马铃薯Y病毒pl基因的克隆与序列分析

利用依据马铃薯Y病毒(PVY)pl基因序列设计合成的一对引物YP1,YP2,以带毒烟草总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到了0.83kb的目的条带,测序结果表明为PVY pl基因。通过对PVY P1蛋白氨基酸序列分析发现PVY不同分离物间P1蛋白氨基酸序列存在明显差异,氨基酸序列同源性在64％～94％间。依据P1蛋白氨基酸序列建立了PVY系统关系树并对PVY进行了类型分析。     

马铃薯Y病毒p1基因的克隆与序列分析

利用依据马铃薯Y病毒(PVY)pl基因序列设计合成的一对引物YPI,YP2,以带毒烟草总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到了0.83kb的目的条带,测序结果表明为PVY pl基因.通过对PVY P1蛋白氨基酸序列分析发现PVY不同分离物间P1蛋白氨基酸序列存在明显差异,氨基酸序列同源性在64%-94%间.依据Pl蛋白氨基酸序列建立了PVY系统关系树并对PVY进行了类型分析.     

马铃薯Y病毒福建分离物P1基因的分子变异和结构特征

为揭示马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)P1基因的分子变异及结构特征, 并查明福建分离物P1基因的变异来源。文章设计一对简并引物从感染PVY的马铃薯病叶扩增、克隆获得福建分离物P1基因的cDNA全长序列, 分析其核苷酸序列和氨基酸序列的特征, 并采用贝叶斯法重建P1基因的系统发育树。结果显示, 12个福建分离物均成功扩增出预期大小(约915 bp)的特异性片段, P1基因的核苷酸序列与已报道的PVY不同株系的核苷酸序列一致性为73%~99%; QK44、XT02、XT08、LH05分离物的309 nt位置均检测到一个强烈的重组信号。12个PVY分离物中, P1蛋白有85个变异的氨基酸位点, 表明其高度变异; P1蛋白的第41~275位是一个高度保守的结构功能域, 含有3个保守的活性位点(H₁₉₂、D₂₀₁、V₂₃₅); 系统发育分析显示, 福建分离物形聚为3种不同的簇, 其对应的卷曲结构(Coiled-coil domain)和空间结构也不相同, 表明不同株系型的P1基因在系统发育关系上分化较大。该研究结果表明PVY P1基因在核苷酸序列、氨基酸序列以及空间结构具有高度变异性, 但行使P1蛋白功能的活性位点所在的氨基酸(H₁₉₂、D₂₀₁和V₂₃₅)均高度保守; 福建分离物P1基因的变异源主要来自碱基突变和基因重组。     

地衣芽孢杆菌YP1A耐有机溶剂蛋白酶基因的克隆与功能表达

根据B．licheniformis YP1A来源的碱性蛋白酶具有的高强度耐有机溶剂性能及相关数据库分析,采用PCR克隆B．licheniformis YP1A耐有机溶剂碱性蛋白酶基因,序列分析显示该基因（1264bp）包含启动子与编码380个氨基酸的开放阅读框（ORF）,ORF包括信号肽、前肽及编码254个氨基酸的成熟肽序列。相关基因分析表明,YP1A耐有机溶剂碱性蛋白酶基因与地衣芽孢杆菌ATCC14580的碱性蛋白酶基因仅有6个氨基酸残基差异：构建2种含YP1A碱性蛋白酶CDS的组成型穿梭表达载体pHY／aprYP与pHY／aprP43,前者采用YP1A蛋白酶自带的启动子,后者则采用来自于质粒pP43NMK的P43强启动子。利用这2种表达载体在枯草芽孢杆菌WB800中成功进行蛋白酶的功能表达．其中P43强启动子的表达能力明显优于碱性蛋白酶自带的启动子,表达的蛋白酶比酶活为395U／ml。重组菌表达的碱性蛋白酶在体积分数50％的亲水及疏水有机溶剂中表现出了很好的耐受性,验证了克隆基因为地衣芽孢杆菌YP1A的高强度耐有机溶剂碱性蛋白酶基因.     

马铃薯Y病毒P3N-PIPO酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

P3N-PIPO是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒基因组中近年来新鉴定的编码蛋白。为研究P3N-PIPO在病毒与宿主互作过程中的功能,本研究以马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)和马铃薯作为研究系统,用融合PCR技术扩增得到PVY编码蛋白P3N-PIPO的DNA序列,用于构建酵母双杂交诱饵质粒。为钓取马铃薯组织细胞内不同位置的互作蛋白,本研究构建了p BT3-N-P3N-PIPO、p BT3-C-P3N-PIPO、p BT3-STE-P3N-PIPO、p BT3-SUC-P3N-PIPO和p DHB1-P3N-PIPO 5个诱饵质粒,并进行自激活或毒性检测,最终获得p BT3-STE-P3N-PIPO、p BT3-SUC-P3N-PIPO和p DHB1-P3N-PIPO 3个可用于筛选马铃薯c DNA文库的诱饵质粒。     

昆虫卵黄蛋白分子进化的研究进展

卵黄原蛋白（Vg）、卵黄多肽（YP）和小卵黄蛋白（minor YP）是昆虫三类主要的卵黄蛋白,它们之间的同源性一直是研究的重点。本文根据已经解析的Vg,YP和minor YP的氨基酸序列,采用序列比对和系统树分析的方法,并结合国内外对三者同源性研究的基础,对其进化关系进行了分析。结果表明,Vg,YP和minor YP是三类具有不同进化祖先的卵黄蛋白,它们的氨基酸序列相似性较低。Vg在系统进化过程中最为保守,与人类的血清载脂蛋白B(ApoB)具有较高的同源性;YP与脊椎动物的肝脂酶和胰脂酶具有较高的同源性;而minor YP与脊椎动物胃脂肪酶和舌脂肪酶具有较高的同源性。同时,对三者的分子特性做了简单的介绍。     

马铃薯Y病毒pipo基因的分子变异及结构特征分析

为揭示马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY) pipo基因的分子变异和结构特征, 文章根据文献报道的马铃薯Y病毒属(Potyvirus) pipo 基因保守区序列设计一对简并引物, 从感染PVY的马铃薯病叶中克隆获得pipo基因的cDNA全长序列, 分析其核苷酸序列和氨基酸序列的特征, 并基于氨基酸序列使用贝叶斯法重建了Potyvirus的系统发育树。结果显示：20个PVY分离物成功扩增出预期大小(约235 bp)的特异性片段, 其核苷酸序列与已报道的其它PVY 株系的pipo基因核苷酸序列一致性均在92%以上; 5′端均含有典型的G1-2A6-7 基序(motif), 无碱基插入/缺失, 所有的核苷酸变异都是碱基置换, 共发现13个多态性位点, 其中4个简约信息位点, 9个单一变异位点, 表明该基因高度保守, 但不同分离物也存在一定的分子变异; PIPO蛋白理论等电点11.26~11.62, 无信号肽和跨膜区, 是可溶的亲水性蛋白; 整个蛋白含有3个保守区, 其中位于10~59aa的基序最为保守。该蛋白主要定位于线粒体中, 可能是线粒体导肽。系统发育分析结果显示, 源于PVY不同株系优先相聚成簇, 而向日葵褪绿斑驳病毒(Sunflower chlorotic mottle virus, SuCMoV)与辣椒重花叶病毒(Pepper severe mosaic virus, PepSMV)的亲缘关系较PVY相比更近, 与前人的结果相一致, 表明PIPO蛋白可以作为研究Potyvirus系统发育关系的新的分子标记。     

真菌细胞色素P450在大肠杆菌中的表达

【背景】真菌细胞色素P450蛋白在大肠杆菌中表达水平低甚至不表达,近期研究发现通过对该类蛋白氨基端(N端)氨基酸序列的修饰可优化其表达水平。【目的】在大肠杆菌系统中表达预测功能为P450酶的焦曲霉094102菌株的Au8002蛋白,为真菌P450蛋白在大肠杆菌表达系统中的N端氨基酸序列修饰策略提供有效依据。【方法】对野生型P450蛋白Au8002的氨基酸序列进行分析,对其N端序列进行了3种序列修饰,并在诱导蛋白表达时添加P450生物合成前体5-氨基乙酰丙酸(5-ALA),研究N端氨基酸序列修饰策略及前体添加对真菌P450在大肠杆菌中蛋白表达的影响。【结果】SDS-PAGE和Westernblot检测结果显示,对目的蛋白进行的3种氨基酸序列修饰均使Au8002蛋白获得了表达,前体5-ALA的添加提高了目的蛋白表达量。其中对目的蛋白进行N端全长截短时可部分增加其可溶性,同时也验证了其特征性的CO结合能力。【结论】对预测为P450酶的菌株094102蛋白Au8002氨基端(N端)氨基酸序列的修饰有效解决了其在大肠杆菌内不表达的难题,实现了其可溶性表达;另一方面P450生物合成前体5-ALA的添加也能有效提高该类蛋白的表达水平,上述策略对改善其它该类蛋白在大肠杆菌内的表达水平具有借鉴意义。     

浑球红细菌谷氨酰胺合成酶基因(glnA)及PⅡ蛋白基因(glnB)的序列分析

测定了浑球红细菌的glnA和／glnB基因DNA序列,共2707nt。其中glnA基因编码区为1401nt,编码467个氨基酸;glnB基因编码区为336nt,编码112个氨基醚。DNA序列的G＋C百分含量为65％,它们的密码子第三位GC利用率高达89．1％。在氨基酸序列上,GS酶和PⅡ蛋白与其它不同属的细菌间有较好的同源性,尤其是固氮类细菌间同源性较高。     

棉铃虫核多角体病毒p10基因的序列及转录分析

为了利用棉铃虫核多角体病毒（HaSNPV）p10基因的启动子构建重组病毒杀虫剂及表达系统,应用末端测序法和引物步移法测定了p10基因的序列,并应用Northern杂交和引物延伸实验对该基因进行了深入的转录特性分析,HaSNPV p10基因被定位于基因组DNA的115.4kb-115.6kb处,转录方向与多角体基因相反,在其上下游分别发现了p26和p74基因。转录分析结果确定了p10基因是个极晚期基因,其转录从杆状病毒晚期转录保守序列GTAAG的第二个A开始,转录产物大小约为430nt。HaSNPV p10基因最早可检测到的转录是在病毒感染后的20h,随后其转录产物量迅速放大,到感染后72h达到非常高的水平。围康时相分析同时还检测到一个大小为1300nt的产物,推测该产物为p26和p10通读的转录产物。对HaSNPV P10蛋白序列的分析表明,该蛋白第6－44位及第51－65位氨基酸序列处含多个典型的卷曲螺旋七聚体重复结构,两片段间相隔6个氨基酸残基,在该蛋白序列的第20－34位与第51－65位存在L－X（2）－L－X（10）－L的亮氨酸重复。Helical net分析表明,HaSNPV P10的疏水氨式酸分布为两个集簇区,两者互为180度转角。     

棉蚜细胞色素P450 CYP6J1的克隆与表达

为了深入了解细胞色素P450 CYP6J1蛋白的结构和功能,本实验克隆获得了棉蚜Aphis gossypii P450CYP6J1基因,对该基因进行信息学及原核表达分析,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达结果,并用Western-blot进行验证。结果表明,P450 CYP6J1序列长1 398 bp,编码氨基酸数为465,理论分子量为53.67 k D,理论等电点为8.80。氨基酸序列分析表明该序列具有完整的开放阅读框,且没有信号肽。同源性分析表明,棉蚜c DNA序列推导的氨基酸与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum的保守性最为接近,一致性可达92%。在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达获得的His-CYP6J1蛋白,并用Western-blot检测目的蛋白大小正确。这些研究结果为棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗体制备提供了基础。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒p74基因的克隆和序列分析

用AcNPV p74基因3′端的1.4kb片段,通过Southern blotting将SpltNPV的p74基因定位于XhoI(4 .9kb)、EcoRI(4.4kb)、BamHI(3.0kb)片段上。进一步用ExoⅢ和构建亚克隆测序法, 对长2545bp的p74基因进行了序列分析,其中1974bp的编码区编码658个氨基酸,蛋白分子量约75.87kD,其编码蛋白与AcMNPV和CfMNPV p74蛋白的氨基酸序列同源性分别为64%和63%。     

裂殖壶菌EST文库cdc2基因的筛选与分析

利用已建立的裂殖壹菌(Schizochytrium sp FJU-512)EST文库,通过序列比对分析发现p34cdc2相似基因的3′端序列,分离含该EST序列的质粒ROCHA2004,以T7引物进行反向测序,获得p34cdc2相似基因的全长序列,结合NCBI的ORF finder以及Blastx程序获得p34cdc2蛋白的氨基酸序列;利用同源模建方法构建了该蛋白的三维空间结构,并预测其功能结构域;对该蛋白进行系统发育分析,构建进化树,结果显示该蛋白同小麦(Triticum aestivum)的p34cdc2序列亲缘关系最近。     

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型核心蛋白(p24)在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

在大肠杆菌中,利用新构建的含T7g-10L RBS以及λ-PR启动子的新型原核表达载体,通过表达gag-pol基因片段,获得了具有天然序列的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核心蛋白p24的高效表达。克隆的gag-pol基因片段在其阅读框架移位区域插入了4bp碱基,其表达的病毒蛋白酶在阅读框架上与gag一致,从而实现了对gag-pol融合蛋白的有效加工,产生成熟的核心蛋白p24及其它产物。重组p24以可溶形式存在,可以被抗p24的单克隆抗体特异识别。测定的N端8个氨基酸序列与从病毒纯化的p24完全一致。在使用硫酸铵沉淀后,采用两步离子柱层析,可将重组蛋白纯化到95％以上的纯度。结果表明,纯化的p24可以作为特异性很强的试剂而用于HIV感染的诊断及病情的预后,并可用于p24的生化及结构分析。     

猪鼻支原体膜蛋白p37酶切修饰的质谱分析

p37是猪鼻支原体的膜脂蛋白,有潜在的致癌活性.在对真核表达的p37蛋白分析时发现,p37表现为不同大小的分子片段,提示其存在蛋白质修饰.为了对p37的确切修饰进行分析,进而为其功能研究奠定基础,在构建不同融合蛋白表达质粒并证明其存在修饰蛋白的基础上,通过飞行质谱及N端氨基酸序列测定,分析了p37蛋白的精确分子量和酶切修饰的大致部位,发现3种形式的p37蛋白的精确分子量分别为47 644、46 105和43 984.p37蛋白在其N端被信号肽酶切去1个21肽,在其C端被蛋白酶切去1个18～26小肽后,成为分子量为43 984的成熟p37蛋白. 对p37不同酶切修饰片段的分析将有助于对p37蛋白生物学功能及意义的研究.     

黑龙江马铃薯Y病毒P1基因的特点北大核心CSCD

【目的】本研究通过对不同PVY分离物基因的测序及分析,从而了解PVY株系的多样性,进而对PVY病毒的分子检测及防治提供重要的资料和参考。【方法】本研究针对黑龙江15个马铃薯Y病毒样品的P1基因进行克隆测序和进化树分析。【结果】经比对分析,样品被分成两组,有10个样品的基因类型高度同源,且相对保守,是本地区的优势群组,无论是与国内其它地区样品比较还是与国外样品比较,其亲缘关系都有一定距离;而另一组中的5个样品的P1基因与本地优势组群有较大差异,且这5个样品间也有一定的差异,并与国内其它地区和国外一些样品的P1基因序列比较接近。通过比对Gen Bank中已上传的序列提供的PVY株系的信息,得知本次试验的P1基因与PVY^(NTN-NW)株系是相似的,且这15个样品与国内其他样品一样都是由PVY^N株系演变而来。【结论】由P1基因分析表明,PVY受环境影响较大,黑龙江10个样品的PVY在长期的进化中产生了具有地方特点的变化,而后来的5个样品说明中国大部分PVY有可能是跟随国外品种资源的引进进入,同时PVY也随国内不同区域间资源交流和种薯调运而传播。     

香樟GGPPS基因的克隆及生物信息学分析

本研究目的是克隆香樟牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranyl-geranyl pyrophosphate synthetase,GGPPS)的c DNA序列,并进行生物信息学分析,为香樟萜类物质的生物合成及调控机制研究提供基础。根据香樟叶的转录组测序数据,设计特异性PCR引物,应用反转录RT-PCR方法,克隆获得香樟GGPPS基因,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析。结果显示,GGPPS基因包含全长1 152 bp的开放读码框(ORF),编码383个氨基酸,蛋白分子量为41.41 k D,等电点p I为5.84,是一个定位于叶绿体,不含跨膜结构域,不含信号肽的不稳定疏水蛋白。GGPPS氨基酸序列的主要二级结构为α-螺旋并含有一个类异戊二烯类化合物合酶的特征结构域。通过氨基酸序列的同源性分析发现,香樟的GGPPS氨基酸序列与苹果、陆地棉和紫苜蓿等植物的GGPPS氨基酸序列有较高的同源性。分子进化树分析结果表明,香樟树GGPPS蛋白与无油樟GGPPS蛋白的亲缘关系相对较近。本研究成功克隆、分析并表达了香樟GGPPS,为进一步研究香樟GGPPS基因的功能,萜类合成调控机制等奠定了分子基础。     

BRCA1蛋白的序列及空间结构的分析

查询人的BRCA1蛋白的氨基酸序列,利用生物信息学的方法进行相似性搜索,获得一系列BRCA1蛋白的氨基酸序列。选择了其中的11条序列,对BRCA1蛋白进行了多重序列分析和进化分析,对BRCA1蛋白的BRCT结构域进行三维同源模型的构建与比较分析。分析结果表明:BRCA1中某些特定部位的氨基酸序列高度保守;确定氨基酸的保守位点并联合进化分析可对基因错义突变的致病性做初步地猜测;相近物种来源的BRCA1具有较近的亲缘关系,而且具有极其相似的三维空间结构。这些为研究BRCA1蛋白的结构与功能关系提供指导意义。     

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型Gag前体蛋白片段在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

利用新型原核表达载体pDOG,在大肠杆菌中高效表达了人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)gag基因片段。表达载体利用λPR启动子以及T7g-10的RBS来有效起始表达基因的翻译。表达片段PG1包括p17C-端13个氨基酸、整个p24以及p15N-端74个氨基酸。与PG1相比,PG2片段不含有p17序列,并缺失了p24N-端77个氨基酸。两者的表达量均占总菌体蛋白的20％以上。重组蛋白以包涵体形式存在,在提取包涵体后,经过一步离子柱层析,可以纯化到90％以上的纯度。PG1可被一株抗p24的单抗特异识别,而PG2则不能。纯化的重组蛋白能与HIV-1阳性血清发生很强的特异反应,可以用于HIV-1抗体检测中。     

中国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gei/07-30磷蛋白基因的分子特征及其编码蛋白特性分析

对我国西藏小反刍兽疫病毒野生株China/Tib/Gej/07-30进行磷蛋白基因序列测定,并进行分子生物学特征分析。首先应用逆转录聚合酶链式反应扩增出病毒磷蛋白基因片段,对聚合酶链式反应产物进行直接测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析。小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30磷蛋白基因由1 655个核苷酸组成,编码2个相互交叠的开放阅读框(ORF)。第一个ORF长度为1 530个核苷酸,编码的P蛋白长度为509个氨基酸。第二个ORF长度为534个核苷酸,编码的C蛋白长度为177个氨基酸。第一个ORF通过基因编辑在751位插入1个G核苷酸,转录生成第二个mRNA,长度为897个核苷酸,编码的V蛋白长度为298个氨基酸。小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的P蛋白与其他分离株氨基酸序列同源性为86.1%～97.3%,C蛋白氨基酸序列相似性为84.3%～94.9%,V蛋白为82.9%～96.3%。China/Tib/Gej/07-30的P蛋白第315～387位氨基酸是一段高度保守的七肽重复序列。