食欲素1受体与胆囊收缩素2受体在细胞内的相互作用分析

食欲素1受体(orexin 1 receptor,OX1R)与胆囊收缩素2受体(cholecystokinin receptor,CCK2R)在结肠癌细胞中高表达,且异常表达的OX1R、CCK2R与其配体诱导的结肠癌细胞增殖密切相关,但具体机制尚不清楚。以前的研究证实,OX1R与CCK1R在HT-29细胞中能以二聚体的形式发挥作用。本文利用多种(荧光)共振能量转移技术(FRET)结合免疫共沉淀(Co-IP),进一步研究活细胞中OX1R与CCK2R是否发生相互作用。生物发光能量共振转移(BRET)结果显示,在控制供体(OX1R-Rluc)量不变,而逐渐增加受体(CCK2R-e YFP)转染量时,与无刺激的(对照)细胞比较,食欲素或胃泌素刺激HEK293T细胞5 min,BRET信号伴随受体表达量的增加而增加,并达到最大值。采用荧光共振能量转移技术在HEK293T细胞中,能够检测到OX1R-e YFP与CCK2Re CFP明显的FRET信号。同时,受体漂白FRET(ap FRET)结果揭示,在同时表达OX1R-e YFP和CCK2R-e CFP的细胞膜特定区域,进行受体蛋白(OX1R-e YFP)完全光漂白、破坏了受体-供体之间的相互作用和能量传递后,由于供体(CCK2R-e CFP)荧光强度比漂白前明显增强,其荧光共振能量转移效率(FREPe)明显增加,是对照转染细胞的3.7倍(P0.05)。此外,基因转染结合Co-IP结果显示,仅有在共转染HA-OX1R与Myc-CCK2R的HEK293T细胞提取液的免疫沉淀物中,可同时检出HA-OX1R、Myc-CCK2R融合蛋白,而在未转染或单转Myc-CCK2R的细胞提取液沉淀物中,却不能同时检出两种融合蛋白。以上结果表明,在活细胞生理条件下,OX1R可与CCK2R相互作用,这为进一步探讨二者相互作用在结肠癌细胞增殖中的作用及相关信号通路提供了新的线索。     

CFP荧光蛋白文库构建及FRET技术筛选钙调素结合蛋白

钙调素（Calmodulin,CaM）是细胞内Ca^2＋信号的主要受体,能够与靶蛋白相互结合调节靶蛋白的活性,在细胞增殖、分化、凋亡、迁移等过程中都起着重要作用。荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）技术是目前研究蛋白质相互作用比较成熟的方法之一。作者通过Cre-loxP位点特异性重组技术构建了带有CFP荧光蛋白标记的文库,与YFP—CaM共同转染HEK293细胞,应用荧光共振能量转移技术（FRET）进行检测,挑取发生FRET作用的单个细胞,并进行单细胞PcR检测。由此扩增出的片段通过测序和蛋白序列数据库NCBI进行序列比对后,筛选出与CaM产生相互作用的蛋白。目前,已经通过这种方法成功地筛选到了一些与CaM相结合的蛋白,从而为进一步研究CaM蛋白在生理环境下的作用提供有利条件。     

用FRET方法研究与Mps1蛋白有相互作用的CENP-E蛋白结构域

目的：探索与Mps1蛋白有相互作用的CENP-E蛋白结构域。方法：将重组质粒pEGFP-CENPE2（674~1085位氨基酸）、pEGFP-CENPE3（1200~2134位氨基酸）转染人胚肾293(HEK293)细胞,采用受体漂白荧光共振能量转移方法（FRET方法）,检测EGFP-CENPE2、EGFP-CENPE3和Mps1间的能量转移率(Ef), 进一步用免疫共沉淀方法验证FRET的实验结果。结果：重组质粒转染HEK293细胞后经激光共聚焦显微镜观察重组质粒表达的融合蛋白与Mps1都存在着共定位;FRET检测结果显示EGFP-CENPE3和Mps1间的能量转移率为［(12.63±0.48)%, n=30］,pEGFP-CENPE2和Mps1间的能量转移率为［(3.07±0.21)%, n=30］,与对照组［(2.96±0.27)%, n=30］比较pEGFP-CENPE3和Mps1间的能量转移率差异存在显著性（p<0.05）,免疫共沉淀实验结果显示EGFP-CENPE3与Mps1蛋白间存在相互作用。结论：FRET技术和免疫共沉淀实验证明了EGFP-CENPE3与Mps1间存在着相互作用。     

一种改进的荧光共振能量转移方法分析同质二聚体内蛋白质-蛋白质相互作用

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)技术日益广泛的应用于检测活细胞中分子内和分子间的相互作用. 由于FRET仅发生于相互作用的供体和受体,即供体-受体复合物之间,所以检测的FRET信号必须经标准化处理以去除供体受体比例和浓度的影响然后才能够进行FRET的比较研究. 由于供体和受体的比例相同,分子内FRET的检测较为简单;而分子间FRET的检测存在更多的不确定因素,导致现有的方法很难精确定量.根据1类特殊的分子间相互作用,同质二聚体的独特特征,推导出供体 受体复合物的含量,进而开发了1种同质二聚体分子间FRET的精确定量的方法,以1种同质二聚体,雌激素受体α(estrogen receptor alpha, ERα)为供体和受体对,通过和其它的方法比较,证实了该方法用于FRET检测可获得更可靠的结果.     

单个活细胞中生物分子动态行为的FRET实时检测

分别采用两种不同绿色荧光蛋白(green fluorescent prote in,GFP)突变体作为荧光共振能量转移(fluo-rescence resonance energy transfer,FRET)对的供体和受体,并利用分子生物学技术将供体和受体分子分别与特定的生物分子融合,这种技术已经成为在单个活细胞中实时长时间检测蛋白质间的动态相互作用的主要技术。主要介绍了基于GFPs的FRET技术在单个活细胞中实时长时间研究生物分子动态行为的应用。     

基于FRET技术MMP-9生物传感器的构建及鉴定

为了构建包含有增强青色荧光蛋白-MMP-9-黄色荧光蛋白(ECFP-MMP-9-YPet)融合蛋白的真核表达质粒MMP-9生物传感器,利用原有质粒Src biosensor和通用载体p MD-18T,通过基因工程的方法构建ECFP-MMP-9-YPet生物传感器并进行鉴定,转染293T细胞24 h后观察转染效率,然后加MMP-3刺激293T细胞,运用荧光共振能量转移(flurorescence resonance energy transfer,FRET)技术在荧光显微镜下观察MMP-9生物传感器的荧光共振能量转移现象。PCR和双酶切鉴定显示,ECFP-MMP-9-YPet生物传感器构建成功,293T细胞转染效率约40%。用免疫荧光法检测MMP-9生物传感器融合蛋白在293T细胞表面膜表达,用MMP-3刺激转染细胞可以检测到FRET现象。结果表明,基于FRET构建的MMP-9生物传感器可以敏感而准确地监测活细胞中MMP-9的表达情况。     

基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针的构建及应用

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是基于荧光基团供体和荧光基团受体间偶极子–偶极子耦合作用的非辐射方式的能量传递现象。基于荧光蛋白的FRET技术已被广泛用于研究细胞信号通路中蛋白质–蛋白质活体相互作用检测、蛋白质构象变化监测以及生物探针的研制中。基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针使得人们可以在时间和空间层面上研究细胞信号的转导过程。该文简要介绍了四大类基于荧光蛋白的FRET生物探针的设计、研制以及其在生物信号分子检测、活细胞成像以及药物筛选中的应用和进展情况。     

大鼠p75NTR荧光真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的:构建大鼠p75神经营养素受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)cDNA序列的绿色荧光真核表达载体并鉴定其在人胚肾293(human embryo kidney 293,HEK293)细胞中的表达.方法:采用PCR方法从含野生型大鼠p75NTR的pDC316-RP75质粒中扩增目的片段,经EcoRⅠ和SaⅡ双酶切,定向克隆于pEGFP-N1质粒中,构建绿色荧光真核表达栽体pEGFP-N1-RP75,经酶切及测序鉴定后,通过脂质体转染HEK293细胞,激光共聚焦及免疫组织化学法鉴定大鼠p75NTR的表达.结果:重组质粒经酶切鉴定和序列分析证实含有大鼠p75NTR的编码序列,转染后经激光共聚焦显微镜及免疫组织化学染色观察表明重组质粒能够在HEK293细胞中表达出具有活性的大鼠p75NTR片段.结论:大鼠p75NTR绿色荧光真核表达栽体构建成功并可在HEK293细胞中表达,为进一步研究奠定了基础.     

FRET技术在受体信号转导研究中的应用

细胞信号传导是细胞生物学方面的重要内容之一,涉及生命过程的各个方面,包括生长、分化发育、增殖、凋亡、迁移等等,对维持细胞功能及机体生存至关重要。目前对细胞信号转导研究的技术手段多种多样,其中荧光共振能量转移技术（FRET）是研究细胞信号转导较为常用的一种技术,可以实现活细胞内蛋白质之间相互作用的实时检测。本文中我们以受体酪氨酸激酶为例,介绍FRET技术在受体介导细胞信号传导中的应用及进展情况。     

生物发光共振能量转移技术及其应用

生物发光共振能量转移（BRET）技术是近10年来出现的一种新的检测蛋白质- 蛋白质相互作用的技术.它的最大优势是能在活细胞中实时进行检测,因此能够进行相互作 用动力学的研究.本文系统阐述了BRET的原理和方法,综述了 BRET技术的最新进展,以及该 技术在G蛋白偶联受体（GPCRs）信号转导及药物发现中的应用.     

XCR1与CXCR4形成异源二聚体并调控其内化

趋化因子及其受体信号通路是肿瘤细胞转移的主要调控因素之一,趋化因子受体CXCR4和XCR1都被证明参与了乳腺癌的进展。本文基于膜蛋白酵母双杂交发现了XCR1-CXCR4这一尚未报道过的相互作用对,进一步通过生物发光共振能量转移技术(bioluminescence resonance energy transfer, BRET)验证并发现XCR1可以竞争性地结合CXCR4受体 (P<0.01),形成异源二聚体。在功能方面,首先通过XCR1和CXCR4瞬时转染HEK293细胞进行划痕实验,加入30 nmol/L SDF-1β后,共转组41.55%的伤口愈合率低于单转CXCR4组的58.75%,说明XCR1的共表达抑制了基质细胞衍生因子-1β(SDF-1β)/ CXC趋化因子受体4型 (CXCR4)信号通路介导的细胞运动性(P<0.05);其次,利用CXCR4-EGFP转基因HEK293细胞系,共表达XCR1后,流式细胞术检测细胞表面CXCR4受体荧光。结果显示,在30 nmol/L SDF-1β的诱导下,XCR1能够加速异源二聚体中CXCR4的内化 (P<0.05),使得内化率从14.38%上升到64.10%;最后,分别检测了控制细胞增殖的Akt和控制细胞迁移的ERK信号通路的变化。结果发现,在SDF-1β刺激10 min后,单转CXCR4组的ERK磷酸化为3.59倍,而共转染XCR1/CXCR4组ERK的磷酸化水平仅为2.08倍,二聚化使得ERK磷酸化水平下降,且激活时间缩短;而Akt的磷酸化水平几乎不受影响。本研究揭示了CXCR4和XCR1二聚化现象,以及该二聚体对CXCR4介导的细胞运动性、受体内化和ERK磷酸化的影响。提示靶向XCR1的药物可以成为CXCR4交叉脱敏的候选药物,对于抑制乳腺癌转移提供了一个可供选择的思路。     

利用受体漂白荧光共振能量转移技术研究β-分泌酶在活细胞内的二聚化

β淀粉样肽(Aβ)在阿尔茨海默病(AD)患者脑内的产生、聚集和沉积是AD的一个固有病理特征,也被普遍认为是AD的重要发病机理之一.β-分泌酶(BACE)对淀粉样前体蛋白(APP)的裂解是Aβ产生的关键步骤,β-分泌酶抑制剂是AD药物治疗的一个重要发展方向,因此对BACE结构的了解具有重要意义.利用受体漂白荧光共振能量转移(FRET)技术首次在活细胞内研究BACE的二聚化结构.通过基因工程技术分别构建了青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)标记的全长BACE(BACE-FL)和BACE活性部分(BACE-NT),应用共聚焦荧光显微镜和受体漂白FRET技术研究了BACE-FL和BACE-NT在细胞中的表达和定位,以及它们在活细胞内的存在形式.实验结果表明:a.BACE-FL在内质网至细胞膜均有表达,主要分布在高尔基体、细胞膜和内体等细胞器中,而BACE-NT则被滞留在内质网里.b.BACE-NT是单体结构,而BACE-FL在活细胞内则以二聚体的形式存在.证明,BACE的跨膜序列和C端对BACE的转运和定位具有重要作用,其二聚体结构由这些序列决定,而不由其活性位点决定.     

α1A-肾上腺素受体与骨形成蛋白-1片段在人胚肾293细胞中的结合

用酵母双杂交方法发现骨形成蛋白-1(bone morphogenetic protein-1,BMP-1)的片段可以与α1A-肾上腺素受体(adrenergic receptor,AR)的细胞内游离C末端结合。进一步探讨了二者在哺乳动物表达系统人胚肾293细胞(human embryonic cell 293,HEK293)中的相互作用。采用PCR方法构建含BMP-1片段eDNA的真核表达质粒PCP3HA,将其与含全长人α1A-AR eDNA的质粒PDT-α1A分别或共同转染HEK293细胞,用免疫印迹法检测到α1A-AR和BMP-1在HEK293细胞有相应的蛋白表达。用酶联免疫吸附实验对免疫印迹鉴定过的细胞裂解液进行检测,观察到空白对照组,单独转染PDTα1A-和单独转染PCP3HA的细胞,OD490值分别为0.034±0.027、0.042±0.019、0.030±0.0096,三者之间无显著性差异。共转染PDT-α1A和PCP3HA的细胞,OD490值为0.57±0.12,较其它三组具有显著性差异(均P<0.001)。免疫共沉淀结果显示,单独转染PDT-α1A或PCP3HA的细胞,免疫沉淀产物中均不能检测到BMP-1片段,只有共转染PDT-α1A和PCP3HA的细胞,在其免疫沉淀产物中能检测到BMP-1片段。ELISA和免疫沉淀结果均表明α1A-AR与BMP-1的片段在HEK293细胞中存在蛋白水平的相互作用。     

apoaequorin-egfp融合基因对烟草的遗传转化及其分子检测

用钙离子报告基因非侵入式监测细胞内源钙离子实时变化是目前比较常用的钙离子监测方法。而基于传统荧光共振能量转移原理(FRET)的荧光探针具有较高的量子产率,则是目前应用于细胞或亚细胞水平钙离子检测的重要备选实验方案之一。然而,供体荧光基团的激发过程却经常给最终成像过程带来强的背景和荧光信号光漂白等干扰。水母发光蛋白(Aequorin)能够在底物存在的情况下和3个Ca~(2+)结合,通过氧化还原反应产生一个波长为469 nm的蓝光光量子,借助这一反应中蓝光光量子的产率与细胞中游离Ca~(2+)浓度间存在精确定量关系,研究者可以准确测量细胞内的钙离子浓度动态变化情况。但是由于蓝光的波长短,存在易于被散射而难于被检测等问题,造成了目前直接使用水母发光蛋白检测细胞内Ca~(2+)动态时,实验效率较低。为了解决上述这些问题,我们构建了一种将apoaequorin-egfp基因融合表达的植物双元表达载体,然后通过农杆菌介导的遗传转化法将这个融合基因整合到烟草的基因组中,建立了一个基于生物发光共振能量转移技术(BRET)技术,较为高效的植物细胞内源钙离子动态检测系统。     

人H-ras基因真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞生长的促进作用

目的:构建癌基因H-ras真核表达载体,并检测其对肿瘤细胞生长的作用。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增H-ras基因片段,将其插入p XJ-40-myc载体后转染人胚肾HEK293T细胞,用Western印迹检测该融合蛋白的表达;将重组质粒转染人肠癌HCT-116细胞和人肝癌Hep G2细胞,通过细胞生长曲线(CCK8法)对myc-H-ras影响肿瘤细胞生长的情况进行分析。结果:利用PCR技术,从乳腺文库中扩增出H-ras基因片段,并成功插入p XJ-40-myc载体;重组质粒转染HEK293T细胞,经Western印迹检测融合蛋白正确表达;细胞生长曲线结果显示,转染myc-H-ras的结肠癌HCT-116细胞和人肝癌Hep G2细胞比转染空载体的细胞生长快。结论:构建了人H-ras基因真核表达载体,为进一步研究ras基因在肿瘤细胞中的作用奠定了一定基础。     

甘氨酸受体在肾细胞缺氧保护中的作用研究

目的明确甘氨酸受体(glycine receptor,GlyR)是否介导甘氨酸对ATP耗竭细胞的保护作用。方法构建甘氨酸受体α1亚单位(GlyRα1)的真核表达载体pcDNA3.1(b),转染入缺乏天然GlyR的人胚胎肾细胞HEK293。化学性缺氧使细胞处于ATP耗竭状态,光学显微镜及电镜观察细胞形态及超微结构改变,LDH释放率、细胞膜对荧光标记复合物通透性反映细胞膜完整性,台盼蓝染色观察细胞活性。结果细胞ATP耗竭3h后,细胞膜通透性明显增加,细胞器结构损伤,大量细胞死亡。甘氨酸明显降低表达GlyR的转染HEK293细胞膜通透性,阻止荧光标记复合物进入细胞内,细胞LDH释放率由59.18±8.10%下降为35.15±2.61%。从而维持细胞形态结构,降低细胞死亡率。对不表达GlyR细胞无保护作用。结论GlyR介导甘氨酸对ATP耗竭细胞的保护作用,增强细胞对ATP耗竭的耐受能力,增加细胞的存活几率。     

hTEM8-N-RFP融合蛋白真核表达载体的构建及在HEK293F细胞中表达

目的:构建人肿瘤内皮标志物8(hTEM8)胞外区(N端)与红色荧光蛋白(RFP)融合表达载体并在HEK293F细胞中表达,为进一步研究hTEM8的相互作用蛋白及其在肿瘤血管形成过程中的机制奠定实验基础。方法:以质粒pDsRed-Express-C1和重组质粒pcDNA3.1(+)-hTEM8/Fc为模板,PCR扩增RFP和hTEM8-N基因片段,先后插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达载体pcDNA3.1(+)-hTEM8-N-RFP,转染HEK293F细胞,通过荧光显微镜观察融合蛋白在转染细胞中的的表达,并用G418对转染的细胞进行加压筛选,Western blot检测hTEM8-N-RFP融合蛋白在转染细胞中的表达。结果:DNA测序、酶切鉴定的结果显示,表达载体pcDNA3.1(+)-hTEM8-N-RFP构建成功,且序列正确。转染后经荧光显微镜观察到HEK293F细胞中有红色荧光,经加压筛选单克隆后,在荧光显微镜下观察到稳定表达红色荧光的细胞株,Western blot检测到融合蛋白hTEM8-N-RFP在真核细胞HEK293F中获得表达。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-hTEM8-N-RFP真核表达载体,并在HEK293F细胞中表达,为后期研究hTEM8的相互作用蛋白和其生理功能奠定了良好的基础。     

在活细胞中应用FRET技术研究TGFβ/TβRI信号传导

转移生长因子β(TGFβ)信号传导通路参与调节细胞的增殖、分化、凋亡、细胞迁移等一系列细胞过程,与骨代谢疾病的发病机制密切相关.本研究根据荧光共振能量转移(FRET)技术原理,构建包含CFP-TβRI-YFP融合蛋白的TβRI生物传感器,转染293T细胞,观察转染效率.以TGFβ1为诱导剂,激活TGFβ/TβRI信号传导通路,在活细胞生理条件下,动态监测TβRI生物传感器的FRET效应.结果表明,成功构建了TβRI生物传感器,转染细胞效率达50%,在TGFβ1诱导刺激6min后,FRET效率增加并达到最大值,该过程经历9 min后,随时间的延长,FRET效率下降.研究结果表明:在活细胞生理条件下,TGFβ1/TβRI信号转导过程存在一定的时间特异性.     

BST-2和Vpu相互作用抑制剂筛选模型的建立

骨髓基质细胞抗原2(Bone marrow stromal cell antigen 2,BST-2,又称Tetherin、CD317、HM1.24)是宿主先天性免疫应答的组成部分,可抑制人类免疫缺陷病毒1(Human immunodeficiency virus 1,HIV-1)的释放,HIV-1的辅助蛋白Vpu可通过跨膜区与BST-2的跨膜区产生相互作用,进而将其降解,下调其在细胞表面的数量,拮抗BST-2的抗病毒功能。本研究将海肾荧光素酶(Renilla luciferase,Rluc)与BST-2的N端连接,增强型黄色荧光蛋白(Enhanced yellow fluorescent protein,EYFP)与Vpu的C端连接,分别构建质粒RB和VE,使两种融合蛋白在细胞内共表达,产生生物发光共振能量转移(Bioluninescence resonance energy transfer,BRET)信号,进而建立稳定双表达细胞系,以BST-2和Vpu的跨膜区相互作用为靶点,应用BRET技术,建立两种蛋白相互作用抑制剂的筛选模型,以期通过BRET信号变化筛选出相互作用抑制剂,发展新型的艾滋病治疗手段。     

利用FRET技术研究Hepcidin 和Fpn 相互作用

铁是生命必需的微量元素,ferroportin(Fpn)是小肠吸收细胞铁释放的重要蛋白。新近发现肝脏分泌的抗菌多肽 hepcidin 具有调节肠铁吸收的重要作用,但目前尚缺少Fpn和hepcidin发生作用的实验依据。应用荧光共振能量转移技术(fluorescence resonance energy transfer ,FRET)对hepcidin和Fpn之间的作用关系进行了深入研究。首先进行了hepcidin-CF P融合蛋白表达载体的构建及表达鉴定;然后对含YFP,Fpn-YFP基因动物细胞表达载体的构建、表达和FRET检测。实验结果证实hepcidin和Fpn之间存在直接的相互作用,并发现两种蛋白发生相互作用后hepcidin也在细胞质中有分布。为临床治疗铁代谢紊乱性疾病提供了新的治疗策略和重要理论依据。