沉默马铃薯Sgt1-3基因减少块茎糖苷生物碱积累

马铃薯茄啶 糖基转移酶（solanidine glycosyltransferase,Sgt）家族成员Sgt1、Sgt2和Sgt3参与糖苷生物碱（glycoalkaloids,GAs）合成。已有研究证明,抑制该家族任一成员表达可影响马铃薯块茎中糖苷生物碱合成;然而,对Sgt家族成员的单基因实施调控很难有效降低块茎中总糖苷生物碱的积累。为降低马铃薯块茎中总糖苷生物碱的含量,本研究拟采用RNAi技术,对糖苷生物碱合成代谢途径末端酶基因家族成员Sgt1 3在转录水平进行共调控。为实现这一目的,构建了块茎特异性启动子Patatin驱动的,以Sgt1、Sgt2和Sgt3基因为靶向的RNAi表达载体pCEI-PFR,采用农杆菌介导法转化马铃薯茎段,获得10株可沉默Sgt1、Sgt2和Sgt3基因表达的Patatin RNAi融合基因的转基因植株。实时定量PCR（RT-qPCR）结果显示,Sgts基因的相对表达量分别降低了大约32%～60%（Sgt1）、29%～55%（Sgt2）和25%～66%（Sgt3）,而草甘膦抗性基因--5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, EPSPS）的表达量则增加了约48%～135%。高效液相色谱法（HPLC）证明,尽管转基因株系的绿色组织中糖苷生物碱含量与野生型无显著差异,但块茎中糖苷生物碱分别比野生型降低了46%～59%（庄薯3号）和42%～62%（Favorita）。上述结果提示,复合沉默茄啶 糖基转移酶家族基因可降低马铃薯块茎中糖苷生物碱的积累。此外,该结果可能对研究马铃薯不同组织间糖苷生物碱的分布和积累,以及马铃薯种质资源的创新开发具有一定启示。     

马铃薯糖苷生物碱对人血胆碱酯酶的抑制

马铃薯糖苷生物碱是一类有异味有毒性的含氨甾族化合物,其致毒机理与有机磷杀虫剂相似,表现出对人体内胆碱酯酶活性的抑制,使胆碱能神经兴奋增强,引起一系列中毒症状。从块茎萌发芽中提取的总糖苷生物碱的毒性较高,对人血胆碱酯酶的体外抑制率为６３．０８％,单个糖苷生物碱（α茄碱和α卡茄碱）的毒性较低,抑制率分别为５２．０８％和４１．１５％,总糖苷生物碱的水解产物糖苷配基基本无毒性,抑制率仅为１１．３６％。     

siRNA与miRNA在生物基因调控中的沉默机制比较

siRNA和miRNA的沉默机制是生物基因调控的重要手段之一. 小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）是RNA干扰的引发物,激发与之互补的目标mRNA沉默. 非编码RNA中的微小RNA（microRNA,miRNA）,能够识别特定的目标mRNA,通过与mRNAs的3′ 非翻译区结合,影响该目标蛋白的翻译水平. siRNA和miRNA的基因调控机制对生物学研究及疾病的病因和治疗等有直接影响. 本文主要对siRNAs和miRNAs的生物起源及沉默机制进行比较性论述：提出Dicers酶蛋白、Ago蛋白以及20 nt~25 nt的双链RNAs的 3类大分子是RNA沉默的特征结构,并进行了说明性论述|总结性叙述了siRNA和miRNA的2类小分子经典沉默机制,并提出其异同点. 最后,本文根据近期研究进展,对siRNA和miRNA的生物起源及沉默机制提出了新的疑问.     

半乳糖凝集素-3(galectin-3)基因沉默对Eca109人类食管癌细胞的影响

半乳糖凝集素-3(galectin-3)是一种多功能的β-半乳糖苷结合凝集素,涉及包括细胞生长、粘附、增殖、进展、转移以及凋亡等多种生物学功能,在恶性肿瘤中高表达。以前的研究已经证实了galecin-3过表达在Eca109人食管癌细胞的生物学作用。本研究试图通过进行小干扰RNA(siRNA)介导的galectin-3沉默,以分析galectin-3沉默对食管癌细胞生物学行为的影响。我们采用Western blotting和RT-qPCR被用来证实在蛋白质和mRNA水平上的galectin-3低表达,使用细胞计数试剂盒-8评估细胞增殖,用Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞术检测Eca109细胞的凋亡。研究结果表明,转染后72 h,si Gal-3组Eca109细胞增殖明显低于siRNA对照组和未处理组(p<0.001)。Transwell实验结果显示,与其他组相比,galecin-3的抑制作用显著降低Eca109细胞的迁移和侵袭能力(p<0.05)。与siRNA-对照组和未处理组相比,galectin-3敲低显著增加Eca109细胞的凋亡率(p<0.05)。敲低Eca109细胞中galecin-3的表达后,细胞增殖、迁移和侵袭能力下降,而细胞凋亡增强,说明galectin沉默可作为食管癌治疗的新策略。     

阿格蛋白2:RNA诱导基因沉默复合物的切片机

RNA干扰是生物体基因表达调节的一种重要方式,由RNA诱导的基因沉默复合物（RISC）来介导完成,这个复合物中除了微小RNA外,最新研究表明阿格蛋白2是其中的主要应答元件,它本身具有核酸内切酶活性,可以有效启动mRNA的剪切反应而实现对基因表达的调节,这个进展使我们对RNA干扰过程有了更为详尽的理解。     

马铃薯糖苷生物碱对腐皮镰刀菌呼吸作用及其活性氧代谢的影响

【背景】腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)是一种分布较为广泛的致病性真菌,可引起多种植物的土传病害,是枸杞根腐病的主要致病菌之一。马铃薯糖苷生物碱(potatoglycosidealkaloids,PGA)为一类植物源提取物,其原材料种植广泛、成本低廉,对腐皮镰刀菌具有较强的抑菌活性。【目的】探究PGA对腐皮镰刀菌呼吸作用及活性氧(reactive oxygen species, ROS)代谢的影响,从能量代谢角度揭示其可能的抑菌机理。【方法】以马铃薯芽为原材料,采用乙酸-氨水沉淀法提取PGA,以腐皮镰刀菌为供试病原菌,通过PDA和PDB培养体系考察PGA对腐皮镰刀菌菌丝生长的抑制作用,并确定半最大效应浓度(EC50);采用氧电极仪检测PGA对腐皮镰刀菌呼吸作用的影响;并通过PDB液态培养试验体系,研究PGA对腐皮镰刀菌抗氧化酶系统、ROS及其代谢产物丙二醛(malondialdehyde, MDA)的影响。【结果】PGA处理下菌丝体呼吸速率明显下降,且随着PGA处理时间的延长,表现出一定的时间浓度效应。PGA处理使胞内过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2-)含量显著增高(P...     

RNAi介导的OsBTF3基因沉默及其对水稻籽粒相关性状的影响

为了创制OsBTF3基因沉默的水稻植株、验证该基因在水稻籽粒相关性状中的功能、评价其在水稻遗传改良中潜在的应用价值,设计和合成OsBTF3基因序列的引物、扩增部分基因片段,构建RNAi基因沉默载体、通过农杆菌介导转化愈伤组织、植株再生、潮霉素抗性筛选和PCR验证、定量分析OsBTF3基因表达量,测定转基因水稻籽粒相关性状。结果表明,成功地获得了20个T1代OsBTF3-RNAi转基因株系,OsBTF3基因表达量得到显著的抑制和干扰,抑制效果平均达到85%;与野生型对照株相比,5个所测定RNAi转基因株系的穗长、穗粒数、千粒重和穗粒重等籽粒相关性状明显地减小或降低。因此,RNAi介导的基因沉默导致了OsBTF3基因表达水平抑制以及在籽粒性状中的功能缺失;OsBTF3可能是一个调控水稻籽粒相关性状重要的功能基因。     

放线菌Streptomyces nojiriensis SCSIO m34-1吩嗪生物碱类次级代谢产物的研究北大核心CSCD

从我国黑龙江漠河泥土中分离得到一株放线菌,通过16S rRNA基因测序分析,鉴定该菌株为Streptomyces nojiriensis SCSIO m34-1。采用摇瓶发酵方法对该菌株进行发酵,发酵产物经硅胶柱色谱及半制备高效液相分离得到7个化合物,利用HR-MS、1D和2D NMR波谱数据分析,鉴定其结构分别为izuminoside D(1)、izuminoside A(2)、solphenazine E(3)、solphenazine D(4)、solphenazine A(5)、6-羟基吩嗪-1-羧酸甲酯(methyl 6-hydroxyphenazine-1-carboxylate,6)和diastaphenazine(7),其中izuminoside D(1)是新化合物。抗真菌活性测试结果表明izuminoside D(1)在浓度为50μg/m L时,对苹果腐烂病菌(Valsa mali)和小麦赤霉病菌(Gibberella sanbinetti)有微弱抑制活性。     

黑龙江马铃薯Y病毒P1基因的特点北大核心CSCD

【目的】本研究通过对不同PVY分离物基因的测序及分析,从而了解PVY株系的多样性,进而对PVY病毒的分子检测及防治提供重要的资料和参考。【方法】本研究针对黑龙江15个马铃薯Y病毒样品的P1基因进行克隆测序和进化树分析。【结果】经比对分析,样品被分成两组,有10个样品的基因类型高度同源,且相对保守,是本地区的优势群组,无论是与国内其它地区样品比较还是与国外样品比较,其亲缘关系都有一定距离;而另一组中的5个样品的P1基因与本地优势组群有较大差异,且这5个样品间也有一定的差异,并与国内其它地区和国外一些样品的P1基因序列比较接近。通过比对Gen Bank中已上传的序列提供的PVY株系的信息,得知本次试验的P1基因与PVY^(NTN-NW)株系是相似的,且这15个样品与国内其他样品一样都是由PVY^N株系演变而来。【结论】由P1基因分析表明,PVY受环境影响较大,黑龙江10个样品的PVY在长期的进化中产生了具有地方特点的变化,而后来的5个样品说明中国大部分PVY有可能是跟随国外品种资源的引进进入,同时PVY也随国内不同区域间资源交流和种薯调运而传播。     

转录后基因沉默与植物的病毒抗性

转录后基因沉默(PTGS)是近10年发现的一种生物(特别是真核生物)细胞抵抗外来核酸入侵及保持生物自身基因组完整性的防御机制,特别是与生物的病毒抗性密切相关。PTGS最初在植物内发现,近几年又分别在真菌、动物等生物细胞内发现。经过10年的研究,我们对PTGS的机制和特点有了相当的了解。这不但对深入地了解基因的表达调控机制意义重大,而且还可为人们如何调控和利用PTGS奠定了基础。本文从PTGS的特点、PTGS与病毒抗性、PTGS在真核生物内发生的广泛性等方面进行综述,并对PTGS发生的机制进行了讨论。     

重组马铃薯X病毒载体介导的烟草γ-微管蛋白基因沉默

用重组马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)载体将γ-微管蛋白反义基因导入烟草(Nicotiana tabacum var.Samsun NN),得到了γ-微管蛋白基因沉默的烟草植株。它与侵染PVX空载体的正对照相比有明显的差异:不同形态的叶片分层交替生长;到生殖期所有的花苞都提前脱落;小孢子不能发育到四分体阶段。沉默的形态反应主要起始于顶端幼嫩组织。在沉默过程中除存在基因沉默及恢复现象外还出现靶基因水平的陡然升高,甚至有时会明显反超过正常对照水平。     

利用RNAi技术沉默小菜蛾类钙粘蛋白基因

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种调控基因表达的方法, 其通过体外合成一段与内源靶基因同源的双链RNA（dsRNA）或siRNA, 导入生物体内, 使内源靶基因中同源mRNA降解, 从而达到阻抑基因表达的目的。类钙粘蛋白（cadherin-like protein）是位于昆虫中肠刷状缘膜囊(brush border membrane vesicles, BBMV)上与钙粘蛋白(cadherin)结构相似的物质, 是多种昆虫体内Bt杀虫蛋白的受体。本研究利用基因特异引物通过RT-PCR扩增了小菜蛾类钙粘蛋白基因的2个片段（CAD1和CAD2）, 合成相对应的双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）; 并将dsRNA通过显微注射导入小菜蛾3龄幼虫体内, 测定了不同靶位点、不同剂量、不同检测时间对目的基因mRNA表达量的影响。结果表明: 将70 nL CAD1对应的dsRNA注射到幼虫体内48 h后, 基因表达量显著下降, 72 h后恢复。免疫印迹检测结果表明, 类钙粘蛋白在注射dsRNA 48 h后幼虫BBMV中的含量明显下降。本实验成功实现了小菜蛾类钙粘蛋白基因的沉默, 该体系的成功建立为利用RNAi技术分析小菜蛾及其他鳞翅目昆虫基因的功能提供了参考。     

病毒诱导的基因沉默技术用于植物色素代谢机制的研究进展

色彩是评价园艺植物观赏性状的重要指标,而植物色素是影响植物色彩表型的关键因子。植物色素及其代谢产物在植物观赏器官颜色形成、植株生长发育调节及对逆境胁迫的响应等方面发挥着重要的作用,是植物研究领域长期关注的热点问题。病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是利用植物同源依赖性防御机制,特异性降低宿主内源性基因表达的一种重要基因组学工具,能够通过快速诱导植物基因沉默表型的产生,表征基因的功能,为缺乏遗传转化体系的植物的基因功能鉴定提供高效可行的替代方案。本文综述了VIGS技术在植物色素的生物合成、降解和调控机制上的应用现状,并探讨了VIGS技术在探究色素调控机制上的潜力和未来前景,以期进一步完善对不同植物色素的代谢过程和调控机制的理解,为改良植物色彩性状提供参考依据。     

利用载体介导小干扰RNA诱导RSRC1基因沉默

目的：设计并构建人RSRC1基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人RSRC1基因的cDNA序列为靶标,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,并将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒,测序正确后将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过Western blot和荧光分析检测其抑制效果。结果：重组体测序成功后,Western blot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性RSRC1表达;将siRNA重组质粒和带GFP标签的RSRC1共转染293T细胞,荧光显微镜下GFP的亮度明显减弱。结论：获得了2条人RSRC1siRNA真核表达载体,均能有效地抑制RSRC1基因表达。     

口蹄疫病毒VP1基因转化马铃薯及其块茎专一性表达

报道了FMDV VP1基因与马铃薯块茎专一性表达class Ipatatin基因5′区融合,经农杆菌介导导入马铃薯植株,PCR、RT-PCR证实了其整合及转录表达。ELISA结果进一步表明,VP1在转基因马铃薯块茎中具有免疫活性。为探讨在马铃薯块茎中高表达VP1蛋白及进一步开发其作为FMDV口服疫苗生物反应器奠定基础。     

RNAi介导的棉铃虫氨肽酶N基因Haapn1和钙粘蛋白基因Ha_BtR沉默对Cry1Ac毒力的影响

氨肽酶N（aminopeptidase N, APN）和钙粘蛋白（cadherin）是存在于鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜囊（brush border membrane vesicles, BBMV）上Bt毒素Cry1A的受体。本实验将棉铃虫Helicoverpa armigera氨肽酶N1基因Haapn1和钙粘蛋白基因Ha_BtR双链RNA（dsRNA）注入棉铃虫4龄幼虫体内, 以研究这两种受体基因沉默后对Cry1Ac毒力的影响。结果表明: 注射dsRNA（1 μg/头）进行基因沉默后, Haapn1 mRNA表达量比注射缓冲液（elution solution, ES）的对照下降了30%~49%, Ha_BtR mRNA表达量下降了30%~37%。注射Haapn1 dsRNA的幼虫在40和70 μg/cm² Cry1Ac活化毒素下的死亡率显著低于注射ES的幼虫, 而在 100 和 170 μg/cm² Cry1Ac原毒素处理下两者死亡率无显著差异; Cry1Ac活化毒素以及原毒素对注射Ha_BtR dsRNA幼虫与注射ES幼虫的毒力均无显著差异。当同时注射Haapn1及Ha_BtR dsRNA后, 干扰后的幼虫对Cry1Ac活化毒素和原毒素的敏感性均显著下降。本研究进一步证明了棉铃虫Haapn1和Ha_BtR均是Bt毒素Cry1Ac的功能受体, 这两种受体蛋白共同参与Cry1Ac的毒杀作用过程。该结果也提示, Haapn1或Ha_BtR基因产生突变都可能导致棉铃虫对Cry1Ac产生抗性。     

马铃薯甲虫结节性硬化复合物基因LdTSC1和LdTSC2基因的克隆及功能分析

【目的】通过RNAi技术明确马铃薯甲虫TOR上游的关键信号集成节点及类胰岛素信号通道下游基因结节性硬化复合物TSC1和TSC2的功能。旨在为探明马铃薯甲虫类胰岛素信号转导提供更多理论支持。【方法】在NCBI(美国国家生物技术信息中心)获取马铃薯甲虫LdTSC1/2序列,分别利用多重序列比对和系统发育分析确定该基因的完整性和系统发育关系;采用喂食幼虫dsRNA的方法,观察该基因的调低对马铃薯甲虫幼虫生长发育、糖脂代谢的影响。【结果】克隆得到马铃薯甲虫TSC1编码蛋白的氨基酸序列与鞘翅目白蜡窄吉丁直系同源蛋白的氨基酸序列的自展一致度为100%,聚为一支;TSC2编码蛋白的氨基酸序列与鞘翅目白蜡窄吉丁和赤拟谷盗的同源蛋白氨基酸序列的自展一致度为100%,聚为一支。通过分别喂食2龄幼虫LdTSC1/2的dsRNA能有效降低靶标基因的表达量,幼虫出现体重减轻,化蛹率和羽化率显著下降,葡萄糖的吸收转化效率降低,海藻糖含量升高和甘油三酯均减少。【结论】下调2龄幼虫LdTSC1/2的表达量,导致试虫出现抑制了糖脂代谢、脂肪体减少、体重减轻以及发育延迟;结果表明LdTSC1/2调控了马铃薯甲虫幼虫的糖脂代谢过程,显著影响幼虫化蛹和蜕皮过程。     

彩色马铃薯花青素生物合成相关microRNAs及其靶基因表达分析北大核心CSCD

MicroRNAs(miRNAs)是植物中具有调控功能的非编码小RNA,可调节植物生长发育、次生代谢及胁迫响应。为挖掘彩色马铃薯花青素合成相关的miRNAs,本研究基于miRNA和降解组测序数据,对筛选出和花青素相关的miRNA及靶基因进行鉴定,分析其理化性质、蛋白质结构、调控关系及在不同彩色马铃薯品种的表达。结果表明:stu-miR156a_R-1_StSPL9、stu-miR828_StMYB3、stu-miR858_StMYB4、stu-miR5021_StMYB在马铃薯块茎的不同发育时期存在显著的负相关关系。不同彩色马铃薯品种中,stu-miR828负调控靶基因StMYB3,抑制花青素合成;stu-miR156a_R-1负调控靶基因StSPL9,促进花青素合成。stu-miR858负调控靶基因StMYB4,在紫色马铃薯中促进花青素合成,在红色马铃薯中抑制花青素合成。stu-miR5021负调控靶基因StMYB,在紫色马铃薯中抑制花青素合成,在红色马铃薯中促进花青素合成。     

RNAi介导的棉铃虫氨肽酶N基因Haapnl和钙粘蛋白基因Ha_BtR沉默对Cry1Ac毒力的影响

氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)和钙粘蛋白(cadherin)是存在于鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜囊(brush border membrane vesicles,BBMV)上Bt毒素Cry1A的受体.本实验将棉铃虫Helicoverpa armigera氨肽酶N1基因Haapnl和钙粘蛋白基因Ha_BtR双链RNA(dsRNA)注入棉铃虫4龄幼虫体内,以研究这两种受体基因沉默后对Cry1Ac毒力的影响.结果表明:注射dsRNA(1 μg/头)进行基因沉默后,Haapnl mRNA表达量比注射缓冲液(elution solution,ES)的对照下降了30%～49%,Ha_BtR mRNA表达量下降了30%～37%.注射Haapnl dsRNA的幼虫在40和70 μg/cm2 Cry1Ac活化毒素下的死亡率显著低于注射ES的幼虫,而在100和170 μg/cm2 Cry1Ac原毒素处理下两者死亡率无显著差异;Cry1Ac活化毒素以及原毒素对注射Ha_BtR dsRNA幼虫与注射ES幼虫的毒力均无显著差异.当同时注射Haapnl及Ha_BtR dsRNA后,干扰后的幼虫对Cry1Ac活化毒素和原毒素的敏感性均显著下降.本研究进一步证明了棉铃虫Haapnl和Ha_BtR均是Bt毒素Cry1Ac的功能受体,这两种受体蛋白共同参与Cry1Ae的毒杀作用过程.该结果也提示.Haapnl或Ha_BtR基因产生突变都可能导致棉铃虫对CrylAc产生抗性.     

下调人脐带间充质干细胞Mbd3基因shRNA慢病毒的构建及鉴定

研究构建靶向抑制人Mbd3表达的sh RNA慢病毒颗粒,感染人脐带间充质干细胞并用嘌呤霉素筛选获得Mbd3稳定下调的细胞系,为进一步探讨Mbd3在诱导型多潜能干细胞形成中的作用提供实验基础。研究根据Gene Bank中公布的Mbd3基因序列设计特异性si RNA干扰序列并合成可产生sh RNA的双链DNA,经双酶切后克隆至p LVsh RNA-EGFP(2A)Puro载体上构建慢病毒重组质粒,转化DH5α大肠杆菌PCR检测筛选阳性质粒,利用HEK293Ta包装产生含有Mbd3sh RNA的慢病毒颗粒。通过RT-PCR和Western blot检测慢病毒感染人脐带间充质干细胞(h UC-MSC)后Mbd3的转录和蛋白表达情况,进一步检测重组慢病毒对Mbd3的沉默效果并筛选出最佳抑制效果的sh RNA慢病毒载体。结果显示成功构建并筛选出下调Mbd3的最佳慢病毒干扰载体,慢病毒感染人脐带间充质干细胞48h后于荧光显微镜下可见绿色荧光,经嘌呤霉素筛选9 d后,RT-PCR检测Mbd3表达显著降低,Western blot检测Mbd3蛋白表达明显减少。说明构建的sh RNA重组慢病毒包装成功,具有较高的感染活性,可有效抑制人脐带间充质干细胞Mbd3的表达,为后续研究脐带间充质干细胞跨胚层分化打下前期研究基础。