用Cre/LoxP和CRISPR基因工程技术构建猪肌肉生长抑制素双等位基因敲除细胞系

肌肉生长抑制素 (myostatin,Mstn)基因失活可引起哺乳动物的肌肉增生,但其调控机制尚不清楚,且缺乏可靠的试验材料验证Mstn相关分子通路的变化。本研究所用PK3108细胞系是在野生型PK15细胞系的基础上成功靶向敲除一条等位基因,在其靶位点敲入标记基因,敲除了204 bp的外显子3序列, LoxP锚定在其标记基因两侧。利用Cre/LoxP重组酶删除系统删除插入PK3108Mstn靶位点的标记,借助流式细胞仪和荧光蛋白甄别得到无标记的过渡型细胞系PK3108-2。将Cas9/sgRNA表达载体和供体DNA共转染PK3108-2,借助G418抗性筛选和倒置荧光显微镜挑选出仅带阳性标记的克隆L18,对其基因组进行PCR产物凝胶电泳与PCR产物测序,证明克隆L18在预设位点发生同源重组;对其蛋白质进行Western 印迹实验表明,Mstn被成功地敲除失活。综上结果证明,本研究实现了双等位基因的精准敲除,构建了Mstn双敲除梯度回复表达细胞系。本研究为揭示Mstn的作用机制提供理想的实验材料,也为双等位基因的敲除提供了可借鉴的技术路线。     

CRISPR/Cas9介导的同源重组技术构建猪肌抑素基因敲除细胞系

肌抑素是肌肉增生的负调控因子,为改良家畜产肉性状的重要候选基因。本研究设计了Cas9/sgRNA表达载体与供体DNA,通过电转染方法将其导入猪PK15细胞,经G418抗性筛选和荧光蛋白标记甄别,筛选到带阳性标记的细胞克隆。通过跨界PCR、长距离PCR、Western印迹、Southern印迹及PCR产物测序,证明了猪肌抑素的第3外显子序列特异性同源重组事件的发生。在猪肌抑素的第3外显子区域找到了1个有效的CRISPR/Cas9打靶位点,带阳性标记的细胞克隆经过多次筛选分离,获得了肌抑素单等位基因失活的稳定细胞系,为深入研究肌抑素的功能提供了重要的实验材料。     

Cre-loxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能评价

选择标记的使用和残留可引起消费者对转基因生物环境安全和产品安全的担忧,建立消除选择标记的有效对策甚为必要.本研究的目标是评价Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能,为猪安全转基因研究提供实验依据和技术支撑.本文所用的打靶载体ΔMSTN含有LoxP位点锚定的选择标记表达框(LoxP-CMV-NeoR-IRES-EGFP-LoxP). 经电穿孔将该打靶载体导入猪肾PK15细胞,经G418筛选,获得稳定整合该载体、EGFP表达均一的单克隆细胞系. 将Cre重组酶表达载体pTurbo-Cre导入该细胞系,借助流式分选（FACS）、终点PCR、荧光定量PCR、TA克隆与测序等手段,证明Cre-LoxP重组系统可在猪细胞内高效介导内源性选择标记基因的删除反应,EGFP水平的删除效率达到46.1 %,DNA水平的删除效率则达到97 %.本文的研究结果为消除选择标记的安全隐患提供了可靠的解决方案,为建立猪安全转基因技术提供了重要的科学依据.     

改良型痘苗病毒安卡拉株表达系统可删除筛选标记的双表达穿梭载体

为了构建改良型痘苗病毒安卡拉株表达系统可删除筛选标记的双表达穿梭载体,利用Cre/LoxP DNA重组系统以及本实验室表达Cre酶的BHK-21细胞系 (BHK-Cre),以大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (Eco gpt) 为筛选标记构建可删除筛选标记的双表达穿梭载体pLR-gpt。将Eco gpt 基因以及调控其表达的启动子基因置于2个同向的LoxP位点之间,2个独立的多克隆位点位于2个LoxP位点之外,最终获得的重组病毒可以在BHK-Cre细胞系上删除筛选标记Eco gpt。为了验证系统的有效     

无标记转Fat-1基因真核表达载体的构建及转基因绵羊细胞系的建立

为了建立无筛选标记基因的转Fat-1基因绵羊细胞系,本研究将PCR克隆得到的Fat-1基因,合成的attB、Loxp序列并克隆入pN1-EGFP框架载体,得到可删除筛选标记基因的pEGFP-N1-Fat-1真核表达载体。体外转录合成phiC31整合酶mRNA并与线性化的pEGFP-N1-Fat-1载体共转染绵羊胎儿皮肤成纤维细胞,G418筛选得到表达绿色荧光的单克隆,再利用pET-28a-His-NLS-TAT-Cre质粒诱导Cre重组蛋白表达,将纯化后的Cre穿膜肽转导表达绿色荧光的单克隆细胞,将荧光淬灭的细胞系扩繁,提取基因组DNA,进行PCR及测序鉴定,得到无标记转Fat-1基因绵羊胎儿皮肤成纤维细胞系,为生产无筛选标记基因的转基因绵羊奠定基础。     

地衣芽胞杆菌FLP/FRT基因编辑系统的构建及验证

地衣芽胞杆菌有效的基因编辑工具有限,为了拓展和丰富其基因编辑手段,在地衣芽胞杆菌中构建一个抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因编辑系统,并通过敲除α-淀粉酶基因amyL、蛋白酶基因aprE及敲入外源透明颤菌血红蛋白基因vgb对该系统进行初步验证。首先以温敏质粒pNZT1为载体分别构建amyL和aprE基因敲除质粒pNZTT-AFKF和pNZTT-EFKF,两个敲除质粒各自包含针对目标基因的同源臂、抗性基因及同向的FRT位点;将敲除质粒转化地衣芽胞杆菌并经过两次同源交换过程实现目标基因的敲除;最后导入一个FLP重组酶表达质粒通过FLP/FRT系统的重组作用介导抗性基因的回收。为进一步验证本系统的实用性及编辑效率,构建了包含透明颤菌血红蛋白编码基因vgb表达盒及基因组丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB敲除盒的重组质粒pNZTK-PFTF-vgb,并以此进行外源基因vgb在基因组上的定向敲入。结果显示,成功敲除amyL及aprE并回收了抗性标记卡那霉素基因,敲除后淀粉酶活和蛋白酶活分别减少95.3%和80.4%;vgb基因成功整合入基因组pflB位点并回收了抗性标记四环素基因,并利用荧光定量PCR技术检测到vgb的整合表达。文中首次建立了一个适用于地衣芽胞杆菌的、抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因编辑系统,并进行了基因敲除及基因敲入验证,为地衣芽胞杆菌遗传改造提供了良好的方法参考。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Tiki1基因修饰猪模型

Tiki1基因是哈佛大学儿童医学院贺熹教授实验室发现的一个对蛙头部的诱导起到决定性作用的新基因,但Tiki1基因在小鼠等啮齿类动物中缺失,因此无法利用小鼠等小动物来研究其在哺乳动物中的作用.本文利用CRISPR/Cas9系统结合体细胞克隆技术构建Tiki1基因修饰猪模型,研究Tiki1基因在猪发育中的作用.我们利用贺熹教授团队提供的人Tiki1基因序列,在猪的基因组数据库中比对出与其同源性最高的一段序列设计2个靶位点(g1和g2).以设计的靶位点构建打靶质粒转染猪胎儿成纤维细胞,经细胞筛选、PCR扩增及测序共鉴定了52个单细胞克隆株.最终选择靶位点g1为纯合双敲的5个单细胞克隆株和靶位点g2为纯合双敲的3个单细胞克隆株作为构建Tiki1基因敲除猪的核供体.我们共计构建了720个重组胚胎,分别植入3头代孕母猪,其中有1头经B超检测成功怀孕并妊娠到期产下13头发育正常的克隆猪,经测序鉴定其中12头为Tiki1基因双敲除猪模型,Tiki1基因敲除克隆猪健康存活至今.结果表明Tiki1基因对于猪早期发育的作用机理不同于蛙,其在猪早期发育的过程中的具体作用机理有待后续进一步的深入研究.     

CRISPR/Cas9技术制备猪肌肉生长抑制素基因敲除细胞

采用CRISPR/Cas9技术制备质粒HRX-2MCS和PX330,两种质粒转染湖北白猪胎儿成纤维细胞,G418筛选抗性细胞株。收集培养细胞提取总DNA,分子定位PCR法检测绿色荧光蛋白(GFP)基因在猪肌肉生长抑制素(MSTN)基因外显子上的定位整合情况,得到T1靶位点整合细胞5株和T3靶位点整合细胞3株。Q-PCR定量分析结果表明3108号阳性细胞株MSTN基因m RNA表达量减少50%,实验获得的基因敲除细胞可以用于体细胞核移植法制备MSTN基因敲除猪的研究。     

一种用于提高基因打靶效率的双荧光筛选策略

同源重组介导的基因打靶技术因其准确性高、引入的突变可以预测,已经成为功能基因组研究的重要工具。但是在真核生物体内,天然同源重组的概率极低,对后续的筛选和鉴别造成很大困扰。因此,建立一个广谱性的高效筛选策略极为重要。研究基于"双荧光"的可视化筛选,通过提高筛选效率,从而建立了一种显著提高同源重组打靶效率的新策略。该策略以绿色荧光蛋白基因和新霉素基因为正筛选标记,以红色荧光蛋白基因为负筛选标记。经过G418筛选后,挑取仅表达绿色荧光蛋白的抗性克隆,用于跨界PCR检测。研究尝试运用上述新策略,借助CRISPR/Cas9技术,对猪肌抑素基因进行同源重组介导的基因打靶。在选取的T1和T2两个靶位点处,"双荧光"策略筛选的细胞阳性率分别达到80.5%和86.7%,筛选效率得到显著提高。研究建立的"双荧光"可视化筛选策略具有高效性和广谱性,在动物基因编辑领域具有广阔的应用前景。     

卡介苗阿拉伯糖苷转移酶embC基因敲除株的构建和初步鉴定

目的采用基因敲除技术构建了卡介苗embC基因缺失株。方法从卡介苗基因组中扩增出embC基因,定向插入自杀质粒p2NIL中,切除embC基因中约1000bp片段使其失活,再定向插入标记片段,筛选鉴定阳性克隆,电穿孔转入卡介苗,筛选重组菌株。结果PCR和酶切鉴定证明构建成功用于基因打靶的置换型自杀质粒,并筛选成功获得重组卡介苗。结论获得了卡介苗embC基因敲除株,为进一步研究对卡介苗免疫活性的影响奠定了基础。     

CRISPR/Cas9介导的同源重组插入敲除人SH2B3基因

SH2B3基因的突变可以显著提高人干细胞向红细胞诱导分化的效率。该研究利用CRISPR/Cas9技术介导的同源重组插入敲除策略,建立了一种高效获得特定基因编辑类型的敲除SH2B3基因的方法。通过设计两个含有不同荧光标记和不同抗性基因的同源重组筛选载体和一个靶向SH2B3基因的CRISPR/Cas9敲除载体,共转染HeLa细胞,然后用嘌呤霉素和新霉素进行筛选,两周后一部分细胞用于分子生物学检测,另一部分细胞通过有限稀释法分离单细胞克隆。结果显示,在药物抗性筛选两周的HeLa细胞中,野生型SH2B3基因转录产物几乎检测不到,可以检测到重组型转录产物的表达。敲除效率的统计结果显示,在获得的19株SH2B3基因敲除细胞中,有11株细胞为双等位基因插入敲除。另外8株细胞为单等位基因插入敲除,其中有2株细胞的等位基因没有检测到突变,而剩余的6株细胞的等位基因都检测到有突变。因此,该研究的双插入敲除率为57.9%,双敲除率达到89.5%。该研究为构建SH2B3基因敲除的人多能干细胞系奠定了基础,也为建立一种高效、低成本的诱导红细胞的技术体系提供了有效的工具。     

Cre/LoxP重组系统的改造及在树干毕赤酵母中的应用

为了实现在P.stipitis中进行无痕基因敲除,以Cre/LoxP系统为研究对象,首先通过同源重组构建尿嘧啶营养缺陷型树干毕赤酵母(ura3-);同时通过定点突变pSH47-Hpt质粒的hpt基因和cre基因,将CDS区CTG突变为TTG;最后以乙醛脱氢酶基因为靶基因,验证突变后的Cre/LoxP系统在P.stipitis进行无痕基因敲除的可行性。结果表明:本文在P.stipitis中成功使用潮霉素B抗性标记,经过修饰后的Cre/LoxP敲除系统能够在P.stipitis中无痕敲除目的基因,为后续研究P.stipitis功能基因和改造代谢途径提供了一种试验方法和筛选标记。     

肌肉抑制素基因及在食用肉类生产中的应用前景

肌肉抑制素(Mstn)基因是TGF-β超家族的一种新基因,仅在骨骼肌特异表达并作为肌肉生长的负调控因子.由于该基因为单一开关基因,其缺失即导致肌肉量增加,同时Mstn基因天然敲除的肌肉加倍良种牛的存在,说明这种基因操作不会扰乱其他生长调控系统并带来不正常病理变化,因而Mstn基因是提高肉用动物肌肉产量的理想靶基因.     

兽疫链球菌透明质酸分解酶基因的敲除

以透明质酸分解酶基因（Hyl）为改造目标, 利用同源重组技术获得 Hyl基因敲除的重组菌。首先以兽疫链球菌的基因组DNA为模板扩增出部分透明质酸分解酶基因（Hyl-1）,然后将其克隆到载体pMD19-T上,再以质粒pUC19为模板, PCR扩增得到氨苄青霉素抗性基因,通过反向PCR将其插入Hyl-1基因的中部,得到基因敲除载体pMD19T-SA。该载体与质粒pBR322分别用EcoRⅠ、PstⅠ双酶切后进行连接,得到基因敲除的重组载体pBR322 SA,PCR 及限制性酶切分析,构建的敲除载体与设计结果相符。最后,利用这两种敲除载体通过同源重组技术得到一株重组菌,经PCR 及酶活鉴定,这株菌的Hyl 基因已缺失。     

GATA1s敲除hPSCs模型构建与造血分化影响初探

本文建立了GATA1s敲除人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)细胞株，并以此为模型探讨了GATA1s缺失对体外诱导造血分化的影响。本文通过构建含有重组臂-敲入片段(GATA1外显子Ⅱ-Ⅵ序列及BGH polyA序列)-LoxP-潮霉素筛选标记-LoxP-重组臂的打靶质粒和含有gRNA-Cas9的gRNA质粒对hPSCs进行基因编辑以敲除GATA1s。通过第一步电穿孔将以上质粒导入细胞，潮霉素初步筛选7 d后的阳性克隆进行下一步电穿孔环化重组酶(Cre)使LoxP位点特异性重组以去除筛选标记，通过单细胞克隆的方式进一步培养，PCR及测序鉴定出正确基因编辑细胞，最后通过蛋白质免疫印迹验证其GATA1与GATA1s蛋白的表达情况，验证敲除GATA1s后的细胞株进行体外诱导造血分化，发现其CD34⁺、CD43⁺及CD45⁺细胞增多，但GPA⁺、CD41a⁺及CD42b⁺细胞显著减少，通过转座子系统过表达GATA1也不...     

集胞藻PCC6803中基因slr1761突变体的构建

PCR扩增了集胞藻PCC6803的slr1761基因,进一步以PGEM-T为载体将其克隆到大肠杆菌中,构建了P1761质粒。通过DNA体外重组,以卡那霉素抗性基因插入目的基因片段,构建了既含目的基因上游及下游序列、又携带选择性标记卡那霉素抗性的PK1761质粒。该质粒转化野生型集胞藻PCC6803细胞,利用同源重组原理获得了能在含卡那霉素的培养基上正常生长的基因敲除突变株。对该突变株基因组DNA进行PCR扩增,验证了其基因结构的正确性。     

成骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

构建了含有骨钙素基因启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体pOC-Cre, 以显微注射的方法将4.6 kb的转基因片段OC-Cre导入小鼠受精卵。16只子代小鼠中经PCR和Southern杂交鉴定, 有2只小鼠携带外源基因, 整合率为12.5%。为了检测OC-Cre在转基因小鼠中表达的组织特异性, 将转基因首建者小鼠与基因组上携带有LoxP位点的条件性Smad4基因敲除小鼠交配, PCR结果显示, 仅在子代纯合型小鼠骨组织基因组中扩增出了Cre介导重组后的片段。将OC-Cre转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配, 利用LacZ染色对双转基因阳性子代小鼠进行检测, 结果显示Cre重组酶在成骨细胞中特异性表达并介导ROSA基因座LoxP位点间的重组。所有这些结果说明：所建立的OC-Cre转基因小鼠在成骨细胞中特异性表达Cre重组酶, 并能在体内介导成骨细胞基因组上LoxP位点间的重组, 是一种理想的研制成骨细胞特异性基因敲除小鼠的工具小鼠。     

一种两步基因同源重组敲除酵母靶标蛋白基因的方法

目的:建立一种在代谢工程改造的毕赤酵母菌中高效敲除靶标蛋白基因的方法。方法:构建敲除载体,以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因为靶基因,以尿嘧啶合成关键酶URA3基因为营养缺陷型筛选标记,第一步重组利用ura3正筛选获得敲除载体在酵母染色体中的定点整合,第二步通过5-氟乳清酸(5-FOA)筛选到表型为ura3-的克隆,ura3基因被剔除的同时,目的基因GM-CSF也随之丢失,实现第二次重组;利用基因组PCR和蛋白电泳进行鉴定。结果:通过两步基因同源重组,敲除了毕赤酵母GJK01的报告蛋白GM-CSF的编码基因388 bp,PCR结果显示该基因已完全丢失,SDS-PAGE分析无GM-CSF表达。结论:仅通过2周时间的筛选、鉴定,在毕赤酵母GJK01中敲除了报告蛋白GM-CSF的编码基因,突变菌株的阳性率达到50%,最终建立了以URA3为筛选标记的两步基因同源重组敲除目的基因的方法。     

白念珠菌TFP1基因与钙调神经磷酸酶通路的相关性分析

目的构建白念珠菌TFP1基因敲除株,并初步分析白念珠菌TFP1基因与钙调神经磷酸酶通路相关基因的关系。方法通过融合PCR将白念珠菌TFP1基因上下游和营养缺陷筛选标记连接组成基因敲除组件,再运用醋酸锂转染法将一条基因敲除组件转入白念珠菌工程菌SN152,在营养缺陷平板上筛选出TFP1~(+/-)菌株,再运用同样的方法敲除第2条等位基因。采用实时荧光定量PCR的方法检测TFP1~(-/-)菌株、TFP1~(+/-)菌株以及SN152菌株RTA2和CRZ1基因的表达量。结果成功构建白念珠菌TFP1双等位基因敲除株,并且双等位基因敲除株中RTA2和CRZ1基因表达量均下降。结论敲除白念珠菌TFP1基因影响钙调神经磷酸酶通路相关基因RTA2和CRZ1的表达。     

利用TALEN技术在牛胎儿成纤维细胞中敲除Myostatin基因

肌肉生长抑制素(Myostatin, MSTN)基因能够负向调节骨骼肌的生长和发育, 牛MSTN基因突变会出现“双肌”特征。文章利用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)靶向敲除牛胎儿成纤维细胞的MSTN基因, 获得敲除MSTN基因的细胞系, 为制备MSTN基因敲除牛提供材料。构建一对MSTN基因的TALENs真核表达载体, 分别采用PEI转染试剂和电穿孔法进行牛胎儿成纤维细胞的转染, 测序结果表明TALEN技术可用于敲除牛MSTN基因, 利用T7核酸内切酶1(T7E1)检测其突变效率, 结果显示电穿孔转染的敲除效率为20.4%。通过有限稀释法, 共获得10个MSTN基因敲除的细胞克隆(包括MSTN^-/-和MSTN^+/-), 其靶位点敲除的碱基数分别是1~20不等, 部分会出现移码突变。出现移码突变的细胞系可用于MSTN基因敲除的转基因肉牛的制备。