聚糖含量为2．0％～7．5％,其中含量〈3．00％的占6．61％,3．00％～4．99％的占86．4％。5．00％～5．99％的占5．72％,≥6．00％的占1．18％。按品种类型划分,地方品种的含量低于育成品种（系）。按来源地划分,河北、山西、内蒙古的含量较高,云南、贵州、四川的含量较低,而陕西的含量最低。同年不同地点或相同地点不同年份种植的相同品种（系）,含量有一定的变化（0．27％～0．83％）。在鉴定中筛选出一批高β-葡聚糖品种（系）。本研究不仅为燕麦高β-葡聚糖育种提供了理论依据和物质基础,而且为降脂燕麦保健片的生产提供了优良品种。     

(1,3)-β-D-葡聚糖在诊断深部真菌感染中的意义

探讨(1,3)-β-D-葡聚糖(BG)检测对于诊断深部真菌感染的临床意义。收集2009年同时进行(1,3)-β-D-葡聚糖检测和真菌培养的住院患者的临床资料。分析不同科室送检真菌抗原情况,重症医学科的(1,3)-β-D-葡聚糖检测阳性者真菌菌种分布情况以及(1,3)-β-D-葡聚糖检测假阳性情况。同时送检(1,3)-β-D-葡聚糖和真菌培养共275例,重症医学科送检最多,共178例:重症医学科(1,3)-β-D-葡聚糖检测阳性36例(阳性率20.22%);重症医学科(1,3)-β-D-葡聚糖检测阳性同时真菌培养阳性者25例,其中白假丝酵母菌10例,热带假丝酵母菌7例,光滑假丝酵母菌4例,阿萨希毛孢子菌2例,克柔假丝酵母菌1例,烟曲霉1例。11例(1,3)-β-D-葡聚糖假阳性,9例存在细菌菌血症。重症医学科等科室应加强真菌感染监测。深部真菌感染中,假丝酵母菌属感染最多见。细菌菌血症可能造成(1,3)-β-D-葡聚糖检测假阳性。     

细菌编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶催化活性优化方法

β-1,3-1,4-葡聚糖酶是一类专一降解β-葡聚糖的内切水解酶。高效β-葡聚糖酶在啤酒酿造工业上具有十分重要的应用价值。目前,研究较多的β-1,3-1,4-葡聚糖酶主要来源于细菌。文中概述了细菌编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分子生物学性质,并且从蛋白分子改造、表达调控和发酵条件优化三方面阐述了其催化活性提高的方法和成果。     

枯草芽孢杆菌产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的响应面优化

【目的】采用响应面法(RSM)优化枯草芽孢杆菌5 L发酵罐产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的发酵条件。【方法】利用Box-Behnken设计和方差分析。【结果】获得最佳发酵条件为:转速、通气量和培养基pH分别为500 r/min、1.05 vvm和5.08,发酵时间仅为22 h产β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达2 294.4 U/mL。【结论】实验结果表明响应面法优化5 L发酵罐发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件合理可行。     

血浆(1,3)-β-D-葡聚糖对深部真菌感染诊断的临床意义

目的研究血浆中(1,3)-β-D-葡聚糖检测和真菌培养对诊断深部真菌感染的临床应用价值。方法对我院2009年8月~2010年7月长期使用广谱抗菌药物、免疫抑制剂以及皮质类固醇激素等,且临床出现感染症状的1 868例住院患者,在其抽静脉血做(1,3)-β-D-葡聚糖检测的同时留取血液或痰、中段尿、脓等分泌物标本做真菌培养。通过回顾性调查,了解使用抗真菌药后患者临床症状是否缓解作为临床诊断标准,并以此为标准比较两种检测方法的差异。结果 1 868例患者中使用抗真菌药物后症状缓解757例,使用抗真菌药物后症状未缓解和临床未使用抗真菌药物症状缓解1 082例,无临床资料29例(剔除);实际有效病例1 839例。其中以20 pg/mL为临界值时(1,3)-β-D-葡聚糖含量检测阳性778例,阴性1 061例,以50 pg/mL为临界值时(1,3)-β-D-葡聚糖含量检测阳性623例,阴性1 216例;真菌培养阳性457例,阴性1 382例。血浆(1,3)-β-D-葡聚糖检测试验分别以20 pg/mL和50 pg/mL为临界值时,均得到较好的敏感度(分别为89.3%,74.9%)和特异度(分别为90.6%,94.8%),阳性预测值(86.9%和91.0%)和阴性预测值(92.4%和84.4%)均较高,无显著性差别(P>0.05);真菌培养的敏感度(49.0%)较低但特异度较高(92.1%)阳性预测值和阴性预测值分别为81.2%和72.1%;两种方法联合检测后敏感度提高至93.0%,特异度为88.9%。结论 G试验的方法检测血浆(1,3)-β-D-葡聚糖较传统的真菌分离、培养与鉴定方法简便,快速,阳性率高,但有时发生假阳性。传统的真菌培养方法虽敏感性低,但特异性高,建议临床在诊断深部真菌感染时,同时行血浆(1,3)-β-D-葡聚糖检测及真菌镜检和培养等检查以提高侵袭性真菌感染诊断的敏感性和特异性。     

小麦叶片β-1,3-葡聚糖酶的诱导、纯化与抗菌活性

三个小麦品种331、抗倒680和鲁麦23经氯化汞、水杨酸或核黄素处理后,叶片中的β-1,3-葡聚糖酶活性均有不同程度的升高.氯化汞处理24h对品种331该酶活性的诱导作用最强.因此取用氯化汞处理24 h的331小麦叶片研磨得到粗酶液.将粗酶液经硫酸铵分级沉淀、Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水层析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sephacryl S-100分子筛层析,得到了SDS-PAGE凝胶电泳谱带单一的β-1,3-葡聚糖酶样品.经SDS-PAGE(12%)和凝胶过滤层析,测得其分子量约为52.0～53.6 kD.抗菌试验测定显示,纯化的β-1,3-葡聚糖酶对供试的4种病原真菌的生长、孢子萌发或芽管伸长都有一定程度的抑制作用.     

真菌β-1,3-葡聚糖合酶——一种抗真菌药物的靶标

真菌β-1,3-葡聚糖合酶（β-1,3-glucan synthase,GS）是由催化亚基和调节亚基组成的酶复合体。在酿酒酵母中GS的催化亚基是由2个序列高度相似的基因FKS1和FKS2编码的,在其他酵母中也存在多个与酿酒酵母FKS相似的基因．而在大多数丝状真菌中只存在1个FKS基因。文中主要介绍酿酒酵母和其他重要真菌中FKS基因的研究进展．对FKS基因的结构、在细胞中的定位、以及调控机制作了概括,并讨论了以真菌β-1,3-葡聚糖合酶为靶标开发新的抗真菌药物的研究现状和发展前景。     

β—1,3—葡聚糖酶的研究和应用

β-1,3-葡聚精酶的生产菌种由冻土毛霉经紫外线诱变获得,据正交试验确定培养条件。经硫酸铵盐析和SephadexG-100柱层析,酶得到纯化,并对酶的性质进行了研究。酶对酵母自溶有明显促进作用,使自溶产物的游离氨基氮含量、还原糖含量、总蛋白质得率、干物质得率均得以提高。     

青稞β-葡聚糖对胆固醇的吸附作用研究

探讨了青稞β-葡聚糖的质量及粒度、胆固醇浓度、吸附温度及时间对其吸附胆固醇作用的影响。结果显示,青稞β-葡聚糖对胆固醇具有较好的吸附作用。该吸附作用随胆固醇浓度和吸附时间的增加而增大,随β-葡聚糖的质量及粒度和温度增大而减小。青稞β-葡聚糖吸附胆固醇的适宜条件为:青稞β-葡聚糖终浓度为2.75"3.00mg/mL的胆固醇溶液中于30℃时振荡吸附90min。青稞β-葡聚糖对胆固醇的吸附规律符合Freundlich方程,其吸附方式包括物理吸附和化学吸附。