番茄SlDP1基因的克隆、生物信息学及表达特性分析

DP基因属于DP/E2F转录因子家族,其编码的蛋白是E2F蛋白的二聚化分子伴侣,可能参与调控细胞周期、DNA复制、生长、分化、凋亡等多种细胞进程。根据SGN数据库登录的番茄序列,通过RT-PCR方法从野生型番茄中克隆了一个DP基因,命名为SlDP1。生物信息学预测,SlDP1蛋白定位于细胞核,具有保守的DNA结合域、二聚化区域和C-末端及多个磷酸化位点。蛋白质二级结构预测SlDP1蛋白含51.50%的环状结构,34.55%的α螺旋和2.66%的β折叠。荧光定量PCR分析外源激素对野生型番茄SlDP1基因表达量的影响,发现该基因受外源性乙烯前体ACC的诱导。对环境因子应答的RT-PCR结果表明,在伤害和盐处理的叶中该基因表达不受诱导,而盐处理的根中该基因表达量提高。SlDP1基因表达模式分析表明,该基因在根、花、萼片及成熟时期果实中表达量较高。这些结果为进一步研究SlDP1基因在番茄生长发育过程的功能奠定了基础。     

番茄 DEAD-box RNA 解旋酶基因 SlDEAH1 的克隆及表达分析简

DEAD-box RNA解旋酶是一种特殊的RNA分子伴侣,参与了RNA代谢,包括前体RNA剪接、核糖体合成、RNA降解以及基因表达,并对植物的发育和抗性等也具有重要作用。根据已报道的拟南芥DEAD-box蛋白,通过同源比对,在NCBI据库中筛选得到一个DEAD-box RNA解旋酶同源蛋白,命名为SlDEAH1,并根据其基因序列设计特异引物,应用RT-PCR方法从野生型番茄（Solanum lycopersicum）AC⁺⁺中克隆得到了该基因的全长编码区序列。利用生物学网站、软件及实时荧光定量PCR方法,对其进行生物信息学、表达模式、胁迫及激素处理分析。结果表明：SlDEAH1包括2 073 bp的开放阅读框,编码690个氨基酸残基,其编码蛋白有9个保守结构基序,其所涉及到的ATP结合、ATP水解及RNA结合等功能对于解旋酶活性是至关重要的;表达模式分析表明SlDEAH1基因可能在野生型番茄萼片、叶片发育及果实成熟方面起到重要作用;高温、低温、脱水、伤害、盐胁迫不同程度的诱导了SlDEAH1的表达,但在根中该基因的表达受盐胁迫抑制;ABA、ACC、IAA、GA₃、MeJA和ZT均不同程度诱导了SlDEAH1的表达,其中ABA诱导效应最为明显。这些结果为进一步研究SlDEAH1在番茄发育和胁迫响应中的功能奠定了基础。     

番茄泛素蛋白基因LeEBF1和LeEBF2的克隆表达分析

通过RACE和RT-PCR方法从番茄中克隆了LeEBF1（EIN3 binding F-box protein 1）和LeEBF2（EIN3 binding F-box protein 2）的全长cDNA序列,两个基因LeEBF1、LeEBF2全长分别是2 866和2 891 bp,对序列的分析表明,它们的开放阅读框分别是1 911和1 995 bp,编码区编码637和665个氨基酸残基,在氨基端含保守的F-box区域和在羧基端有14个亮氨酸重复单位,通过BLAST软件和DNAMAN分析表明这两个基因的氨基酸序列与拟南芥EBF1和EBF2有58.6％相似,同时又与其他物种的EBF蛋白的F-box区域比较有24.4％到73.2％的相近。Northern杂交指出：LeEBF1与LeEBF2在野生型和Nr的幼叶中的表达量高于成熟叶;当在果实发育期,LeEBF1与LeEBF2在青果期的表达量相比其他时期要弱。初步结果表明,LeEBF1与LeEBF2可能在番茄的生长发育中起着重要的作用。     

AtsHsp17.6-CⅠ和AtsHsp17.6-CⅡ基因对非生物胁迫的应答研究

小分子热激蛋白是植物受到热胁迫后的主要表达产物之一,与植物细胞耐热有密切关系。该研究发现,拟南芥小分子热激蛋白基因AtsHsp17.6-CⅠ和AtsHsp17.6-CⅡ 除热激之外,重金属离子Ni⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Al³⁺均能诱导这2个热激蛋白基因的表达;氧化胁迫和渗透胁迫同样也能诱导它们表达。该研究将由CaMV35S启动子驱动的这2个小分子热激蛋白基因导入拟南芥,RT-PCR分析表明,2个小分子热激蛋白基因在转基因植物中呈现组成型表达。实验结果表明,组成型表达小分子热激蛋白基因AtsHsp17.6-CⅠ的转基因植物表现出对6 μmol·L^-1 Cd²⁺胁迫、0.4% NaCl胁迫的耐受性。研究表明,这2个小分子热激蛋白基因可能参与着多种抗逆途径,推测其能够减轻或抵抗逆境胁迫引起的伤害并对其进行修复。     

番茄SlMYBL基因的克隆、生物信息学及表达特性分析

MYB转录因子构成了植物体内最大的转录因子家族之一,参与植物生长发育和代谢,是一种重要的转录因子。根据NCBI数据库登录的番茄序列,通过RT-PCR方法从野生型番茄AC++中克隆得到全长为1 630 bp基因片段,生物信息学分析表明,该基因ORF为1 245 bp,编码414个氨基酸,该编码蛋白有保守的DNA结合域:MYB-like、C-末端和多个磷酸化位点,主要定位于线粒体基质和细胞质中,根据其结构域该基因命名为SlMYBL。二级结构预测显示SlMYBL蛋白含有26.33%的α螺旋,65.46%的无规则卷曲和6.28%的延伸链及1.93%的β折叠。表达模式分析表明,SlMYBL在成熟叶、茎及萼片中表达量较高。荧光定量PCR分析表明SlMYBL基因表达量受外源激素IAA、ABA等的诱导。非生物胁迫结果表明,在高温、低温、伤害和盐处理中该基因表达也受到不同程度的诱导。该实验结果为进一步研究SlMYBL基因在番茄生长发育过程中的功能奠定了基础。     

丹参ACC氧化酶基因(SmACO1)的克隆与序列分析

依据丹参转录组数据库序列信息,采用RT-PCR和染色体步移技术从丹参中首次克隆得到ACC氧化酶基因,命名为SmACO1(GenBank注册号为JQ026111)。该基因gDNA序列长1 347 bp,由3个外显子和2个内含子组成;cDNA全长1 117 bp,包含945 bp的开放阅读框,编码314个氨基酸残基。生物信息学分析显示SmACO1为无信号肽与跨膜结构域,且定位于细胞质的稳定亲水蛋白,含有Fe²⁺依赖的加氧酶结构域。实时荧光定量PCR结果表明,SmACO1基因在丹参不同组织器官中差异表达,花中表达量最高;其表达受到病原菌和茉莉酸甲酯的诱导,表明SmACO1基因可能在植物防御反应中发挥作用。     

茶树脂氢过氧化物裂解酶基因CsiHPL1的克隆及表达

根据茶树基因CsiHPL1的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR方法从茶树品种龙井43′中克隆了CsiHPL1序列,并分析了CsiHPL1在生物和非生物胁迫下的诱导表达情况及亚细胞定位。结果表明,CsiHPL1包含一个1 476 bp的最大开放阅读框,编码491个氨基酸,预测为13-HPL基因。Real-Time PCR分析结果表明,CsiHPL1的表达受到茶尺蠖取食、机械损伤和茉莉酸的诱导;构建了CsiHPL1与绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组表达载体,经农杆菌瞬时转化烟草叶片,利用激光共聚焦显微镜在叶绿体中观察到GFP荧光,表明CsiHPL1编码的蛋白质为叶绿体蛋白质。     

斑茅δ-OAT基因克隆及其序列分析

利用RT-PCR和RACE技术从斑茅（Erianthus arundinaceus）中分离出编码鸟氨酸-δ-氨基转氨酶基因的全长cDNA序列,序列全长1 680 bp,编码454个氨基酸。通过对哺乳动物、高等植物、微生物的δ-OAT基因编码的氨基酸序列进行同源比对,发现斑茅δ-OAT基因同其近缘属植物甘蔗的同源性最高（87%）,同其他高等植物的同源性次之（约为70%）,而同动物的同源性最低（约为60%）。在斑茅δ-OAT基因编码的氨基酸序列的5′端未发现线粒体定位序列,同甘蔗δ-OAT基因一样。斑茅δ-OAT基因具有完整的鸟氨酸转氨酶功能区rocD。利用定量RCR（real-time PCR）对30%PEG胁迫下的斑茅δ-OAT基因表达量进行研究,结果表明δ-OAT基因在胁迫12 h表达量达到最高,约为对照的4.1倍;胁迫2 h δ-OAT基因表达量反而有所降低。     

有效提取病毒诱导基因沉默植株中DNA的方法

根据PCR反应的要求,用改良的CTAB法,以番茄植株为材料,实现了微量番茄叶片基因组DNA的快速提取。提取基因组DNA所用的组织量少,所得的DNA经过电泳检测虽有降解,但足以用于PCR检测,以其作模板扩增中国番茄黄化曲叶病毒诱导的硫黄素酶（Su）基因沉默植株中病毒组分中的DNAmβ和1.7 A,片段大小分别为1 300、500 bp。测序结果证明是相应基因的部分片段。该方法的材料不需要使用液氮,可以单人大批量提取,并在基因沉默的番茄植株中能稳定而准确的规模化PCR检测。     

重组蛋白GST-OsCATB的表达特性研究

为了阐明水稻Catalase（CAT）的酶学功能,首先需要获得出足量的、活性的该酶蛋白。本研究克隆了水稻OsCAT_B基因(GenBank accession No.D26484),构建到原核表达载体pGEX-6p-3中形成重组蛋白,继而转入E.coli菌株BL21中进行表达特性研究。结果表明,GST-OsCAT_B融合蛋白在E.coli中进行了过量表达,表达受到诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度和诱导体系等多因素影响;通过谷胱甘肽Sepharose-4B亲合层析,纯化出足量、活性的融合蛋白GST-OsCAT_B,每克表达细胞（干重）中得率为51 mg GST-OsCAT_B。     

发菜中超氧化物歧化酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用基因工程技术从发菜总DNA中克隆了一段的基因序列,该序列与基因库中已公布的编码地木耳（Nostoc commnue）超氧化物歧化酶的氨基酸序列同源性为97%。将该基因插入含T7启动子质粒pET-32中构建表达质粒pET-sod,然后将该表达质粒转入大肠杆菌BL21中进行蛋白表达,表达菌株用1 mmol·L^-1 IPTG诱导表达数小时后,产生较多的重组的蛋白,且该蛋白以可溶性蛋白形式存在。SDS-PAGE分析表明,在相对分子量约为22 kd的位置有一条明显蛋白质带。将诱导表达后的蛋白通过亲和层析的方法进行蛋白纯化;NBT光还原法测定表达产物的比活力,每毫克纯化蛋白约为2 550 U。对纯化后的蛋白进行高温胁迫研究,将该纯化蛋白在60℃高温下胁迫90 min后,其活性为原（未经胁迫）蛋白活性的85%。     

丹参变应原基因（Sam a1）的克隆及其原核表达

Ⅰ型变态反应是小分子植物蛋白结合IgE抗体引起的一种疾病。本文首次从丹参中克隆出变应原蛋白基因,命名为：Sam a1（GenBank注册号：EU122383）。Sam a1包含483 bp的开放读码框,编码160个氨基酸残基。其推导氨基酸（命名为：Sam a1）具有Bet v1结构域,属于病原菌相关的Bet v1蛋白家族,与苹果中变应原mal d1类似蛋白同源性高达66％。三级结构预测模型显示Sam a1含有T细胞主要抗原决定簇的C端α螺旋。实时定量PCR结果显示：黄瓜细菌性角斑病菌和NaCl溶液诱导下Sam a1的表达呈现上调趋势,表明Sam a1可能与病程相关蛋白和盐胁迫相关。Sam a1转入大肠杆菌M15后,表达出与预测蛋白大小相当的目标蛋白,IPTG诱导后5～7 h目标蛋白可大量表达。本研究为从植物分子机制上了解中药变态反应作用机制奠定了基础,尤其对中药产业的发展具有重要的意义。     

紫茎泽兰花蕾发育过程中类Beclin1基因的克隆表达分析

以紫茎泽兰不同发育时期花蕾为实验材料,通过光学显微观察、DNA ladder检测表明紫茎泽兰花蕾发育过程中绒毡层有PCD现象发生,自紫茎泽兰花蕾中克隆长为679 bp的Beclin1 cDNA基因部分片段,同烟草叶片的Beclin1基因序列（AY701316）同源性为98%,通过Northern blotting分析,在紫茎泽兰花蕾发育过程中细胞程序性死亡（PCD）相关Beclin1基因表达在花蕾发育第Ⅱ期和Ⅲ期较为旺盛,且在花蕾发育第Ⅱ期最强烈。本研究首次克隆并证实紫茎泽兰花蕾Beclin1基因与PCD有一定的相关性,为分析紫茎泽兰入侵机理提供新的思路和手段。     

薇甘菊乙醇酸氧化酶基因的克隆、序列分析和原核表达

利用SSH和RACE相结合的方法获得了薇甘菊乙醇酸氧化酶基因cDNA全长,并对该序列进行了生物信息学分析。随后将该基因的cDNA编码区克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒,转化到大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中进行表达。序列分析表明,薇甘菊乙醇酸氧化酶基因cDNA全长1 363 bp,编码369个氨基酸,命名为MmGO（GenBank登录号EU716626）,推测的MmGO分子量为40.32 kDa,等电点为8.99。系统进化分析表明,MmGO与芸苔的GO序列亲缘关系比较近。将该基因重组到pET-32a(+)中进行原核表达,经0.1 mmol·L^-1 IPTG,25℃诱导4 h,获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His MmGO,Western-blot证实表达的6×His-MmGO能与抗6×His的单抗发生特异性反应,分子量约为60 kDa,与预测的融合蛋白6×His-MmGO分子量相符。为进一步研究融合蛋白6×His-MmGO的活性和功能奠定了基础。     

白桦开花位点Flowering Locus T（FT）基因的分离及其表达

FT及其同源基因在促进植物成花和发育阶段转变过程中起重要作用。应用RT-PCR和RACE技术分离了白桦FT基因的cDNA,全长为928 bp,其开放阅读框为525 bp,编码174个氨基酸。预测的蛋白质分子量为19.6 kDa,理论等电点为7.73。该预测蛋白序列含有保守的PEBP蛋白结构域,命名为BplFT,并在GenBank注册,登录号为JQ409561。该基因序列同其它16种植物的相似性为74%～93%,其中与无花果（Ficus carica）的相似度最高为93%,与拟南芥（Arabidopsis thaliana）的相似度最低为74%,并构建了该基因序列的进化树。通过qRT-PCR的方法检测BplFT基因在白桦不同时期不同组织中的转录表达,在营养器官的表达高于花器官,成熟组织要高于幼嫩的组织,在成熟茎中的表达量最高,推测BplFT基因在成熟的营养器官发育中起重要作用,并可能参与调控次生细胞壁的形成。另外,选择了白桦雄花序突变体进行该基因的转录表达分析,该基因在突变体雌花序、雄花序、幼叶及幼茎中均为上调表达,预示着BplFT基因不仅仅参与营养组织发育,在花器官发育中也具有一定的作用。     

标记蛋白HPT的表达、纯化及免疫活性鉴定

构建含有HPT的原核表达质粒,经诱导表达纯化后获得HPT抗体。从含有hpt的质粒pCambia1301上扩增目的基因,经SalⅠ和NotⅠ双酶切后与原核表达载体pET-28b（+）进行粘性末端连接,成功构建了pET-28b-hpt质粒,并转化到宿主细菌大肠杆菌Rosset(DE3)中进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET-28b-hpt原核表达载体在E.coli Rosset菌株中以包涵体的形式高效表达了HPT蛋白,并以纯化的目的蛋白为抗原免疫兔制备了多克隆抗体。利用本方法可以获得特异性强、灵敏度高的多克隆抗体。     

飞机草花蕾中Beclin1基因的克隆与表达

本文以入侵植物飞机草的不同时期花蕾为材料,利用RT-PCR法扩增得到了与PCD相关的类Beclin1基因的部分cDNA序列(大约700bp),与烟草叶片中的基因序列（AY701316）同源性为95%;Northern blotting结果表明类Beclin1基因在花蕾发育中期的表达量高于初期和后期;通过DNA ladder检测表明在花蕾发育过程中伴随着PCD的发生,这些结果表明花蕾发育中期是PCD初期发生的活跃期,是绒毡层逐渐退化和花粉不断形成的过程。通过对生殖过程中的细胞程序性死亡的分子生物学研究,初步揭示了飞机草入侵过程与PCD的相互关系。