两相分配法制备南极红酵母质膜

用葡聚糖 T-500(Dextran T-500)和聚乙二醇(PEG-3350)两相体系制备南极红酵母(Rhodotorula sp.)菌株 NJ298 的质膜.首先在 2 mmol/L KCl 浓度下,选用5种不同的聚合物浓度(5.6%、5.8%、6.0%、6.2%、6.4%,W/W),研究了 NJ298 质膜在两相体系中的分配情况,在此基础上进一步研究了 KCl 浓度(2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L、10 mmol/L)对 NJ298 质膜的纯度及得率的影响.结果表明,选用6.0%聚合物浓度,4 mmol/LKCl 的两相分配体系,分离3次可得到相对纯度在 78.2%的南极红酵母质膜组分,标志酶鉴定及磷钨酸染色电镜检测均表明获得了高纯度密实的正向型的质膜囊泡.这为进一步研究该菌株的南极极端环境适应机制奠定了基础.     

两相分配法制备玉米根质膜及其纯度鉴定

用Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ５００,ＰＥＧ３３５０两相体系制备玉米根质膜,首先在高盐浓度下选用五种不同的聚合物浓度,研究了玉米根系膜在两相体系中的分配情况,在此基础上研究了ＮａＣｌ浓度对玉米根质膜的纯度及得率的影响。结果表明,制备了玉米根质膜选用６．２％聚合物浓度,７．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ的两相体系比较合适。     

两相分配法制备玉米根质膜及其纯度鉴定

用ＤｅｘｔｒａｎＴ５００,ＰＥＧ３３５０两相体系制备玉米根质膜．首先在高盐浓度（２２ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）下选用五种不同的聚合物浓度（５．８％、６．０％、６．２％、６．３％、６．４％,Ｗ／Ｗ）,研究了玉米根质膜在两相体系中的分配情况,在此基础上进一步研究了Ｎａ－Ｃｌ浓度（２、４、５、１１、２２ｍｍｏｌ／Ｌ）对玉米根质膜的纯度及得率的影响．结果表明,制备玉米根质膜选用６．２％（Ｗ／Ｗ）聚合物浓度,７．５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的两相体系比较合适．标志酶鉴定及低ｐＨ值磷钨酸染色电镜检测均表明获得了高纯度密实的正向型的质膜囊泡,质膜标志酶ＶＯ３－４－ＡＴＰａｓｅ的活性潜势达８８．９％．     

两相法分离纯化橡胶树树皮质膜

橡胶树树皮质膜H~+-ATPase在橡胶树产排胶过程中扮演着重要角色,制备高纯度及高活性的质膜是研究质膜H~+-ATPase特性和功能的必要条件。该研究以一年生巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)树皮为材料,利用差速离心法获得粗膜微粒体,通过两相分配法分离纯化质膜,并研究两相体系中不同浓度聚合物(5.9%、6.1%、6.3%、6.5%、6.7%,W/W)和KCl(2、5、8、11、14 mmol·L~(-1))对质膜蛋白得率和纯化效率的影响。通过Bradford法对质膜蛋白得率进行检测,同时采用酶活性检测法对质膜纯度进行检测,分析结果表明选用6.4%(W/W)聚合物浓度和5mmol·L~(-1)KCl组成的两相体系可获得较高纯度和得率的橡胶树树皮质膜。通过电镜观察法在形态学上对质膜纯度进一步评价,利用铅铀能侵染全部膜组分使其染色,而磷钨酸只能专一性地侵染质膜并使其染色这一特性,分别使用铅铀和磷钨酸对切片进行染色,并通过透射电镜对切片染色程度进行直接观察,结果表明提取的粗膜微粒体中质膜组分较少,存在大量的细胞器膜污染,而纯化后的质膜膜组分较单一,其他膜组分污染较少,而且质膜大小较均一,可以用于进行后续橡胶树树皮质膜H~+-ATPase特性和功能的研究。     

胡杨质膜的纯化及其H~ -ATPase活性的研究

用DextranT 5 0 0 ,PEG 335 0两相分配法分离并纯化了悬浮培养的胡杨细胞质膜 .不同聚合物浓度(5 5 %、 5 7%、 5 9%、 6 1%、 6 3%、 6 5 % )和KCl浓度 (0、 5、 10、 15mmol/L)对分离效果影响的研究结果表明 ,采用聚合物浓度为 5 9%和无盐存在的两相分配体系可获得纯度较高的胡杨细胞质膜 .纯化的质膜H ATPase的活力提高 8倍 ,且酶定向程度较高 ,这为进一步研究胡杨细胞质膜特性及获得高纯度H ATPase提供了良好基础     

两相法分离地被菊叶片质膜的研究

以地被菊(Dendranthema×grandiflorum Kitamura)叶片为材料,通过水溶性聚合物Dextran T-500和PEG 3350所构成的两相分配体系制备质膜。在一定盐浓度（5 mmol.L-1 NaCl）下选用5种不同的聚合物浓度（5.8%、6.0%、6.2%、6.4%、6.6%,W/W）,研究了地被菊叶片质膜在两相体系中的分配情况,在此基础上进一步研究了不同盐浓度（2、4、5、10、20 mmol.L-1 NaCl）对地被菊叶片质膜的纯度及蛋白产率的影响。标志酶鉴定及磷钨酸染色电镜检测的结果表明,地被菊叶片选用6.2%（W/W）聚合物浓度和7 mmol.L-1 NaCl组成的两相分配体系可获得较高纯度的密实正向型质膜囊泡。     

两相法分离地被菊叶片质膜的研究

以地被菊(Dendranthema×grandiflorum Kitamura)叶片为材料,通过水溶性聚合物Dextran T-500和PEG 3350所构成的两相分配体系制备质膜.在一定盐浓度(5mm01·L-1NaCl)下选用5种不同的聚合物浓度(5.8%、6.0%、6.2%、6.4%、6.6%,W/W),研究了地被菊叶片质膜在两相体系中的分配情况,在此基础上进一步研究了不同盐浓度(2、4、5、10、20mm01·L-1NaCl)对地被菊叶片质膜的纯度及蛋白产率的影响.标志酶鉴定及磷钨酸染色电镜检测的结果表明,地被菊叶片选用6.2%(W/W)聚合物浓度和7mm01·L-1NaCl组成的两相分配体系可获得较高纯度的密实正向型质膜囊泡.     

红酵母属中的一个新种

自云南省哀牢山常绿阔叶林根际土壤中分离出一株酵母菌Ⅱ-33。该菌株细胞卵圆,出芽时胞壁结构为内分芽型,多端芽殖,不产生子囊孢子和掷孢子;在麦芽汁琼脂上产生红色胡萝卜素,颜色反应阳性,菌落平滑,有光泽,质地软而呈粘液状,不发酵任何糖,能同化麦芽糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、松三糖和硝酸钾,能分解尿素;细胞水解物中含甘露糖、葡萄糖和半乳糖。按其形态、培养特征和生理生化特性,酵母菌Ⅱ-33应归入红酵母属(Rhodotorula)中,经与近似种比较,认为是红酵母属中的一个新种,命名为云南红酵母(Rhodotorula yunnanensis sp.n.)。     

两相体系中菌体转化法制备2-苯乙醇的研究

目的:利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CICIMY008 6)菌体在油酸-水两 相体系中转化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇,以期解除产物抑制的同时降低萃取相油酸对转化的 不利影响,提高2-苯乙醇产量.方法:对2-苯乙醇的生成与菌体生长的关系进行考察,以确 定菌体转化法的可行性;通过单因素试验和正交设计试验获得转化培养基最佳配方;对菌体 转化条件进行优化.结果:向装液量为25mL/250mL转化培养基中加入0.6g 酵母湿菌体,30℃ 、100r/min条件下转化,9h加入等体积油酸,催化27h,产物浓度达4.55g/L.结 论:2-苯乙醇的制备可以使用菌体转化法,该法可在一定程度上克服两相转化体系中油酸的毒性影响.     

一株红酵母产类胡萝卜素的研究

对自然分离得到的产类胡萝卜素菌株Ｈｍ６８进行了菌种鉴定,色素成份分析,确定其产生的类胡萝卜素中含有β胡萝卜素。该菌株在１％麦芽糖为唯一碳源的培养基中生长良好,类胡萝卜素产量达６２５μｇ／ｇ。     

大鼠背根神经节细胞质膜的双水相法纯化及其蛋白质组学研究

大鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)细胞是一种初级感觉神经元,能传导触觉、痛觉、温觉等神经冲动．为了对少量的DRG组织细胞进行质膜蛋白质组学分析,综合利用差速离心与双水相相结合的方法富集DRG质膜．然后通过SDS-PAGE、CapLC-MS/MS和生物信息学方法对其中的蛋白质进行鉴定和分析．Western blotting图谱扫描后经过Quantity One软件分析,双水相纯化后的质膜与差速离心后得到的粗质膜相比相对浓度增加了2.3倍,与匀浆液相比增加了15倍． 经过大鼠IPI数据库以及相关文献检索, 有729个蛋白质得到鉴定, 其中547个蛋白质具有GO (gene ontology)注释信息,有159 (21.8 %)个蛋白质定位在质膜上．通过对大鼠DRG质膜的蛋白质组学研究,得到了大鼠DRG的质膜蛋白质的分析数据,且提供了一种适用于少量样品的蛋白质组学的分析路线．     

双水相纯化的人肺腺癌和癌旁正常肺组织质膜蛋白质组差异分析

肿瘤标志物对于肺腺癌病人的临床诊断和预后具有重要意义. 本研究根据临床诊断选取人肺腺癌组织和癌旁正常肺组织为研究对象,采用差速离心联合双水相法纯化组织细胞质膜,运用同位素标记相对和绝对定量技术结合高效液相色谱 串联质谱技术,鉴定出肺腺癌组织和癌旁正常肺组织的差异蛋白质41种. 同癌旁正常肺组织相比,18个蛋白质在肺腺癌组织中表达上调,23个蛋白质在肺腺癌组织中表达下调. 生物信息学分析发现,差异质膜蛋白质FLOT1、CAV1和ITGB1均处于蛋白质相互作用网络的重要位置,可能参与了肺腺癌相关信号转导.利用蛋白质印迹和免疫组织化学染色验证,差异蛋白质FLOT1、CAV1和ITGB1在肺腺癌织和癌旁正常肺组织的表达情况,其验证结果与蛋白质组学研究结果一致. 研究结果对肺腺癌诊断标志物和肺腺癌癌变分子机理研究具有重要意义.     

The Isolation of Plasma Membrane from Vicia faba Leaves and Pollen Tubes of Luffs cylindrica by the Two-Polymer Phase System

A method for the isolation of plasma membrane enriched fraction from plant sources is described. An aqueous two-phase system is suitable for the isolation of plasma membrane. Purified plasma membrane fractions have been prepared from Vicia faba leaves and pollen tubes of Luffa cylindrica. The determination of marker enzymes shows that the plasma membrane has a high affinity for the polyethylene glycol-rich upper phase, whereas those membranes from mitochondria, chloroplasts and other organelles prefer the dextran-rich lower phase and the interface. The plasma membrane was identified with the aid of silicotungstic acid-chromic acid staining. In the upper phase there are mainly stained elliptical vesicles, whereas in the lower phase there are many differnet kind of unstained vesicles. This result is coincident with the marker enzyme examination. The two-phase method for the isolation of plasma membrane may be widely applied not only to nongreen tissues but also to green tissues of plants.     

Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters

Many plasma membrane transporters in yeast are endocytosed in response to excess substrate or certain stresses and degraded in the vacuole. Endocytosis invariably requires ubiquitination by the HECT domain ligase Rsp5. In the cases of the manganese transporter Smf1 and the amino acid transporters Can1, Lyp1 and Mup1 it has been shown that ubiquitination is mediated by arrestin-like adaptor proteins that bind to Rsp5 and recognize specific transporters. As yeast contains a large family of arrestins, this has been suggested as a general model for transporter regulation; however, analysis is complicated by redundancy amongst the arrestins. We have tested this model by removing all the arrestins and examining the requirements for endocytosis of four more transporters, Itr1 (inositol), Hxt6 (glucose), Fur4 (uracil) and Tat2 (tryptophan). This reveals functions for the arrestins Art5/Ygr068c and Art4/Rod1, and additional roles for Art1/Ldb19, Art2/Ecm21 and Art8/Csr2. It also reveals functional redundancy between arrestins and the arrestin-like adaptors Bul1 and Bul2. In addition, we show that delivery to the vacuole often requires multiple additional ubiquitin ligases or adaptors, including the RING domain ligase Pib1, and the adaptors Bsd2, Ear1 and Ssh4, some acting redundantly. We discuss the similarities and differences in the requirements for regulation of different transporters.     

酵母双杂交系统在膜蛋白相互作用研究中的应用

膜相关蛋白约占细胞总蛋白质中的1/3,它们大都参与了细胞的诸多生理、病理过程和药物反应机理。研究膜蛋白的相互作用对于揭示细胞的生命活动规律及寻找药物作用靶标都有重要的意义。由于膜蛋白本身的特性及其难以进入核内等原因,经典的酵母双杂交技术并不适用于检测膜蛋白间的相互作用。针对在活细胞中研究膜蛋白相互作用的需要,近年来国际上先后发展了一系列用于膜蛋白相互作用研究的酵母双杂交新系统,并取得了许多重要发现。     

亲和层析法分离纯化玉米精细胞质膜特异糖蛋白

 亲和层析法分离纯化玉米精细胞质膜特异糖蛋白陈丽邵邻相汪洁杨中汉（北京大学生命科学学院,北京１００８７１）ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＳｐｅｒｍＣｅｌＰｌａｓｍａＭｅｍｂｒａｎｅＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆＺｅａｍａｙｓｂｙＡ...