苦荞凝集素靶向抑制结肠癌细胞HCT116增殖的机制

苦荞凝集素（tartary buckwheat lectin,TBL）是一类兼具核糖体失活蛋白N-糖苷酶活性和芦丁水解酶活性的糖蛋白,具有显著的抑制结肠癌细胞增殖的功能。先前研究表明,TBL可以下调结肠癌细胞HCT116中包括miR-135a 和miR-135b在内的一些oncomiRs的表达,并且可以抑制结肠癌细胞HCT116的增殖。因此,我们推测TBL可能通过调控oncomiRs从而抑制HCT116细胞的增殖。本研究中,我们构建了包含miR-135a 和miR-35b结合位点的腺瘤性结肠息肉病基因（adenomatous polyposis coli,APC）的3′-UTR区。双荧光素酶报告系统表明,经过TBL处理后,实验组的荧光素酶活性较对照组高,而且用miR-135a&b的反义核酸anti-miR-135a&b处理后和实验组有相似的结果。Western 印迹分析表明,TBL处理HCT116细胞24 h后,细胞中APC和p-β-catenin的表达上调,总β-catenin的表达下调,且存在剂量依赖效应,而对GSK-3β的表达无明显影响。进一步探究了TBL进入细胞的方式,我们发现,加入TBL作用2 h后,其主要存在于HCT116细胞的表面,部分进入细胞内部,在细胞表面可以同半乳糖凝集素galectin-3竞争结合细胞膜表面受体,并且存在剂量和时间依赖性。这些结果表明：TBL以HCT116细胞表面的galectin-3受体为靶点,通过内吞作用进入细胞,进而调控HCT116细胞中miR-135a&b的表达,影响Wnt信号通路而抑制结肠癌细胞的增殖。     

MicroRNA-449a/b抑制人结肠癌细胞内Fra-1的表达

MicroRNAs (miRNAs) 是一类长度约为22 nt的非编码的调控性小RNA,它们在诸多的生命活动中发挥重要作用,如参与调控细胞的增殖、分化、凋亡以及肿瘤的发生发展. MicroRNA-449a/b (miR 449a/b) 是脊椎动物中进化保守的miRNA,作为抑癌基因,参与了许多癌症的发生过程,但其在结肠癌中的作用尚不清楚. 本文利用实时荧光定量技术研究了miR-449a/b在结肠癌组织中的表达. 利用双荧光素酶报告基因检测系统及Western印迹鉴定miR-449a/b的靶基因. 应用MTS法和Transwell分别检测miR-449a/b对结肠癌细胞增殖和迁移的影响. 检测组蛋白乙酰化酶抑制剂曲古菌素A (trichostatin A, TSA) 对结肠癌细胞中miR-449a/b表达的影响. 研究结果表明：与正常结肠组织相比,miR-449a/b在结肠癌组织中低表达;miR 449a/b能够结合到FRA-1 mRNA 3′-非翻译区 (3′-untranslated region, 3′-UTR),从而抑制结肠癌细胞HCT116内源Fra 1的表达;外源转染miR-449a/b明显抑制结肠癌细胞HCT116的增殖和迁移;并且TSA处理能够诱导结肠癌细胞HCT116中miR-449a/b的表达. 以上结果提示: miR-449a/b可能通过抑制靶基因Fra-1的表达,进而抑制结肠癌细胞的增殖和迁移．     

microRNA-125b 抑制结肠癌细胞增殖的研究

目的:探究在多种肿瘤中均发挥重要调节作用的miR-125b对结肠癌细胞增殖的影响。方法:采用miR-125b过表达的结肠癌细胞系HCT116,在细胞水平验证miR-125b对细胞增殖能力的影响。采用皮下注射的方式,建立裸鼠结肠癌皮下移植瘤模型,以研究miR-125b对结肠癌体内增殖的影响。在临床样本组织中检测miR-125b的表达以佐证miR-125b功能。结果:在体外MTT实验中,miR-125b能够抑制结肠癌细胞系HCT116的增殖(P0.001)。在体内模型中,注射过表达miR-125b mimics的HCT116细胞所形成的肿瘤与对照组相比,生长速度缓慢,肿瘤大小亦明显低于对照组(P0.05)。在临床样本中对比癌组织与癌旁正常组织中miR-125b的表达量,发现miR-125b在癌旁组织中表达明显高于癌组织。结论:miR-125b能够抑制结肠癌细胞的增殖。     

苦荞凝集素对结肠癌细胞增殖的抑制作用

采用醋酸铵缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换和分子排阻层析等方法,首次从苦荞麦中提取出一种苦荞凝集素(tatary buckwheat lectin,TBL). MTT检测发现,TBL对3种结肠癌细胞 DLD-1、HCT116及SW480的增殖有显著的抑制作用,且呈剂量依赖效应,而对正常细胞及其它类型癌细胞的增殖无明显影响. 采用兔网织红细胞裂解系统和荧光素酶检测系统检测TBL对蛋白质合成的影响,结果表明,随着TBL浓度的增大,蛋白质翻译抑制作用逐渐增强,当TBL浓度为40 μg/mL时荧光素酶活性下降至50%. 另外,TBL与兔网织红细胞裂解系统作用后,核糖体RNA出现新的片段,表明TBL具有N-糖苷酶的活性. 将HCT116细胞总RNA与TBL体外作用后,发现二者存在明显的相互作用,核糖体RNA被降解. qRT-PCR检测显示,TBL明显下调HCT116细胞中多种microRNAs (miRNAs) 表达. 综合以上实验得出,TBL是一种Ⅱ型核糖体失活蛋白(type-Ⅱ ribosome-inactivating protein, Ⅱ-RIP)类的植物凝集素,具有N-糖苷酶活性,可下调肠癌细胞中多种miRNAs的表达,抑制结肠癌细胞增殖.     

miR-125a-3p调控人结肠癌细胞浸润转移的作用及机制研究

目的:探讨miR-125a-3p在结肠癌细胞浸润与转移中的作用及其可能机制。方法:通过qRT-PCR方法检测miR-125a-3p在结肠癌细胞及组织样本中的表达;在结肠癌细胞过表达或沉默miR-125a-3p后,通过平板克隆实验、MTT实验、划痕实验、Transwell实验检测结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化;采用Western blot方法检测miR-125a-3p过表达后相关标志分子的表达水平变化情况。结果:miR-125a-3p在结肠癌细胞及组织呈现异常低表达;过表达miR-125a-3p抑制结肠癌细胞HCT116及SW480的增殖能力;过表达或沉默miR-125a-3p分别抑制或增强结肠癌细胞的迁移与侵袭能力;过表达miR-125a-3p在mRNA及蛋白水平均能够显著抑制Snail、N-cadherin及Vimentin的表达,而增加E-cadherin的表达。结论:miR-125a-3p参与调节结肠癌细胞浸润与转移,其机制可能是通过调控上皮间质转化途径介导的。     

miR-490和miR-363对结肠癌功能协同调控及其机制探究

本研究分析miR-490和miR-363过表达后功能及对结肠癌影响机制探究。利用结肠癌细胞株SW620、HCT116和正常结肠上皮细胞中,应用瞬时转染过表达miR-490及miR-363,然后通过分析细胞凋亡、细胞周期及生存率等指标来研究miR-490和miR-363在结肠癌细胞的功能,用Western blotting检测WEE1及Cdc2等蛋白的表达情况。得到结果 miR-490和miR-363转染后可抑制结肠癌SW620细胞株增殖,同时促进其凋亡及下调细胞周期G2/M的比例。miR-490和miR-363协同可抑制WEE1蛋白激酶进而调节Cdc2。结果表明miR-490和miR-363可协同抑制结肠癌细胞株SW620功能。     

冬凌草甲素对人结肠癌细胞株HCT116生长的影响及其机制研究

目的：研究冬凌草甲素（ORI）对人结肠癌细胞株HCT116生长的影响及其可能机制。方法：以体外培养的HCT116细胞为研究对象,给予不同浓度（0、2.5、5、10、20μM）ORI处理HCT116细胞不同时间（0、24、48、72 h）,通过MTT法检测其对HCT116细胞增殖的影响,DAPI染色观察其对细胞核的形态的影响,western blot检测细胞内β-catenin、c-myc蛋白表达的变化。结果：1ORI可显著抑制HCT116细胞的增殖,且此作用随着浓度和作用时间的增加或延长而增强（P〈0.05）。2ORI处理HCT116细胞24小时后,细胞核固缩的百分率随药物作用浓度的增加而增加。35、10、20μM ORI处理HCT116细胞24小时后,细胞内的β-catenin、c-myc蛋白水平均显著下调,且随着ORI浓度的增加逐渐减少。结论：ORI能以浓度和时间依赖性的方式抑制HCT116细胞的增殖,其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。     

冬凌草甲素对人结肠癌细胞株HCT116生长的影响及其机制研究

目的:研究冬凌草甲素(ORI)对人结肠癌细胞株HCT116生长的影响及其可能机制。方法:以体外培养的HCT116细胞为研究对象,给予不同浓度(0、2.5、5、10、20μM)ORI处理HCT116细胞不同时间(0、24、48、72 h),通过MTT法检测其对HCT116细胞增殖的影响,DAPI染色观察其对细胞核的形态的影响,western blot检测细胞内β-catenin、c-myc蛋白表达的变化。结果:1ORI可显著抑制HCT116细胞的增殖,且此作用随着浓度和作用时间的增加或延长而增强(P0.05)。2ORI处理HCT116细胞24小时后,细胞核固缩的百分率随药物作用浓度的增加而增加。35、10、20μM ORI处理HCT116细胞24小时后,细胞内的β-catenin、c-myc蛋白水平均显著下调,且随着ORI浓度的增加逐渐减少。结论:ORI能以浓度和时间依赖性的方式抑制HCT116细胞的增殖,其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。     

东北刺人参falcarindiol制备及其抗结肠癌作用机制研究

为建立一种快速高效的falcarindiol(FAD)制备程序并探讨其抑制结肠癌细胞HCT-116增殖作用与调控细胞周期阻滞相关基因之间的关系。研究使用硅胶柱色谱富集及制备HPLC分离纯化得到了FAD单体,依据波谱数据鉴定其结构;采用MTS法检测FAD对结肠癌细胞HCT-116的细胞毒活性,运用流式细胞术、RT-qPCR以及Westernblotting法分别检测FAD对结肠癌细胞HCT-116周期影响、周期阻滞基因β-catenin、cyclinD1和c-myc的mRNA水平及蛋白表达的作用。结果显示建立制备HPLC方法可以较快速稳定地得到较高纯度的FAD。FAD对结肠癌细胞HCT-116具有明显的细胞毒活性,与HCT-116细胞作用24、48、72h的IC50值分别为8.1±1.4、4.6±0.5、3.2±0.4μmoL/L。此外,FAD将HCT-116细胞周期阻滞在G2/M期,且能够显著下调Wnt/β-catenin通路中的β-catenin、cyclinD1和c-myc基因的转录及表达。据此推断FAD可能是通过调节Wnt/β-catenin信号通路阻滞HCT-116细胞生长周期进而抑制其细胞的增殖来产生抗结直肠癌的作用。     

MiRNA-155通过调控β-catenin促进结肠癌SW480细胞的侵袭

目的:探讨micro RNA-155(miR-155)对结肠癌细胞SW480侵袭能力的影响及其可能机制。方法:采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定结肠癌组织与邻近正常结肠组织中miR-155的表达。将miR-155 mimic和β-catenin特异性的siRNA(β-catenin si RNA)分别通过脂质体转染法转染入结肠癌SW480细胞,应用RT-PCR检测细胞中miR-155和β-catenin m RNA的表达,采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测β-catenin蛋白表达,采用Transwell侵袭实验检测miR-155 mimic及β-catenin si RNA对SW480细胞侵袭能力的影响。结果:结肠癌组织中的miR-155的表达较邻近正常结肠组织明显升高(P0.05);miR-155 mimic可使β-catenin的m RNA和蛋白表达均显著升高(P0.05),同时可显著增强SW480细胞的侵袭能力(P0.05),而转染miR-155 mimic和β-catenin si RNA的SW480细胞侵袭能力较仅转染miR-155 mimic的SW480细胞显著减弱(P0.05)。结论:结肠癌组织中miR-155的表达上调,可能通过激活B-catenin信号通路促进肿瘤细胞的远处侵袭转移。     

EZH2通过抑制miR-608基因表达促进结肠癌细胞增殖

探讨EZH2对结肠癌细胞增殖调控作用以及具体作用机制。通过对结肠癌细胞系SW480以及HCT116进行EZH2基因沉默,以检测EZH2对结肠癌细胞的增殖调控作用。MTT检法测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞周期及荧光定量PCR检测周期相关基因Cyclin D1、P15、P21以及mi R-608的表达变化。si RNA转染后,结肠癌细胞中EZH2的表达明显下降(p0.001),细胞增殖受到明显抑制(p0.05,p0.01或p0.001);si RNA组与阴性对照相比,G_1期细胞比例增高,G_2/M、S期细胞相对减少,cyclin D基因表达下调(p0.01,p0.05),P15、P21表达上调(p0.01)。通过荧光定量PCR发现,结肠癌细胞增殖抑制基因mi R-608在EZH2基因沉默组表达量显著上调(p0.001)。萤光素酶活性测试结果表明,EZH2在SW480和HCT116细胞中直接调控miR-608的基因转录(p0.001)。此外,miR-608基因沉默阻断siEZH2对结肠癌细胞增殖的调控作用。本研究发现了EZH2对结肠癌细胞增殖的显著促进作用,其具体作用机制在于抑制miR-608基因表达。因此,EZH2可望成为结肠癌潜在的治疗靶标。     

MicroRNA-21靶向调控β-catenin促进骨肉瘤细胞U2OS的增殖与侵袭

目的:研究微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)对骨肉瘤细胞U2OS增殖与侵袭的影响及其可能机制。方法:采用Real-time PCR (RT-PCR)检测miR-21在骨肉瘤和临近正常骨组织中的表达差异。通过脂质体转染法将miR-21模拟物(microRNA-21mimics,即mimics组)及microRNA无关序列(microRNA-NC,即NC组)转染入骨肉瘤细胞U2OS,real-time PCR(RT-PCR)检测miR-21和β-catenin m RNA在U2OS细胞中的表达,Western blot检测β-catenin蛋白在U2OS细胞中的表达,并通过双荧光素酶报告基因验证miR-21与β-catenin基因3'-非编码区(3'-untranslated region,3'-UTR)的特异性结合作用。MTT法检测U2OS细胞体外增殖能力;Transwell侵袭模型探查U2OS细胞侵袭潜能。结果:骨肉瘤组织中miR-21水平显著高于正常骨组织(P0.05)。过表达miR-21能够增强细胞增殖与侵袭,上调U2OS细胞β-catenin m RNA和蛋白的表达。双荧光素酶报告基因结果表明miR-21可与β-catenin基因3'-UTR结合,从而对β-catenin的表达起调控作用。结论:miR-21可能通过调节β-catenin的表达促进骨肉瘤细胞U2OS的增殖与侵袭。     

miRNA-21靶向调控Wnt/β-catenin对非小细胞肺癌细胞增殖与侵袭的影响

目的研究microRNA-21(miR-21)是否通过调控wnt/β-catenin信号通路从而影响人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)细胞株NCI-H1975细胞体外增殖与侵袭能力。方法预测和构建含有miR-21候选靶基因和β-连环蛋白基因的双荧光素酶报告质粒。将miR-21模拟物通过Lipofactamine 2000脂质体转染法转染NCI-H1975细胞,应用qRTPCR检测细胞中miR-21和β-catenin mRNA表达情况,应用Western blot检测β-catenin蛋白水平,CCK-8法检测miR-21mimic对NCI-H1975细胞增殖能力的影响,Transwell侵袭实验检测miR-21 mimic对NCI-H1975细胞侵袭能力的影响。结果qRT-PCR肺癌组织中的miR-21与邻近正常组织相比表达明显升高;双荧光素酶报告基因结果显示miR-21能和β-catenin的3’UTR端结合且显著促进荧光素酶活性;上调miR-21可使β-catenin的mRNA和蛋白表达水平显著升高,同时上调miR-21可显著增强NCI-H1975细胞的增殖与侵袭能力。结论 miR-21在转录后水平调控β-catenin表达来促进NCI-H1975细胞的增殖与侵袭能力,可能是NSCLC潜在的治疗靶点。     

miR-155-TP53INP1调节轴在结直肠癌化疗药物敏感性中的作用机制

摘要 目的：初步揭示miR-155通过靶向调节TP53INP1表达水平影响结直肠癌细胞对5-FU化疗敏感性。方法：将人结肠直肠癌细胞系HCT116进行培养,提取细胞总RNA后,采用miR-155逆转录特异性引物构建反转录体系进行PCR扩增,通过qRT-PCR检测miR-155在5-FU耐药细胞HCT116/FU及敏感细胞株HCT116中的表达情况;取对数生长期细胞,分别转染miR-155mimics、miR-155抑制剂、miR-155阴性对照后,采用CCK-8法检测miR-155对细胞5-FU药物敏感性的影响,双荧光素酶报告基因系统验证miR-155与TP53INP1的靶基因关系,Western blot检测miR-155对 TP53INP1表达的影响。结果：miR-155在HCT116 /Fu细胞中的表达量是HCT116细胞的7.25倍;在相同5-FU浓度时,HCT116+阴性对照的细胞生长抑制率均高于HCT116+mimics、半数抑制浓度显著低于HCT116+mimics,差异均具有统计学意义(P＜0.05);TP53INP1是miR-155的靶基因,能显著降低野生型TP53INP1 3''-UTR的荧光素酶活性;转染miR-155 mimics后,TP53INP1的相对表达量显著下降,转染miR-155抑制剂后,TP53INP1的相对表达量显著升高,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论：miR-155水平升高使HCT116细胞对5-FU的敏感性降低,miR-155可能通过靶向调节TP53INP1的表达水平,从而影响结直肠癌细胞对5-FU的敏感性。     

miR-28-5p影响结肠癌细胞迁移活力的分子机制初探

目的 探讨miR-28-5p影响结肠癌细胞迁移活力的分子机制. 方法 选用结肠癌细胞(HCT116细胞)进行实验,实验分为两部分.第一部分实验:将HCT116细胞分为空白对照组(control组)和爱拉斯汀组(erastin组),control组不进行特殊处理,erastin组使用加有20μM erastin的培养基培...     

lncRNA XIST-miR137-ATG5调节细胞自噬功能在肠癌细胞5-氟胞嘧啶耐药性中的作用

摘要 目的：本文旨在研究长链非编码RNA XIST-miR137-ATG5的相互作用,同时探讨其调节细胞自噬功能与肠癌细胞5-氟胞嘧啶敏感性的关系。方法：实时聚合酶链反应(real time PCR)检测XIST与miR-137在肠癌细胞中的表达;采用脂质体转染法将si-XIST,miR-137转染入肠癌SW480及HCT116细胞中。采用CCK-8检测瞬时转染si-XIST对肠癌细胞增殖及5-FU敏感性的影响;并利用双荧光素酶报告实验检测miR-137与XIST, miR-137与ATG5相互关系。Western blot方法检测XIST- miR137- ATG5对细胞自噬的影响。结果：与正常结肠细胞FHC比较, XIST在结肠癌细胞系明显高表达,miR-137在结肠癌细胞系明显低表达。与阴性对照组比较,转染si-XIST后,SW480及HCT116细胞增殖能力明显受到抑制,对F-5U的敏感性增强,且抑制自噬蛋白Beclin-1及LC3II/LC3 I的表达。miR-137可与XIST,ATG5 3''UTR结合,抑制XIST和ATG5的表达及功能。在结肠癌SW480细胞中共转染miR-137 inhibitor或过表达ATG5可逆转XIST沉默引起的5-FU耐药,同时可逆转因XIST沉默引起的自噬蛋白表达的抑制。结论：LncRNA XIST或可通过调控mir137-ATG促进结直肠癌细胞SW480自噬从而提高其对5-FU的耐药,针对其这一机制,可为将来针对结肠癌的靶向治疗提供一定的实验基础。     

miR-302通过下调靶基因RAB22A抑制膀胱癌进展

目的:探讨miR-302通过靶向调控RAB22A影响膀胱癌进展的分子机制。方法:采用RT-qPCR检测miR-302在HTB1和RT112膀胱癌细胞系和膀胱内皮细胞系HBdNEC中的表达;以miRNA-NC、miR-302 mimic、miR-302 inhibitor转染细胞,并分为以下几组:NC+control si RNA、miR-302 inhibitor+control si RNA、miR-302 inhibitor+RAB22A si RNA、NC+vector、miR-302 mimic+vector或miR-302 mimic+RAB22A,再通过MTT实验分析膀胱癌细胞的增殖情况,细胞侵袭实验检测细胞侵袭情况,双荧光素酶报告载体检测分析miR-302靶基因,Western blot检测RAB22A在膀胱癌细胞中的表达。结果:HTB1和RT112细胞中miR-302的表达明显低于HBdNEC细胞(P0.05)。miR-302高表达抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭;miR-302低表达时,膀胱癌细胞的增殖和侵袭能力上升。生物信息学和双荧光素酶报告结果显示RAB22A为miR-302的靶基因。miR-302过表达后,细胞荧光素酶活性显著下降(P0.05),RAB22A表达下调(P0.05);miR-302表达沉默后,细胞荧光素酶活性显著上升(P0.05),RAB22A表达上调(P0.01)。拯救实验显示RAB22A表达沉默可逆转miR-302表达沉默时对膀胱癌细胞增殖和侵袭能力上调的影响;而RAB22A过表达可逆转miR-302过表达对膀胱癌细胞增殖和侵袭的抑制。结论:miR-302可通过抑制靶基因RAB22A的表达,抑制膀胱癌细胞的增殖及侵袭。     

CCDC3对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响及其作用机制

该文研究了CCDC3基因对人结肠癌HCT116细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。采用CCK-8法检测CCDC3对人结肠癌HCT116细胞增殖的影响。采用平板克隆和软琼脂克隆方法检测CCDC3对癌细胞克隆形成能力的影响。采用Transwell方法检测CCDC3对HCT116细胞迁移和侵袭的影响。采用Western blot法检测CCDC3对HCT116细胞上皮间质转化相关蛋白质水平的影响。采用体内成瘤实验检测CCDC3对HCT116细胞致瘤能力的影响。结果表明, CCDC3在癌细胞的生长调节中发挥重要的作用。过表达CCDC3显著促进癌细胞生长,增强癌细胞的克隆形成能力,增强癌细胞的迁移、侵袭和致瘤能力;敲低CCDC3后,癌细胞的恶性减弱。同时,该研究还发现, CCDC3的表达与癌细胞发生上皮间质转化相关。这些研究结果表明, CCDC3可能是一个新的癌基因,为结肠癌治疗寻找新的治疗靶点提供了线索。     

乙酰哈巴苷通过Wnt信号通路诱导结肠癌HCT116细胞凋亡

本文探讨乙酰哈巴苷诱导结肠癌HCT116细胞凋亡机制。采用流式细胞术检测乙酰哈巴苷对HCT116细胞周期及凋亡的影响,发现细胞周期被阻滞在G1期,0.75 mmol/L乙酰哈巴苷处理48 h后,细胞凋亡明显增加。转录组测序显示乙酰哈巴苷引起HCT116细胞1 921个mRNA上调和2 208个mRNA下调,可显著影响Wnt信号通路。RT-qPCR和Western blot验证实验表明,乙酰哈巴苷处理后,HCT116细胞中β-catenin、CyclinD1、Survivin、Bcl-2和c-Myc蛋白显著降低(P<0.05),凋亡相关蛋白Bax和cleaved-caspase3表达增加(P<0.05)。上述结果表明,乙酰哈巴苷主要通过Wnt信号通路抑制结肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。