细胞内POCR法克隆抗体可变区基因

报道一种克隆免疫脾细胞中抗体可变区基因的新方法。抗原免疫小鼠的脾细胞经分散、固定、渗透处理,直接在细胞内进行反转录,再采用半巢式PCR扩增,获得的序列经测序证明是抗体可变区编码序列。这种不经mRNA纯化、从细胞内直接获取目的的方法既可用于抗体库的建立,亦可用于新基因的快速克隆。     

人源中和性抗甲型肝炎病毒抗体Fab段基因的序列分析及可溶性表达

在用噬菌体表面呈现系统获得人源抗甲型肝炎（甲肝）病毒中和发生基因工程Fab抗体的基础上,对所获得的4株中和性Fab抗体轻重链可变区进行了序列分析、可溶性表达及生物学特性鉴定。4株Fab抗体重链可变区拥有99％同源的核苷酸序列和相同的CDR区氨基酸序列,属于VHⅢ基因家族,而轻链可变区核苷酸序列同源性为95％和相似的CDR区氨基酸序列,属于VL5基因家族。这些重组抗体都能与人甲肝恢复期血清及具有中和活性的鼠抗甲肝克隆抗体产生竞争抑制反应,表明其针对甲肝癌病毒结构蛋白上的主要抗的决定簇。     

鼠源E型肉毒毒素免疫噬菌体单链抗体库的构建及筛选

目的:构建鼠源E型肉毒毒素(BoNT/E)免疫噬菌体单链抗体库,筛选BoNT/E特异性抗体。方法:从E型肉毒类毒素免疫小鼠的脾细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,分别扩增出小鼠重链可变区基因和轻链可变区基因;通过重叠延伸PCR将重链可变区基因和轻链可变区基因组装成scFv基因,重组于噬粒pS100中,电转化大肠杆菌TG_1,合并所有克隆成初级库;随机挑取克隆进行核苷酸序列测定,对初级库序列多样性进行分析;在辅助噬菌体M_(13)K_(07)的拯救下,构建成scFv噬菌体抗体库;用纯化的BoNT/E对鼠源BoNT/E免疫噬菌体单链抗体库进行3轮富集筛选,制备单克隆的噬菌体抗体颗粒进行酶联免疫吸附试验,阳性克隆进行核苷酸序列测定。结果:鼠源BoNT/E免疫噬菌体单链抗体库的库容为7.09×10~7,随机挑取的20个克隆序列各不相同,序列正确率为85%,基本覆盖了IgHV、IgKV、IgLV的优势家族;纯化的BoNT/E作为抗原通过3轮筛选,噬菌体抗体富集了66倍,第3轮筛选后随机挑取90个克隆制备噬菌体抗体颗粒,酶联免疫吸附试验分析有88个呈现阳性反应,序列比对得到了24个不同序列的BoNT/E特异性抗体。结论:构建了库容量达7.09×10~7的鼠源BoNT/E免疫噬菌体单链抗体库,筛选得到了24个不同序列的BoNT/E特异性抗体。     

鼠源抗B型肉毒毒素单链抗体噬菌体文库的构建筛选及抗体免疫学活性的初步研究

B型肉毒毒素重链C-端片段(BoNTB/Hc)经金属螯和层析法纯化后免疫Balb/c小鼠,从其脾淋巴细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,用抗体可变区混合引物进行全套抗体重、轻链可变区基因的扩增,体外随机装配成单链抗体(scFv)。将其克隆至pCANTAB5E中,构建单链抗体噬菌体抗体库。结果表明经过4轮"吸附-洗脱-扩增"的富集过程,筛选获得高亲和力的克隆。序列测定符合抗体可变区结构特点。     

人癌胚抗原单链抗体基因的构建和筛选

从分泌抗癌胚抗原(carcinoembryoni antigen, CEA)单抗的杂交瘤细胞株C50中提取总RNA, 逆转录成cDNA, PCR扩增分别得到抗体轻、重链可变区基因, 再利用两对PCR引物合成和扩增得到全单链抗体基因. 将含轻、重链可变区序列的DNA片段克隆于含噬菌体基因Ⅲ的噬菌粒pCANTAB5. 重组克隆在噬菌体表面表达基因Ⅲ与单链抗体的融合蛋白. 表达具抗原结合活性的单链抗体的重组噬菌体可以通过亲和筛选的方法筛选得到并富集. 利用该方法我们可以从许多分泌不同抗体的杂交瘤细胞RNA中快速克隆和筛选功能性抗体可变区基因.     

抗HEV嵌合抗体的构建及在CHO细胞中的表达

通过RT-PCR方法从分泌戊型肝炎(戊肝)病毒中和性鼠源单克隆抗体(单抗)8C11的杂交瘤细胞中克隆出抗体基因的重链可变区(VH)、轻链可变区(VK)序列,并分别克隆到含有人gamma 1重链和kappa轻链恒定区序列的pcDNA3.1/Hygro和pcDNA3.1( )质粒中,共转染中华仓鼠卵巢癌细胞(CHO)细胞.RT-PCR结果表明,转染的CHO细胞转录了嵌合重链及轻链基因,间接ELISA及Western blot结果表明:翻译出的两种多肽在细胞内正确组装成嵌合抗体分子,并可分泌至细胞外,表达的嵌合抗体保留了原鼠单抗的抗原结合特异性及对8H3结合抗原的增强作用.8C11嵌合抗体的成功表达可降低鼠源性,为探讨戊肝抗体治疗的可能性奠定了基础.     

一种具有人VEGF结合活性的人源单一重链可变区的克隆与表达

为避免一种来自五特征转基因小鼠的全人VEGF单克隆IgM抗体分子量大的不足,本研究探讨了该抗体单一重链可变区的功能特性。首先,PCR获得该抗体的重链可变区,将该序列克隆至pET28a表达载体内,在大肠杆菌中进行了诱导表达。通过变性纯化和复性等方法获得了具有生物学活性的16kDa重组抗体片段——rhVVH。体外结合实验表明,rhVVH保留有完整免疫球蛋白的人VEGF结合活性。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖抑制实验表明:rhVVH可以剂量依赖性的抑制HUVEC的增殖。上述结果揭示了该抗体单一重链可变区保留有完整抗体的部分功能,为进一步开展全人源VEGF单克隆IgM抗体小型化研究奠定了基础。     

一种从抗狂犬病病毒噬菌体抗体库中筛选和验证中和抗体的方法

目的建立一种从噬菌体库抗体库中高效筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法。方法①定性分析:从经过灭活的CVS-11筛选噬菌体抗体库中挑取单克隆于96孔板中培养,制备噬菌体抗体,取培养上清进行快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT),选择可明显抑制病毒感染的克隆测序,获得具有中和活性的抗体可变区序列;②定量分析:挑选有中和活性的克隆,重新制备噬菌体抗体颗粒,纯化后进行RFFIT分析;扩增抗体可变区基因,构建真核瞬时表达质粒。瞬转HEK-293 EBNA1细胞,培养上清经Mabselect SuRe亲和纯化后测定抗体比活。结果定性分析获得的噬菌体抗体颗粒与全分子抗体体外中和活性显著相关;剔除低活性序列后,活性高于0.5 IU/mL的噬菌体抗体颗粒与其全分子抗体体外中和活性之间无显著相关;所有纯化后噬菌体抗体颗粒活性>0.5 IU/mL的序列其全分子抗体体外中和活性均>500 IU/mg。结论构建了一种从抗狂犬病病毒噬菌体库中高效筛选、验证中和抗体的方法。     

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体

目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白( alpha-crystallin Acr)的人源抗体.方法:以结核分枝杆菌Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核分枝杆菌Acr蛋白的抗体,并对可变区序列进行了测序分析.将特异性的噬菌体抗体感染HB2151菌,经IPTG诱导表达,制备了抗结核分枝杆菌Acr蛋白的可溶性单链抗体;对其序列和抗原结合活性进行分析鉴定.结果:经过4轮筛选,获得了43个与结核分枝杆菌Acr蛋白结合的阳性克隆,其中29个特异结合的克隆;测序分析有26不同的可变区片段;通过可溶性单链抗体(scFv)表达筛选到14株特异性结合Acr蛋白的可溶性单链抗体克隆;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群.成功制备了可溶性单链抗体.Westren blotting分析证实筛选的人源单链抗体能与天然蛋白结合.结论:利用单链大容量抗体库获得抗结核分枝杆菌Acr蛋白的噬菌体抗体并且成功制备抗结核分枝杆菌Acr天然蛋白的可溶性单链抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

噬菌体抗体库技术制备高亲和力人抗体

噬菌体抗体库技术的基本原理是将全套抗体可变区基因组装到丝状噬菌体表达载体内 ,与噬菌体外壳蛋白Ⅲ或Ⅷ基因融合并表达到噬菌体表面 ,以固相化的抗原作配基 ,通过吸附 洗脱 扩增的富集过程 ,筛选到与抗原特异结合的抗体克隆 ,并得到相应的抗体可变区基因。因此噬菌体抗体库技术可以被认为是体内抗体生成过程的模拟 ,首先建立足够多样性的抗体库 ,然后通过免疫亲和筛选即可能得到针对任何抗原的人抗体。该技术省时省力 ,无...     

基因工程抗体的类型与研究方法的近况

本文介绍了基因工程抗体的主要类型（包括嵌合抗体、人源化ＣＤＲ移植抗体、亚分子抗体和双特异性抗体）、研究方法和用途;克隆可变区（Ｖ）基因的策略,从正常或免疫Ｂ细胞获得Ｖ区基因和抗体基因库技术;在大肠杆菌中、噬菌体内和哺乳类细胞中高效表达抗体及其片段研究方法的新进展。     

一株乙酰胆碱受体单克隆抗体的序列分析

探讨重症肌无力自身抗体分子结构及其在发病机制中的作用。利用PCR从分泌乙酰胆碱受体（AChR）单抗A49的杂交瘤细胞株扩增抗体可变区（V）基因,经转化大肠杆菌DH5α克隆后,进行核苷酸序列分析。A49的重性V区基因由小鼠VHNP族基因编码,轻链V区基因由小鼠VK2组基因编码。与致病性AChR抗体V区比较,其同源性均在70％以下。A49的分子结构与致病性AChR抗体不同。     

抗人黑色素瘤单链抗体基因的克隆和分泌型表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从分泌抗人黑色素瘤单克隆抗体的杂交瘤细胞ＨＢ８７６０中克隆了抗体轻、重链可变区基因,然后用（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３连接肽基因将ＶＨ、ＶＬ连接成ＳｃＦｖ基因,并进行了序列测定．计算机分析表明ＶＨ,ＶＬ均符合小鼠抗体可变区的特征,为功能性重排的抗体可变区基因．ＶＨ、ＶＬ、ｌｉｎｋｅｒ拼接正确．ＳｃＦｖ基因全长７２９ｂｐ,其中ＶＨ基因长３６０ｂｐ,编码１２０个氨基酸,ＶＬ基因长３２４ｂｐ,编码１０８个氨基酸．在噬菌粒表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中表达了可溶性的ＳｃＦｖ蛋白,表达产物经流式细胞仪检测可特异地与黑色素瘤细胞结合,不与肝癌、胃癌及良性黑痣细胞结合     

人源抗肿瘤坏死因子—α噬菌体抗体的基因结构分析

从混合的噬菌体抗体库中筛选到了抗人ＴＮＦα的人源单克隆抗体,并对筛选到的抗体基因进行了序列测定和分析。结果表明,筛选到的４个特异性抗ＴＮＦα噬菌体抗体克隆的重链的重链基因序列相同,该重链基因长６８１ｂｐ,编码２２７个氨基酸残基,属于人免疫球蛋白第Ⅲ家族,其中１－１１９位氨基酸残基为重链可变区（ＶＨ）,１２０－２２７位为重链恒定区１（ＣＨ１）。４个噬菌体抗体克隆的轻链均缺失,因此实际上筛选到的是单重     

基于重链抗体构建的单域抗体研究进展

在骆驼血清中存在天然的缺失轻链的重链抗体(heavy chainantibody ,HCAb) ,克隆重链抗体的可变区构建的只由一个重链可变区组成的单域抗体称为VHH抗体(variabledomainofheavychainofheavy chainantibody ,VHH)。研究发现,VHH抗体具有易表达、可溶性好、稳定性强等优点。另外,骆驼的重链抗体与人VH3家族抗体同源,对人VH3家族抗体的重链可变区进行类似VHH的特征性改造,可以使这些抗体在保持亲和力、特异性不变或者变化很小的情况下,优化抗体的其它性质。已有的研究表明VHH抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、药物开发等领域有广阔的应用前景。     

人噬菌体抗体库技术的发展

抗体库技术的出现得益于用PCR的方法人为地设计一组引物克隆出全套免疫球蛋白可变区基因,以及从大肠杆菌分泌有结合功能的免疫球蛋白分子的成功。1989年,Huse等［‘］将扩增的轻链和重链片段分别克隆到以入Z地改造的表达载体中,构建成轻链和重链库,然后将两个库随机重组形成了组合抗体库。由于在V基因的5’末端有分泌信号序列,所表达的Fab可分泌到细菌体外。由于对特异性抗体的筛选仍采用传统的“膜的原位杂交法”,所以在对库容量为10‘～10’的筛选时其工作量之大是可想而知的。为了克服随机组合文库的随机性强、库容量大、筛选系…     

抗埃博拉病毒核蛋白NP人-鼠嵌合抗体的研究

埃博拉病毒感染致死率最高可达90%,属烈性传染病,检测诊断对于疫情控制就显得异常重要。目前我国实验室通过实时定量荧光PCR检测埃博拉病毒核酸进行确诊,但耗时相对较长,对检测的人员和仪器要求较高。ELISA法检测血清是病原学诊断的主要指标,该种检测方法简单易操作,能够有效判断患者是否感染埃博拉以及感染程度,可用于流行病学调查,血清学指标的检测可以作为核酸检测的有力补充。由于埃博拉出血热在我国境内尚无病例出现,尤其需要储备血清学检测阳性质控物。通过基因工程抗体技术构建并表达抗埃博拉病毒核蛋白NP人-鼠嵌合抗体,为埃博拉出血热血清学检测做人源阳性对照储备。采用RT-PCR技术,从分泌抗埃博拉核蛋白单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞株中分离克隆抗体轻重链可变区基因,对其进行序列分析。根据序列分析的结果,设计特异性引物将鼠源抗体可变区基因VH、VL分别克隆至携带有人抗体轻重链恒定区基因的真核表达载体HL51-14,瞬时转染293T细胞,表达并纯化获得人鼠嵌合IgG抗体,随后对其进行了免疫学检测和功能鉴定。结果表明正确构建抗埃博拉病毒核蛋白人鼠嵌合抗体真核表达载体,成功表达并纯化获得两株人鼠嵌合单抗。     

抗CD20嵌合抗体的表达与活性检测

表达了基因重组抗CD20嵌合抗体并对其生物学活性进行了初步鉴定。设计合成轻、重链可变区序列;提取血液RNA,通过RT-PCR得到人κ、IgG1的轻、重链恒定区序列。运用重叠延伸PCR,连接可变区与恒定区,将轻、重链基因连接至pIRES双表达载体。将质粒以阳离子脂质体转染CHO细胞,ELISA挑选阳性克隆,共获得7株表达较高的克隆,表达量约为2mg/L。扩大培养阳性克隆anti-CD20-1B3,收获上清,以蛋白A进行亲和层析纯化表达蛋白。SDS-PAGE检测表明纯化纯度达到95％,蛋白相对分子量与理论值吻合。以CD20₊细胞Raji、Daudi、Ramous检测,表明该抗体能与CD20抗原特异性结合,体外杀伤试验说明抗体能够杀伤CD20₊淋巴瘤细胞。     

血清学检测H-Y噬菌体Fab抗体阳性克隆的分析

目的 为分析H-Y噬菌体Fab抗体特异性,筛选用于抗体亲和力提高的H-Y噬菌体Fab抗体阳性克隆.方法 以从噬菌体Fab抗体库中筛选到具有雄性特异性结合活性的阳性克隆A6、A8、E6为基础,通过C57BL/6鼠脾细胞为抗原的ELISA分析3株阳性克隆的特异性,镜下观察亲和力较好的A8阳性克隆ELISA结果,利用生物信息学方法预测分析该克隆的抗体基因可变区序列和结构.结果 ELISA分析显示3株阳性克隆具有雄性特异性,其中A8阳性克隆具备较好的雄性特异性.A8克隆具有免疫球蛋白轻链和重链可变区结构,其重链、轻链可变区分别属于VHI和VκIV基因家族.结论 A8阳性克隆可用于后续的导向筛选和抗体基因改造等研究工作.     

抗呼吸道合胞病毒融合蛋白单链抗体的筛选及初步鉴定

目的：从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗呼吸道合胞病毒F蛋白的单链抗体。方法：以RSV F蛋白为靶抗原,通过“吸附-洗涤-洗脱-扩增”过程从天然人源性噬菌体抗体库中筛选特异性抗F蛋白单链抗体。5轮筛选后,单克隆经ELISA检测,阳性克隆进行核酸序列分析,并将阳性克隆噬菌体感染E.coli HB2151,经IPTG诱导,制备抗RSV F蛋白的可溶性单链抗体,并进行Western及Dot blot分析。结果：经过筛选,获得了18株能与F蛋白特异性结合的阳性克隆,取OD值最高的克隆E4经测序并检索Kabat数据库分析,显示其基因与人免疫球蛋白可变区基因具有高度同源性,Western及Dot blot分析表明为单链抗体。结论：利用天然人源性噬菌体抗体库技术制备出高特异性的人源性抗RSV F蛋白单链抗体。