甘蓝下胚轴原生质体高效成株系统的建立

本文采用萌发六天的甘蓝(Brassica oleracea)下胚轴材料游离原生质体,经纯化后的原生质体产量为1.45×10~6g~(-1)FW,于含有1.5mg/L BA,0.5mg/L NAA和0.5mg/L 2,4-D的KM 8p的培养基中进行液体浅层培养。原生质体培养3—4天后出现一次分裂,七天时统计分裂频率为50.3%,培养15天左右可形成细胞团,3—4周后即可形成肉眼可见的小愈伤组织,统计形成愈伤组织的植板率为1.25%。将愈伤组织转至含有1.5mg/L BA和0.2mg/L 2,4-D的MS固体扩增培养基上进行扩增,其后可在含有2mg/L BA和0.5mg/L ZT的MS分化培养基上分化出芽,其分化率为54.17%,分化芽可于生根培养基中生根形成完整植株,移栽后,在人工气候室中生长良好。在试验过程中,对取材的不同时间,酶解液的不同配比对原生质体产量的影响,以及不同培养基、不同培养密度、不同的激素配比和不同培养方法等方面对原生质体的再生和持续分裂的影响进行了讨论。     

金龟子绿僵菌原生质体的制备和再生及其羟化酶活性研究

对金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)原生质体的制备和再生的影响因素进行实验,并在此基础上考察了甾体底物对原生质体羟化酶的诱导作用。结果表明,原生质体制备的合适条件是:42 h的菌丝体用纤维素酶(10 mg/mL)和蜗牛酶(5 mg/mL)的混合酶在含有0.8 mol/L甘露醇的pH 5.8磷酸缓冲液中,28℃震荡(80 r/min)酶解3 h,原生质体产量可达到6.12×10~7/mL,在含有0.6 mol/L KCl的双层马铃薯培养基上再生率达到7.79%。经过6 h底物诱导的菌丝体制备的原生质体细胞色素P450的表达量比没经过诱导的菌丝体制备的原生质体高约40%,证明该菌羟化酶系统的可诱导性。由于没有细胞壁的阻碍经过底物诱导的原生质体能够高效的将底物转化为产物,且副产物相对较少。     

蕨麻愈伤组织原生质体制备条件的优化

以青海‘蕨麻4号’诱导培养的愈伤组织为材料,采用4因素3水平L9(34)正交实验,研究酶类组合、酶解时间、甘露醇浓度及离心速度等主要因素对蕨麻原生质体分离的影响,建立高效、稳定的蕨麻原生质体分离体系,为进一步通过原生质体融合、基因工程等方法对蕨麻进行品种改良奠定基础。结果表明:各因素对蕨麻原生质体产量的影响顺序为:酶类组合酶解时间甘露醇浓度离心速度;青海‘蕨麻4号’愈伤组织原生质体的最适酶解条件为:2.0%纤维素酶+0.75%果胶酶,40r/min振荡酶解10h,甘露醇浓度为0.5mol/L,离心转速为1 000r/min时原生质体的产量达最大(8.96×10~5 cells/g),活力为92.77%。     

霞草原生质体培养和植株再生

用霞草胚性悬浮细胞分离原生质体,以含0.2%琼脂糖的KM 8p培养基薄层漂浮培养,原生质体培养密度6×10~3-1×10~4/ml。培养3天再生细胞开始分裂,7天统计分裂频率最高达25.4%,10天形成小细胞团,并加降低渗透压的稀释培养基,每周一次。20—25天形成肉眼可见的小愈伤组织,植板率达3.5%。原生质体衍生的愈伤组织在增殖培养时加入0.3%-0.4%活性炭有利于生长及分化。在含6-BA 3.5 mg/L,IBA 0.8 mg/L的培养基上,再生芽的分化频率可达85%。再生芽在添加NAA 0.5 mg/L,6-BA 0.05 mg/L的1/2 MS生根培养基中2周内形成具根的再生小植株。     

沙打旺原生质体培养再生植株

用1%半纤维素酶,0.4%纤维素酶,0.1%果胶离析酶,CPW9M酶液分离沙打旺无菌苗下胚轴和子叶原生质体。K8P原生质体培养基悬滴培养。下胚轴原生质体形成小细胞团后用琼脂糖包埋培养,形成小块愈伤组织后转入增殖培养基M1、M2(改良MS培养基)上形成大块愈伤组织。经过两次诱导分化,在分化培养基M3(MS 0.7mg/L BA 0.2mg/L NAA),M4(MS 0.5mg/L BA 0.5mg/L KT 0.5mg/L ZT 0.2mg/L NAA)和M6(MS 3mg/L ZT 0.2mg/L IAA)上分化出苗,再生植株。由子叶分离的原生质体未能形成愈伤组织。     

大丽轮枝菌原生质体的制备及再生

为建立大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)原生质体的制备和再生体系,采用单因素分析法分析了大丽轮枝菌摇培时间、裂解酶浓度、酶解时间和温度、渗透压稳定剂的种类和浓度及pH对原生质体释放的影响;从再生培养基、培养基Agar浓度和酶解时间对原生质体的再生条件进行了优化;并对优化条件下获得的原生质体进行了GFP瞬时表达。结果表明,将分生孢子培养18 h收集菌丝体,以1.2 mol/L的KCl作为渗透压稳定剂,在pH 6.0的条件下,加入10 mg/m L的裂解酶,30℃酶解4 h时,获得的原生质体产量最高,达到3.3×10~7个/mL;在Agar浓度为0.5%的TB3再生培养基中进行原生质体再生,再生率最高,可达22.45%;GFP瞬时表达结果表明,优化条件下获得的原生质体可用于遗传转化材料。     

黑麦叶肉原生质体的分离、培养与幼小愈伤组织的形成

黑麦叶肉原生质体系用纤维素酶溶去壁后分离出来的。酶液混合液为:纤维素酶(2％)、果胶酶(0.5％)溶于0.65M的甘露醇中,保温在24～26℃。将生长5—6天的黑麦叶片在酶掖中处理2—3小时后,就可使90％以上的原生质体分离下来。将每毫升含有5×10~4—10~5密度的原生质体培养在液体培养基中(表1),其中附加2,4-D(1毫克/升)、6BA(0.5毫克/升)、CH(1克/升)和0.56M蔗糖。培养条件为光照800—2000米烛光,温度23—26℃。培养48小时后长出新壁。第3天出现第一次分裂,4—7天进行第二、三次分裂,9天后形成细胞团,25天后长成大细咆团。此后,定期加等体积的新鲜培养液,继续培养一个时期后便形成了幼小愈伤组织。     

防风悬浮细胞的原生质体再生植株

防风(Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk)试管苗的根尖,下胚轴或叶柄切段在含有1mg/l 2,4-D 的 MS 固体培养基上,形成含有胚性细胞团的愈伤组织。愈伤组织经液体振荡培养,形成含有大量胚性细胞团的悬浮培养物。用含有 Onozuka R-10 1.5%、Mace-rozyme R-10 0.3%、蜗牛酶0.5%、CaCl_2 5mmol/l 和甘露醇0.6 mol/l(pH=5.8)的酶液从胚性细胞团游离得到原生质体。原生质体在培养的第4天出现第一次分裂,50天左右形成的细胞团大小为1—2mm。这些细胞团在含有0.5 mg/l 2,4-D 的 MS 固体培养基上形成愈伤组织。在含有0.1 mg/l 6-BA 或0.1 mg/l 2,4-D+0.5mg/l 6-BA 的 MS 固体培养基上,原生质体再生的愈伤组织分化出胚状体。胚状体在不含任何生长调节剂的 MS 固体培养基上发育成完整的原生质体再生植株。     

苦荞叶肉细胞原生质体的分离纯化及瞬时转化

高效分离原生质体是遗传转化、细胞融合和再生培养的基础性工作。该实验以苦荞(Fagopyrum tartaricum)品种‘榆6-21’的叶肉细胞为材料,研究了酶类组合、甘露醇浓度、酶解时间以及离心速度对苦荞叶肉细胞原生质体分离纯化的影响。结果表明:酶解液组成为1.5%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0.5mol/L甘露醇+20mmol/L MES+20mmol/L KCl+10mmol/L CaCl2+0.1%牛血清白蛋白,以第5~7片真叶为材料,用胶带纸撕去叶片下表皮后,25℃黑暗酶解4h,以900r/min离心收集,可以获得高质量的原生质体,原生质体产量可达6×106个/g,活力达到90%以上;用双荧光素酶报告基因载体检测原生质体的转化效率,以分离纯化的苦荞叶肉细胞原生质体为受体,将双荧光素酶报告基因载体与其混合后,在终浓度为20%PEG4000介导下,黑暗转化20min,可以检测到较高活性的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶,证明双荧光素酶报告载体可成功转化到原生质体中。研究结果为苦荞原生质体瞬时转化及遗传操作提供了技术基础。     

石防风原生质体再生植株

石防风种子幼苗切段,在含有1mg/1 2,4-D 的 MS 固体培养基(大量元素减半)上,产生含有胚性细胞团的愈伤组织。经液体培养,获得含有高比例胚性细胞团的悬浮培养物。在含有1.5%纤维素酶、0.3%果胶酶、0.5%蜗牛酶、5mmol/lCaCl_2、1mmol/lKH_2PO_4、0.6mol/l 甘露酐、pH5.8的混合酶液中,在25℃条件下,经过5小时消化,获得了原生质体。在含有 1mg/12,4-D+0.5mg/l 玉米素的修改的 MS 培养基中,原生质体第4天出现了第一次分裂;约40天后,形成0.5—1mm 的细胞团。把它们转移到含有0.5mg/l 玉米素的液体 MS 培养基(大量元素减半)中,逐步发育成胚状体。在不含激素的 MS 固体培养基(大量元素减半)上,胚状体发育成完整植株。     

培养介质pH和EGTA对水霉(Saprolegnia ferax)菌丝细胞肌动蛋白的分布与结构的影响

菌丝在pH 5.0—8.0介质中维持顶端生长,Rhodamin-phalloidin荧光探针显示在菌丝顶端都存在F-actin的“帽子”结构;加入EGTA到培养介质中不影响菌丝的顶端生长和actin的“帽子”结构。值得注意的是:菌丝的Rhodamin-phalloidin荧光强度大小与菌丝顶端生长速率成正比;在含有或不含有EGTA的pH5.0培养条件下,菌丝的生长速率均很低,且后部颗粒状的荧光斑点消失;在pH 3.0-4.0培养介质中菌丝生长停止,不但F-actin“帽子”结构消失,整个菌丝荧光也变得非常微弱无法观察,提示酸性pH可引起F-actin的解聚,从而导致生长速率下降甚至生长停止。     

大鼠肝和肝癌DNA及其限制性酶切图谱分析

大鼠肝和肝癌BERH-2 DNA的EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ,HindⅢ和Pst Ⅰ,以及EcoR Ⅰ分别与BamH Ⅰ或HindⅢ或Pst Ⅰ组合双酶合切的电泳图谱间无明显差异;双向凝胶电泳重复顺序图谱也近似。在一定实验条件下,大鼠肝癌BERH-2 DNA在凝胶电泳上,除去显示EB荧光主带外,还有呈现阶梯大小的片段。最小片段为270bp,两电泳相邻片段间的长度差约为160bp,并且能与标记的核RNA起杂交反应。对实验结果进行了讨论。     

乙酰胆碱及其拮抗剂对人SK-N-SH细胞增殖及mAchR1表达的影响

用CCK-8比色法和流式细胞术,检测乙酰胆碱（acetylcholine,Ach）及拮抗剂阿托品（atropine,Atro）对SK-N-SH细胞增殖活性和周期分布的调节作用;进一步用荧光定量PCR、免疫印迹和流式细胞间接免疫荧光技术,分析SK-N-SH细胞毒蕈碱受体亚型Ⅰ型（mAchR1）和c-fos的表达差异。结果表明,1mmol／L Ach对SK-N-SH细胞有明显促增殖作用,而1mmoL／L Atro阻滞细胞从S期向G2／M期移行;1mmol／L Ach与1mmol／L Atro均反馈调节mAchR1的蛋白水平。但mAchR1 mRNA的表达不受影响;1mmol／L Ach显著上调c-fos mRNA和Fos蛋白的表达,但这种作用可被Atro逆转。提示胆碱类受体参与配基对肿瘤细胞的促增殖作用。     

人和猴T淋巴细胞表面TRBC受体和E受体的比较研究

TRBC受体不同于已知的全T细胞表面分化抗原CD2,CD3/TCR复合物,CD5,CD6和CD7。CD2分子不参与TRBC玫瑰花结的形成,也不是介导E花结的唯一分子。至少有两个或两个以上蛋白质与TRBC玫瑰花结和E花结的形成有关,其中有的分子为E受体和TRBC受体所共有。因此,很可能有不同于CD2的分子参与了TRBC玫瑰花结的形成。     

鹿科动物的染色体组型及其进化

染色体是遗传物质的主要携带者。在动植物进化过程中,染色体在数量和结构上的变化,无疑对物种形成起重要的作用。染色体的变化往往引起基因的重新排列和遗传物质的增加或丢失。染色体在结构和数量上的差异还往往造成两个本来很相近的群体间的生殖隔离而形成新种。染色体组型和染色体的带型都代表着种的特性,它为不同动物在分类研究和确定其在进化过程中的位置提供了一个新的和重要的标准。可是,染色体的结构既是稳定的,同时又是可变的。染色体组型的改变是以染色体组的结构特点为基础     

蓝猪耳合子和二胞原胚细胞的分离(简报)

合子是被子植物个体发育的第一个细胞.合子分裂的规律性是植物早期胚胎发生的种属甚至是科的特征,也是控制早期个体发育的关键阶段.     

HL-60和Raji细胞在TPA作用下原癌基因结构和表达改变

本文观察了TPA诱导前后HL-60和Raji细胞中c-myc,c-H-ras,c-sis和c-erb A,B的表达情况,并对c-myc,c-H-ras的基因结构作了初步的测定。实验结果表明,两株细胞中四种原癌基因的表达水平各不相同。TPA诱导1,伴随HL-60细胞的分化,c-myc和c-H-ras基因表达最下降;c-sis表达量不变。Raji细胞在TPA处理后c-H-ras表达量有所下降,c-myc表达量不变。本文提示,多种癌基因的表达和/或癌基因的表达增加可能是致癌的原因之一。     

中国水仙六倍体的诱导和染色体数目的变异(简报)

中国水仙(Narcissus tazetta L.var.chinensis Roem)属于石蒜科水仙属多年生草本花卉植物。中国水仙的品种不多,在福建漳州地区主要栽培品种为单瓣水仙,此外,还有重瓣和“金三角”两个品种。中国水仙为三倍体植物,染色体数目为2n=3x=30[1-3],其高度不孕性,只开花不结实,靠子鳞茎进行无性繁殖繁衍后代。由于长期的无性繁殖和病毒感染,现存种质退化、品质下降,花朵数明显减少、香味变淡、生长势差、鳞茎变小、抗性减弱等问题,严重影响了该花卉的进一步生产和发展。因此,采用现代生物工程技术(体细胞杂交技术、转基因技术等)改良中国水仙,培育中国水仙新品种迫在眉睫。     

hTERT基因片段的克隆、表达和抗hTERT抗体用于端粒酶及hTERT检测的研究

端粒酶是一种重要的肿瘤生物学标志,其活性在生殖细胞、绝大多数肿瘤细胞和体外培养的永生细胞可以测知,但在大多数体细胞中不易测出。人端粒酶由两部分组成,包括hTERC和hTERT,hTERC在正常细胞和肿瘤细胞中均有表达,而hTERT的表达似乎受到严格的调控且和端粒酶活性一致。为了检测肿瘤细胞中端粒酶及hTERT的表达,我们制备了抗hTERT蛋白的特异性多克隆抗体。首先用RT-PCR方法克隆了hTERTcDNA的一个片段,将其连接到GST融合表达载体pGEX-5X-3后在大肠杆菌中融合表达。将纯化的融合蛋白抗原免疫动物,制备抗hTERT蛋白的多克隆抗体。不同的细胞抽提物用该抗体进行了Westernblot分析,结果表明该抗体可特异识别端粒酶阳性细胞株中的hTERT及端粒酶,为端粒酶及hTERT的检测初步提供了一个简单有效的检测手段。     

口服醋酸棉酚前后人精子体外受精能力及精核转变的细胞学观察

本文报道口服醋酸棉酚对人精子体外受精能力、原核及染色体形成的影响。结果表明,在口服醋酸棉酚前的9名男性精子对金黄地鼠卵的穿透率平均为62%。每日口服20mg醋酸棉酚15天后,精子对卵的穿透率下降至47%,30天后下降至24%,50天后下降至8%。即口服醋酸棉酚50天后达到了不再具有生殖能力的精子穿透率阈值(10%)以下。原核及染色体形成的观察表明,即使口服醋酸棉酚50天后,仍可见有完整原核的形成,并未见有明显的染色体畸变。综述上列结果,似乎表明口服醋酸棉酚虽可影响人精子对去除透明带金黄地鼠卵的穿透率,而进入卵内的精子仍可形成原核及染色体。因此,仅从成熟精子的生理功能而论,口服醋酸棉酚期间它似乎并不产生可察觉的致畸效应,这与醋酸棉酚对体细胞并无致畸作用的报道相一致。