水稻盐胁迫相关内含子microRNA的表达及其生物发生机制

内含子microRNA是一类位于编码基因内含子区域的非编码小RNA。目前,动物内含子microRNA研究报道较多,而关于植物体内含子microRNA的功能及其生物发生机制报道较少。本研究通过高通量测序技术,结合生物信息学方法,发现在盐胁迫条件下水稻幼苗中共85个内含子microRNAs表达,其中差异表达的有24个。预测到的51个靶基因的功能分析,主要涉及抗氧化途径、植物激素信号转导途径及功能基因表达调控途径。此外,根据宿主基因的表达情况推测,共30个内含子microRNAs具有独立表达的功能。通过分析内含子microRNA前体DNA片段上游1 kb序列中的启动子核心元件,初步验证其具有独立表达的能力。因此,推测水稻幼苗在盐胁迫条件下,部分内含子microRNA独立于宿主基因表达,并参与水稻盐胁迫下的自我防御机制。     

内含子microRNA及其宿主基因的表达与功能

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类具有转录后水平基因表达调控作用的非编码小分子RNA.microRNAs可参与机体发育、代谢及恶性肿瘤、心律失常等疾病的发生.近半数microRNA的编码基因位于已知编码蛋白基因的内含子中,称为"内含子microRNA",后者称为"宿主基因".由于内含子microRNA编码基因位置的特殊性,有研究者认为二者能够共同表达并发挥相似的生物学功能.它的发现不仅丰富了人们对内含子功能的认识,还有助于完善宿主基因功能的作用通路。     

小拟南芥ApZFP基因异源超表达促进拟南芥开花并提高耐逆性

锌指蛋白(ZFP)是一类重要的转录因子, 广泛参与植物的生长发育和非生物胁迫应答。新疆小拟南芥(Arabidopsispumila)又名无苞芥, 是十字花科短命植物, 具有高光效、繁殖力强和适应干旱等生物学特征, 而且比模式植物拟南芥(A.thaliana)更耐高盐胁迫。将前期克隆的小拟南芥锌指蛋白基因ApZFP通过花滴法转化到哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)中,获得了独立表达的转基因株系。表型观察发现, 过量表达ApZFP基因可促使拟南芥在长短日照下均提前开花。实时荧光定量PCR结果显示, 转基因拟南芥株系中, 光周期途径中的CO基因和年龄途径中的SPL基因表达上调; 春化、环境温度和自主途径中的FLC基因表达下调; 编码成花素的基因FT及下游开花相关基因AP1和LFY的表达量均升高。进一步通过盐、干旱和ABA胁迫处理ApZFP转基因株系的种子和幼苗, 发现在胁迫处理下, 与对照相比, 转基因拟南芥种子萌发率较高, 幼苗主根较长。因此推测, ApZFP在植物发育过程中具有多种功能, 可能既参与植物的开花转变过程, 又同其它植物的锌指蛋白基因一样, 参与植物的耐逆过程。     

盐生植物海滨锦葵幼苗盐胁迫下基因差异表达分析

利用cDNA-AFLP技术对海滨锦葵幼苗盐胁迫下叶片和根部的基因差异表达模式进行分析和比较, 并对部分盐胁迫应答的转录衍生片段进行了回收、测序和功能推测, 以从转录水平分析海滨锦葵的耐盐分子机制。结果显示：(1) 盐胁迫下海滨锦葵幼苗叶片和根部的基因差异表达多以量的变化为主, 包括盐胁迫下基因表达上调、下调或随盐处理浓度高低和胁迫时间长短而波动的差异表达模式; 只有少量基因的差异表达表现出质的变化, 如盐胁迫下基因沉默或诱导表达; (2) 仅在盐胁迫处理2 h的海滨锦葵幼苗根部, 基因的差异表达以质的变化为主的类型比例略高于量的变化类型比例; (3) 盐胁迫应答基因在不同组织中上调、下调、诱导或沉默的比例随胁迫处理时段而动态变化, 在刚胁迫时基因表达的差异加剧, 而后随胁迫处理时段的延长而渐趋稳定。结果预示, 从基因表达水平探讨植物的耐盐分子机理, 尽管有一定的规律可循, 但由于不同组织对盐胁迫的应答是动态变化的过程, 海滨锦葵不同组织在盐胁迫不同阶段的基因时、空、序表达特征并没有固定的程式。对部分盐胁迫下上调或诱导表达的转录衍生片段(Trivially distributed file system, TDFs)进行的序列分析和功能推测表明, 苗期海滨锦葵在盐胁迫下应答基因至少涉及3类：(1) 离子平衡重建或减少胁迫损伤相关基因(特别是运转蛋白类); (2) 恢复盐胁迫下植物生长和发育相关基因：如参与能量合成和激素调节途径相关基因等; (3)信号转导相关基因及功能未确定的新基因。文章并对盐胁迫应答基因的差异表达模式与海滨锦葵的耐盐性关系进行了讨论。     

microRNA在小鼠乳腺不同发育时期差异表达谱及作用

microRNA是一类大小约22个核苷酸的非编码RNA分子,是一种广泛存在的对基因表达进行微调的分子。microRNA可以通过与靶基因mRNA的特定位点结合,抑制该蛋白的合成或诱导该mRNA的降解,从而参与基因的表达调控。一般来源于染色体的非编码区域,由大约70个核苷酸大小的可形成发夹结构的前体经Dicer酶加工而来。这类小RNA在表达上具有组织和时间的特异性,是调节其他功能基因表达的重要调控分子,在生物的生长发育过程中发挥着重要作用。因此,虽然microRNA的研究仅有很短的历史,但已成为基因表达调控研究的热点领域。以中国昆明小鼠不同发育时期的乳腺组织为实验材料,应用芯片技术及荧光定量PCR技术,分析发育不同时期的乳腺组织microRNA差异表达图谱。本文研究发现microRNA在乳腺不同的发育时期表达图谱不同;与青春期、退化期比较,妊娠期、哺乳期有十余种microRNAs表达上调,20余种microRNAs表达下调;microRNAs在乳腺发育和泌乳周期中发挥重要的作用。     

逆境诱导水稻谷胱甘肽合成酶基因的表达研究

用RACE方法获得了全长的水稻谷胱甘肽合成酶(GS)基因的cDNA,并命名为OsGS(GeneBankaccession No.:AY453405)。该cDNA全长1 892 bp,编码一个由540个氨基酸组成的多肽,预测其氨基端(N端)含有一段定位叶绿体的信号肽。比较水稻基因组定位结果表明OsGS基因位于水稻12号染色体短臂上,转录区全长6 321 bp,由12个外显子和11个内含子组成。通过RT-PCR对OsGS在水稻正常生长条件和逆境条件下的表达进行了研究。结果表明,在正常生长条件下,OsGS在水稻幼苗的根和叶以及抽穗期水稻的根中表达;但不在抽穗期水稻的叶、茎和幼穗中表达,这显示OsGS在水稻中的表达具有发育和组织特异性。利用抽穗期水稻的叶片为材料,经高温、干旱和重金属逆境处理后,OsGS在抽穗期叶片中的转录被诱导表达;而在盐、低温、伤害逆境下则不被诱导。在轻度和中度干旱胁迫4 h后OsGS基因可被诱导表达。外源ABA处理也能够提高OsGS的转录水平,这显示OsGS可能是依赖ABA信号途径的环境胁迫诱导基因。     

外源水杨酸对盐胁迫下珙桐幼苗抗氧化系统和基因表达的影响

通过对珙桐(Davidia involucrata)幼苗进行水杨酸(SA)处理,探讨在盐胁迫下SA对珙桐叶片膜脂过氧化程度、活性氧(ROS)积累、抗氧化酶活性、抗氧化剂含量等生理指标及基因表达的影响。结果表明：施用2 mmol·L^-1的SA可以显著降低盐胁迫下珙桐幼苗的相对电导率,抑制丙二醛(MDA)和ROS的积累,提高相对含水量、抗氧化酶(SOD、POD和APX)活性以及谷胱甘肽(GSH)含量。施用SA导致盐胁迫下2 581个珙桐基因表达发生变化,其中1 516个上调表达,1 065个下调表达。KEGG分析发现,差异表达基因富集在包括苯丙烷类生物合成在内的9条通路。此外,转录组与实时荧光定量PCR结果均显示,在盐胁迫条件下,转录因子基因DiWRKY40、DiNAC25、DiMYB4和DiMYB86的表达受到SA的显著诱导。研究表明,外源SA可在盐胁迫下刺激珙桐幼苗产生逆境应答,引起基因表达发生变化,进而缓解盐胁迫对珙桐幼苗的伤害。     

外源脯氨酸对盐胁迫下甜瓜脯氨酸代谢的影响

为探明外源脯氨酸对盐胁迫下甜瓜脯氨酸代谢的影响,以甜瓜品种‘雪美’为材料采用营养液栽培,对盐胁迫(100mmol·L-1 NaCl)、盐胁迫下添加外源脯氨酸(100mmol·L-1 NaCl+0.2mmol·L-1 Proline)以及对照3种处理后甜瓜幼苗叶片脯氨酸(Pro)含量、吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)、鸟氨酸转氨酶(OAT)和脯氨酸脱氢酶(ProDH)活性进行测定,并对OAT和ProDH基因进行克隆及半定量表达分析。结果显示:与对照相比较,盐胁迫条件下甜瓜幼苗叶片内Pro含量显著增加,P5CS活性增幅大于OAT活性,OAT基因表达量大部分时段内没有增加,ProDH活性下降,ProDH基因表达量减少;盐胁迫下添加外源脯氨酸进一步使幼苗叶片内Pro含量增加、OAT、ProDH活性提高、P5CS活性降低,并且使OAT基因表达量迅速增加、ProDH基因表达量先增加后回落。研究表明,盐胁迫条件下,甜瓜幼苗体内脯氨酸积累主要是通过增强脯氨酸的谷氨酸合成途径和抑制脯氨酸降解来实现;适量外源脯氨酸可以增强盐胁迫幼苗脯氨酸的鸟氨酸合成途径,但对谷氨酸合成途径有一定的抑制作用;通过调节合成和降解2种代谢途径进一步提高了脯氨酸含量,从而增强甜瓜幼苗耐盐胁迫能力。     

水稻盐碱逆境响应锌指蛋白基因OsZFP6表达特性及功能研究

筛选到C2HC型锌指蛋白,其编码304个氨基酸,命名为OsZFP6。分别使用碱性盐(NaHCO3)和H2O2对水稻两周龄幼苗进行胁迫处理,检测到OsZFP6相对表达量受其诱导,并在叶和根中出现差异,因此,推测OsZFP6参与相应的逆境响应调节途径。我们将一个绿色荧光蛋白(GFP)与之融合,发现OsZFP6定位在细胞核。此外,对过表达OsZFP6的水稻转基因植株进行NaHCO3胁迫处理,结果表明过表达植株均具有较强的耐受性;并且在株高、鲜重生理指标上,野生型植株低于过表达OsZFP6植株,在野生型植株体内的MDA、H2O2含量高于过表达植株;说明OsZFP6在响应NaHCO3胁迫时可以通过清除过氧化物来增强植物的抗性。初步推测OsZFP6基因参与响应碱性盐胁迫途径的调控,可能在转录调控中直接或间接发挥重要作用。     

盐芥ICE1转录因子的克隆及生物信息学分析

ICE1基因编码一个MYB类型的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子,在冷胁迫条件下调节CBF基因的表达,能够提高植物抗寒性。利用盐芥5′EST序列和拟南芥ICE13′UTR保守序列设计引物,从盐芥基因组中克隆得到了1个2525bp的基因xhICE。生物信息学分析,表明该基因具有4个外显子,4个内含子,外显子/内含子边界符合经典的GT-AG规则。由此推导的cDNA包含一个1500bp的开放阅读框,编码500个氨基酸。与拟南芥ICE1相比,二者的内含子具有相同的类型和相对保守的位置,在核酸水平与氨基酸水平高度同源,并且具有相同的bHLH结构域。以上分析都表明,xhICE基因可能是盐芥ICE1基因,涉及抗寒相关的CBF转录调控途径。     

内含子数量改变GUS基因的瞬时表达调控

内含子是基因的重要组成部分,它与功能基因表达之间的关系越来越被重视.本研究以pCAMBIA3301为载体,利用玉米泛素启动子Ubi1和水稻肌动蛋白启动子Actin1构建两个GUS基因表达载体p33U1和p33A1,同时设置3个对照载体.通过基因枪轰击法将上述载体转入水稻胚性愈伤组织,探讨内含子对外源目的基因表达的调控作用.组织化学检测结果表明:CaMV35S启动子调控下的iGUS (带内含子)基因能够顺利表达;同样,Actin1启动子(带内含子)调控下的不带内含子的GUS基因也可以正常表达,而当Actin1启动子(带内含子)驱动iGUS基因时,则导致GUS染色反应不能发生.Ubi1启动子(带内含子)调控GUS基因的瞬时表达也得出类似结果,证明表达框中内含子的数量为1个或两个时,对GUS基因的表达起到了不同的调控作用.本研究结果对植物表达载体构建及功能基因表达都具有指导意义.     

环境因子胁迫下水稻翻译延伸因子1A基因的诱导表达

利用差异显示ＰＣＲ 技术（ＤＤ＿ＰＣＲ） 比较了籼稻（ Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ Ｌ．ｓｓｐ．ｉｎｄｉｃａ）“窄叶青８ 号”幼苗在盐胁迫与正常生长条件下基因表达的差异,克隆了水稻翻译延伸因子１Ａ 蛋白（ｅＥＦ１Ａ） 基因家族中的一个新的成员（ 称为ＲＥＦ１Ａ） 。利用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 杂交对环境因子胁迫下该基因的表达进行了分析,结果翻译延伸因子１Ａ 基因在水稻幼苗中的表达明显受盐胁迫和ＡＢＡ胁迫所诱导,且ＡＢＡ 胁迫处理对该基因转录的诱导要早于盐胁迫的诱导作用。此外,干旱（１５％ ＰＥＧ６０００） 处理、冷胁迫（４ ℃）和热激（３７ ℃） 对水稻翻译延伸因子１Ａ 基因的转录均有明显的诱导作用。上述结果说明翻译延伸因子１Ａ基因的诱导表达可能是水稻细胞对逆境胁迫的一种适应性反应     

水稻OsCIPK10基因的克隆和功能分析

利用反向遗传学的方法对水稻OsCIPK10基因的功能进行了分析。结果表明,过量表达OsCIPK10基因的转基因水稻与野生型水稻在株型、抗高盐和耐低钾能力方面没有明显差异,但是小RNA干扰表达OsCIPK10基因的转基因水稻表现出显著的抗盐性。在缺钾胁迫条件下OsCIPK10基因的表达升高,推测该基因在应答高盐和低钾的非生物胁迫过程中起作用。OsCIPK10基因启动子与报告基因GUS融合表达的转基因水稻的染色结果显示:OsCIPK10基因呈组成型表达,但是在维管组织表达水平更高。     

内含子microRNA——基因组中的暗物质

基因的内含子一直被认为是基因组中的"垃圾"序列。自上世纪末发现其编码了与RNA剪接相关的一些分子以来,人们对内含子的意义有了重新认识。随着micoRNA研究的深入,现已证实40%的microRNA由内含子所编码,这进一步提升了内含子在基因表达调控中的地位。内含子编码的microRNA长期未被人们所认识,但确实具有一定的生物学功能,可称得上是"基因组中的暗物质"。     

燕麦盐胁迫响应基因的差异表达与生理响应的关系

以耐盐燕麦品种VAO-9为材料,通过Illumina测序与数字基因表达谱技术对300mmol/L NaCl处理前后的叶片cDNA文库进行RNA-Seq与DGE分析,同时测定0(CK)、100、200、250、300mmol/L NaCl胁迫下VAO-9幼苗叶片的相对电导率、丙二醛含量和脯氨酸含量,探讨燕麦盐胁迫响应基因的差异表达与生理响应的关系。结果表明:(1)RNA-Seq分析得到Unigenes 65 801条,其基因表达呈现高度的不均一性和冗余性;若差异基因表达谱鉴定分析以log2Ratio≥2且FDR值≤0.001为选择标准,则发现上调和下调表达基因在胁迫0.5h时分别有306和64个,在胁迫3h时分别有639和290个,胁迫24h时分别有1 488和882个。(2)KEGG代谢分析显示,有23 652条Unigenes比对到KEGG中的128条代谢途径,包括与逆境胁迫相关的植物激素信号转导途径、ABC转运蛋白途径、肌醇磷酸代谢途径、渗透调节途径等。(3)在300mmol/L NaCl处理下燕麦叶片的相对电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量等生理指标的变化与相关差异表达基因的变化趋势基本一致,说明基因差异表达量与生理反应密切相关。研究认为,在相同的栽培及胁迫处理条件下,可根据植物盐响应生理指标的变化判断耐盐基因的表达情况。     

大豆两个C2H2型转录因子基因序列特征及表达分析

干旱气候已严重影响需水作物大豆的产量,而植物中C2H2型转录因子在应答非生物逆境中起到重要作用,因此充分挖掘优异抗旱大豆种质的基因资源及功能研究,为利用基因工程手段获得抗旱大豆种质奠定理论基础。本研究从大豆叶片中克隆到2个基因,分别命名为GmZAT9-like和GmZAT5-like。序列特征分析表明二者都属于C2H2型转录因子,均包含典型双锌指结构域和EAR保守基序,且氨基酸同源性低于其他物种同源基因。分子进化树分析表明,2个基因分别与拟南芥AtZAT9和ATZAT5基因划分为一类。基于荧光实时定量PCR技术检测到2个基因分别在叶片和根部组织特异性表达。通过半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析大豆幼苗在PEG、SA、ABA、NaCl和4℃胁迫处理条件下2个基因的表达模式。结果表明,在PEG和SA胁迫条件下,叶片中GmZAT9-like基因表达在处理后期有升高趋势,而根部GmZAT5-like基因在处理早期受到诱导表达;ABA胁迫条件下,2个基因均在处理初期呈现表达升高趋势而后下降;盐和冷胁迫条件下,叶片中GmZAT9-like基因表达受到抑制,而根部GmZAT5-like基因表达在冷胁迫处理初期呈现升高趋势。因此推测这两个基因与大豆非生物胁迫响应相关。     

水稻小G蛋白OsPra2基因的克隆及功能分析

利用micro array 技术对水稻幼苗在营养胁迫条件下根部基因表达的研究中发现: 一个与豌豆Pra2(小G蛋白)基因有同源性的基因的RNA水平在营养胁迫后再补充营养时, 表达量下降。用RT-PCR和PCR方法分别获得该基因的cDNA克隆—OsPra2和该基因翻译起始位点上游1 kb的启动子序列。OsPra2基因编码的蛋白质具有结合GTP/GDP的4个保守结构域和构成小G蛋白Rab家族的特有的结构域。该基因cDNA与GST蛋白基因融合表达载体在洋葱表皮细胞中的瞬间表达结果显示该蛋白定位在在细胞膜和细胞核上, OsPra2基因启动子与GUS报告基因融合表达转基因水稻显示该基因启动子驱动GUS在胚芽鞘和根中表达, 35S启动子驱动OsPra2基因过表达转基因水稻与野生水稻株型相比明显矮化, 类似BR缺陷型植物株型。本实验还对OsPra2和P450蛋白的相互作用及在BR代谢途径中的可能作用进行了分析。     

盐穗木HcPEAMT基因的克隆及表达分析

依据盐穗木编码PEAMT的EST序列设计引物,通过快速扩增cDNA末端技术,获得盐穗木磷酸乙醇胺甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)全长cDNA,命名为HcPEAMT。序列分析表明HcPEAMT基因开放阅读框为1 482bp,编码494个氨基酸,推测分子量为56.3kD,理论等电点为5.51。保守结构域分析表明,HcPEAMT含有2个独立的S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的保守结构域,每个结构域含有4个基序。系统进化树分析确认HcPEAMT与盐生植物盐角草的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,盐胁迫3h时,盐穗木同化枝和根中HcPEAMT基因的表达迅速上调并达到最大值,分别为对照的4.3倍和6.7倍。脱落酸(ABA)胁迫3h时,同化枝中HcPEAMT的表达量达到最高,而根中HcPEAMT的表达在12h才达到最高,表达量分别为对照的2.6和2.5倍。研究结果表明,HcPEAMT基因表达受盐胁迫的强烈诱导,也受ABA胁迫的诱导。该研究结果有助于阐明HcPEAMT基因表达与植物抗逆性的相关性。     

拟南芥中缺铁反应性microRNAs的鉴定

microRNA是一种非编码蛋白质的小分子RNA,参与了植物生长发育及环境胁迫响应的调控,主要通过对靶基因的负调控去影响生物学过程.基于前人对拟南芥全基因组microRNAs及其靶基因的预测,我们找到了靶向15个缺铁响应基因的22个microRNAs(miR158a、miR164c、miR172a、miR1887、miR2111ab、miR3933、miR395ade、miR414、miR828、miR831、miR837-3P、miR837-5P、miR854abcd、miR857、miR861-5P、miR864-5P).对这些microRNAs的启动子进行分析,发现分别有17、10和4个microRNAs启动子中包含缺铁响应元件IDE1、生长素响应元件和乙烯响应元件.进一步通过Poly(T)adaptor RT-PCR方法对这22个microRNAs在缺铁条件下的表达变化做了检测,结果显示,除miR158a和miR837-5P外的20个microRNAs在缺铁条件下的表达变化都有显著差异,且具有时间依赖性.这20个microRNAs可作为缺铁响应的候选microRNAs.     

小麦幼苗期水分胁迫所诱导基因表达谱的初步分析

利用抑制差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)和高密度点阵膜技术研究小麦2叶幼苗期水分胁迫诱导表达基因。通过筛选具有1530个克隆的SSH文库,获得181个阳性克隆。序列同源性比较和功能查询结果发现,83．2％的水分胁迫诱导表达基因分别与不同逆境胁迫条件下表达的基因具有较高的同源性,这些基因在生物体内的功能都是直接或间接对细胞遭受逆境胁迫起保护作用。其中17个EST未找到同源性较高的匹配序列,已经在GenBank注册。用反向Northern、RT-PCR和Northern进一步检验所获得的功能已知EST,初步建立了小麦幼苗期水分胁迫诱导的基因表达谱。