跨膜蛋白TMEM106A诱导肝癌细胞HepG2巨泡样死亡

跨膜蛋白106A (transmembrane protein 106A, TMEM106A)是本中心首先鉴定的与细胞死亡相关的分子。体内外的功能研究证明,TMEM106A在胃癌细胞的高表达能够明显抑制肿瘤细胞的生长,并诱导细胞死亡。本研究利用组织芯片和免疫组化的方法,发现TMEM106A蛋白在癌旁非肿瘤组织中高表达,主要定位在胞质,而在肝癌细胞中低表达或者不表达。进一步的功能研究证明TMEM106A在肝癌细胞系HepG2中高表达能够降低细胞活力、诱导胞质空泡化以及细胞周期阻滞在G2/M期,最终细胞死亡。胞质聚集的空泡表现为单层膜,液泡内基本不含亚细胞器结构以及高电子密度的聚集物。本研究首次证明TMEM106A能够引起巨泡样细胞死亡,其作用机制需要进一步探讨。     

丁酸钠至少部分通过NF-Y依赖的TXNIP表达诱导人肺癌细胞A549死亡北大核心CSCD

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂丁酸钠调节细胞分化、增殖和抑制肿瘤发生。硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)通过负性调控硫氧还蛋白的活性,调控细胞内的氧化还原平衡,抑制细胞生长。本研究证明,丁酸钠可通过激活依赖于转录因子NF-Y的TXNIP表达,诱导人非小细胞肺癌细胞A549死亡。MTT法显示,5 mmol/L丁酸钠处理A549细胞72 h可显著诱导其死亡;流式细胞分析发现,其中大部分细胞以凋亡形式死亡。表达芯片分析表明,在丁酸钠处理的A549细胞中,TXNIP的mRNA水平显著提高30~50倍;实时定量PCR、免疫细胞化学和蛋白质印迹结果进一步证明,丁酸钠可显著上调TXNIP表达。荧光素酶报告基因分析证明,与对照细胞比较,丁酸钠刺激的细胞内报告酶活性可提高约10倍,提示丁酸钠可激活TXNIP启动子的转录活性。TXNIP启动子删除突变分析显示,删除NF-Y结合的DNA序列显著降低丁酸钠对TXNIP启动子的激活能力,表明NF-Y转录因子参与丁酸钠介导的TXNIP基因转录激活。为分析TXNIP在A549细胞中的定位和部分功能,在A549细胞中过表达GFP-TXNIP融合蛋白及其截短突变体融合蛋白;结果显示,野生型和保留N端1-281aa的截短突变体定位在细胞核,而删除N端1-200aa时,其定位在细胞核和细胞质,提示N端1-200aa可调节该蛋白质的定位。然而,丁酸钠刺激未发现表达的GFP-TXNIP在细胞内定位改变。以上结果表明,丁酸钠可通过激活转录因子NF-YC依赖的TXNIP激活,诱导A549细胞死亡,但不能改变TXNIP蛋白在细胞内的定位。上述结果还提示,TXNIP的N端1-200aa可能在调节TXNIP的细胞定位中发挥作用。是否丁酸钠刺激TXNIP表达导致的细胞死亡系通过改变细胞氧化压力,以及TXNIP在细胞中定位的详尽调节机制尚待进一步研究证明。     

丁酸钠至少部分通过NF-Y 依赖的TXNIP 表达诱导人肺癌细胞A549死亡

组蛋白去乙酰化酶（HDACs）抑制剂丁酸钠调节细胞分化、增殖和抑制肿瘤发生。硫氧还蛋白相互作用蛋白( thioredoxin-interacting protein,TXNIP)通过负性调控硫氧还蛋白的活性,调控细胞内的氧化还原平衡,抑制细胞生长。本研究证明,丁酸钠可通过激活依赖于转录因子NF-Y的TXNIP 表达,诱导人非小细胞肺癌细胞A549死亡。MTT法显示,5 mmol/L丁酸钠处理A549 细胞72 h可显著诱导其死亡;流式细胞分析发现,其中大部分细胞以凋亡形式死亡。表达芯片分析表明,在丁酸钠处理的A549 细胞中,TXNIP 的mRNA 水平显著提高30～50倍;实时定量PCR、免疫细胞化学和蛋白质印迹结果进一步证明,丁酸钠可显著上调TXNIP 表达。荧光素酶报告基因分析证明,与对照细胞比较,丁酸钠刺激的细胞内报告酶活性可提高约10 倍,提示丁酸钠可激活TXNIP 启动子的转录活性。TXNIP 启动子删除突变分析显示,删除NF-Y 结合的DNA 序列显著降低丁酸钠对TXNIP 启动子的激活能力, 表明NF-Y转录因子参与丁酸钠介导的TXNIP基因转录激活。为分析TXNIP 在A549 细胞中的定位和部分功能,在A549细胞 中过表达GFP TXNIP 融合蛋白及其截短突变体融合蛋白;结果显示,野生型和保留N 端1-281aa的截短突变体定位在细胞核,而删除N 端1-200aa 时,其定位在细胞核和细胞质,提示N 端1 200aa 可调节该蛋白质的定位。然而,丁酸钠刺激未发现表达的GFP TXNIP在细胞内定位改变。以上结果表明,丁酸钠可通过激活转录因子NF YC 依赖的TXNIP激活,诱导A549 细胞死亡,但不能改变TXNIP蛋白在细胞内的定位。上述结果还提示,TXNIP 的N 端1-200aa 可能在调节TXNIP 的细胞定位中发挥作用。是否丁酸钠刺激TXNIP表达导致的细胞死亡系通过改变细胞氧化压力,以及TXNIP在细胞中定位的详尽调节机制尚待进一步研究证明。     

细胞水平筛选鉴定激活核因子κB通路的新基因TMEM9B

核因子κB(NF-κB)是细胞内重要的转录因子,其介导的细胞信号转导通路在细胞凋亡中的作用是国内外研究的热点．为了筛选NF-κB通路相关新基因,建立了基于细胞水平的报告基因高通量筛选模型．利用双荧光素酶报告系统检测报告基因荧光素酶活性,通过对构建的439个人类未知功能基因的筛选,获得了一批激活NF-κB信号通路的功能基因,其中基因TMEM9B可以明显激活NF-κB通路．进一步实验显示TMEM9B激活NF-κB通路呈明显剂量依赖性,Western blot及EMSA实验证实,TMEM9B能够促进胞质内NF-κB的抑制分子IκBα的降解,并促使NF-κB由胞质向胞核转移,同时流式细胞术实验发现TMEM9B可引起293T和HeLa细胞的凋亡．总之,所建立的基于细胞水平的NF-κB通路筛选模型稳定高效,筛选并验证TMEM9B可明显激活NF-κB信号转导通路,并从而引起细胞凋亡．     

沉默EVL表达抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖和迁移能力

Ena/VASP 样蛋白（Ena/VASP like protein,EVL）是Ena/VASP家族成员之一,它参与肌动蛋白细胞骨架重组,以及细胞迁移、收缩环形成和细胞间附着.EVL在肝癌SMMC-7721细胞中高表达. 抑制EVL蛋白表达后,SMMC-7721细胞的增殖与迁移能力降低.为研究EVL在肝癌细胞的功能,构建了靶向shRNA干扰表达载体,稳定转染肝癌SMMC-7721细胞. MTT实验和细胞集落形成实验显示,与转染对照比较,沉默EVL蛋白表达可明显抑制SMMC-7721肝癌细胞的增殖、集落形成能力. Transwell实验证明,沉默EVL表达导致SMMC-7721细胞迁移能力降低. 进而,流式细胞术揭示,沉默EVL表达的SMMC-7721细胞G0/G1期细胞比例增多.研究结果提示,EVL蛋白可促进肝癌细胞的增殖与迁移;该结果可解释EVL在肝癌细胞中高表达的意义.     

肝癌细胞系差异性表达的糖结合蛋白研究

糖结合蛋白(glycan-binding protein,GBP)在细胞生命周期中扮演着重要角色,如细胞识别、运输、免疫、代谢、增殖分化及细胞间的相互作用等.目前,对GBP的改变对细胞生物过程产生影响的研究甚少.本研究用糖芯片技术对肝癌细胞系Hep G2和正常肝细胞系L02表达的GBP进行研究;糖细胞化学验证确定差异表达GBP在肝癌细胞系中的变化和分布.结果显示,8种糖探针(如SL、LNT和Gal NAc等)和5种糖探针(如Man、Man-9-Glycan,Xyl等)分别对应的GBP在Hep G2细胞中表达上调或下调.糖细胞化学结果显示:Gal NAc识别的GBPs主要表达在Hep G2的胞膜、中央胞质、核周胞质区域,而在L02的相同区域表达减弱;Neu Ac识别的GBPs主要表达在L02的胞膜区及核周胞质区,而在Hep G2细胞的相同区域表达减弱.这些数据为寻找新的肝癌发病机制和抗肿瘤策略提供了有用信息.     

microRNA-215异常激活抑制Dicer1促进肝癌细胞迁移和转化

microRNA异常表达促进癌症的发生发展.本研究通过microRNA表达谱分析2个肝癌细胞和2个正常细胞microRNA的表达,寻找与肝癌相关的microRNA,发现microRNA-215在肝癌细胞中高表达,q RT-PCR验证microRNA-215在肝癌细胞呈显著高表达.进一步研究发现,microRNA-215直接靶向Dicer1基因的3′UTR并抑制Dicer1蛋白表达,Dicer1是microRNA加工成熟过程中必需的蛋白.过表达microRNA-215抑制Dicer1从而促进肝癌细胞迁移和转化,而抑制microRNA-215表达起相反作用.Dicer1抑制后,许多抑癌microRNA表达被抑制,从而促进迁移和转化.相对于癌旁组织,Dicer1在肝癌组织呈明显低表达.本研究揭示,microRNA-215异常活化并抑制Dicer1表达与肝癌发展相关.     

p100蛋白表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株的建立

目的建立p100表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株,并初步探讨p100在HepG2肝癌细胞中的功能。方法用脂质体将含有真核细胞筛选标记Neo和GFP的p100 shRNA表达质粒转染入HepG2细胞。经G418耐药筛选稳定整合抗药基因的细胞单克隆;荧光镜检GFP阳性细胞单克隆,挑取单克隆;Western检测HepG2细胞稳定株HepG2（p100I）中p100表达的抑制效果;平板细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;MTS法检测细胞存活;划痕实验检测细胞迁移能力。结果成功获得了p100表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株HepG2（p100I）,其中p100的表达明显降低。并且实验表明,该p100表达抑制稳定株的克隆形成能力,抵抗化疗药物Cisplatin诱导的细胞死亡的能力和迁移能力明显低于对照组细胞。结论p100表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株的建立为研究p100蛋白在肝癌中的作用提供了体外细胞系模型,基于此稳定株的研究,发现p100能够影响HepG2肝癌细胞的多种细胞功能。     

TMEM16A在上皮细胞中的表达和调控

TMEM16A(tranmenbrane protein 16A)作为一种已知的钙激活氯离子通道(calcium-activated chloride channel,CaCC)在机体中广泛表达,并介导多种重要的生理功能。在上皮细胞中,TMEM16A可以通过多级反应介导细胞的膜电位变化和液体分泌。此外,在多种炎症相关的上皮组织疾病如囊性纤维化、哮喘和急性胰腺炎中均发现TMEM16A表达上调的现象,调节TMEM16A的表达和通道活性可能是炎症治疗的一种潜在策略。研究TMEM16A在上皮细胞中的表达和调控机制,对阐明TMEM16A的生理病理功能具有重要意义。该文就上皮细胞中TMEM16A的研究进展进行综述。     

人源跨膜蛋白43(TMEM43)的检测、细胞内定位及体外真核表达

为探究人源跨膜蛋白43(TMEM43)基因含量、定位分布及体外真核表达情况,利用RT-PCR及Western blot方法分别检测内源MRC-5和HEK293细胞内TMEM43基因及其蛋白表达情况,采用间接免疫荧光实验进一步分析其在MRC-5细胞内的分布;构建重组表达载体pcDNA3.1-EGFP-TMEM43,转染至HEK293细胞内检测外源TMEM43在HEK293细胞内的基因和蛋白表达情况。结果显示,基因水平TMEM43在MRC-5细胞内的表达明显高于HEK293细胞,蛋白水平仅能检测到MRC-5细胞内TMEM43的表达。重组表达质粒pcDNA3.1-EGFP-TMEM43转染HEK293细胞后,基因水平TMEM43表达显著升高, Western blot可检测到转染后细胞内TMEM43蛋白成功表达。结果表明,不同细胞表达TMEM43含量存在差异,肺来源细胞内TMEM43的表达明显高于肾来源的细胞;构建的重组载体pcDNA3.1-EGFP-TMEM43可成功转染HEK293细胞并表达。该研究为TMEM43结构及功能、与疾病相关机理的进一步探究提供了实验依据。     

β-淀粉样肽的细胞内毒性与线粒体通透性转变孔道

β-淀粉样肽（amyloid—β peptide,Aβ）是阿尔采末病患者脑内老年斑的主要成分,具有很强的神经毒性。近年来,研究发现细胞内产生和聚集的Aβ可以通过多种途径发挥其神经毒性作用。利用离体线粒体模型发现,Aβ可以导致线粒体通透性转变孔道（mitochondrial permeability transition pore,MPTP）开放。MPTP开放会进一步加剧线粒体功能的损伤,并可导致细胞色素c和凋亡诱导因子释放,在线粒体介导的细胞死亡中具有重要作用。Aβ引起的MPTP开放可能是胞内Aβ导致神经元死亡的重要通路,研究Aβ对该孔道的影响将有助于阐明Aβ的毒性机理并以期找到减轻Aβ损伤的新策略。     

基于TCGA数据分析研究TMEM206在HCC中的表达及其与预后的相关性

[目的]探讨TMEM206表达在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)诊断和预后中的价值。[方法]从肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库下载肝细胞癌数据集表达谱及临床病理特征资料。采用KaplanMeier和Cox分析,观察TMEM206表达对肝细胞癌患者生存和预后的影响。使用TCGA数据集进行基因集富集分析(GSEA)。[结果]TMEM206在HCC肿瘤组织中的表达高于癌旁组织(P 0.000 1),并且TMEM206的表达与HCC的肿瘤分级、肿瘤分期都有显著相关。生存分析结果表明TMEM206表达越高,HCC患者的总体生存时间越短。单因素和多因素Cox分析表明,TMEM206 mRNA的表达可能是判断HCC预后的有效生物标志物。GSEA鉴定了TMEM206在HCC中的高表达可能与泛素介导的蛋白质水解、胞吞作用、RNA降解、小细胞肺癌、癌症通路、胰腺癌、胞质DNA传感途径、慢性粒细胞白血病、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、细胞周期等反应有关。[结论]TMEM206 mRNA高表达是肝细胞癌的诊断和预后中的有效生物标志物。     

铝诱导植物程序性细胞死亡信号转导的研究进展

铝是制约酸性土壤上作物生产的主要因素。铝诱导氧化胁迫产生大量活性氧/一氧化氮,引起胞质钙超载,通过线粒体信号转导途径激发相关凋亡基因,从而引起细胞主动死亡,以减轻铝对植物的进一步毒害。本文综述了铝诱导程序性细胞死亡的信号分子、相关基因以及信号转导途径,对未来的研究方向提出了展望,为深入研究植物铝毒害机理和耐铝机制提供参考。     

程序性细胞死亡机制的研究进展

细胞是生物体最基本的结构单位和功能单位,细胞死亡对于多细胞生物的发育和稳态极为重要,也是生命的基本过程之一。目前认为细胞死亡形式主要分为两大类:非程序性细胞死亡(non-programmed cell death,NPCD)即坏死(necrosis);程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。PCD与坏死不同,组织内无可见的炎症反应,无死亡细胞的溶解。程序性细胞死亡按其发生机制的不同可以分为凋亡(apoptosis)、自吞噬性程序性细胞死亡(autophagic cell death)、类凋亡/副凋亡(paraptosis)、细胞有丝分裂灾难(mitotic catastrophe)、胀亡(oncosis)、焦亡(pyroptosis)、胞质自切(autoschizis)、细胞程序性坏死(necroptosis)、细胞侵入性死亡(entosis)、铁死亡(ferroptosis)等。近年来,程序性细胞死亡在肿瘤发生发展中的作为成为研究热点,所以对程序性细胞死亡机制的研究至关重要,本文将对各类型程序性细胞死亡的机制做简要综述。     

细胞外ATP通过刺激NADPH氧化酶缓解水杨酸诱导的细胞死亡

水杨酸（SA）是植物重要的信号分子,低浓度的SA能够诱导植物的抗病反应,而高浓度的SA导致植物细胞死亡。本文采用500μmol·L-1的SA处理烟草悬浮细胞BY-2,研究了细胞外ATP在SA诱导的细胞死亡中的作用及可能的机制。结果显示,外源ATP可缓解SA诱导的细胞死亡水平的上升。另外,SA导致NADPH氧化酶活性下降,而外源ATP则刺激其活性上升。外源ATP能缓解SA对NADPH氧化酶活性的抑制,且这种缓解作用可被NADPH氧化酶的抑制剂——二亚苯基碘（DPI）所消除。DPI还可部分消除外源ATP对SA所诱导的细胞死亡的缓解作用。上述结果表明,胞外ATP通过刺激NADPH氧化酶活性缓解SA诱导的细胞死亡。     

天然产物西红花苷靶向TMEM16A离子通道治疗肺腺癌机制研究

TMEM16A离子通道在人体各种生理活动中起着至关重要的作用,并且是多种疾病的潜在药物靶点.最近,多项研究表明, TMEM16A在肺癌中内源性高表达与肺癌细胞增殖、迁移密切相关.本研究发现,西红花苷是一种新的TMEM16A天然产物抑制剂,它可以通过抑制TMEM16A从而抑制肺癌细胞增殖和迁移.本团队的研究数据表明,西红花苷浓度依赖性抑制TMEM16A全细胞电流,其IC50值约为(38.32±2.31)μmol/L. CCK8和划痕愈伤实验表明,西红花苷浓度依赖性抑制肺癌细胞LA795和NCI-H1299的增殖和迁移,但是对肺胚二倍体细胞2BS的增殖和迁移几乎没有抑制作用.利用shRNA敲除内源性TMEM16A可以消除西红花苷对LA795细胞增殖和迁移的抑制效果.总之,本研究提示TMEM16A是西红花苷抑制肺癌增殖和迁移的潜在作用靶点,西红花苷可以作为肺癌治疗药物的先导化合物进行研究.     

乙型肝炎病毒X蛋白通过靶向miR-200c诱导DNA异常甲基化

乙型肝炎病毒x (hepatitis B virus x,HBx)蛋白是导致肝癌(hepatocellular Carcinoma,HCC)的重要因素.但HBX在HCC形成过程中表观遗传机制尚有待阐明.本研究发现microRNA-200c (miR-200c)在过表达乙型肝炎病毒的HCC中下调,并且其直接靶向DNA甲基转移酶3A (DNA methyltransferase 3A,DNMT3A).此外,miR-200c和DNMT3A在HB诱发的肝癌组织中呈现负相关.乙型肝炎病毒诱导miR-200c下调,进而引起DNMT3A表达上调,导致细胞中肿瘤相关基因的启动子超甲基化.我们对乙型肝炎病毒诱导的肝癌表观遗传学改变进行了进一步研究,并提出一种基于miRNA的靶向治疗乙型肝炎病毒相关肝癌的潜在方法.     

以“dominant negative”策略消除人肝癌细胞表？…

选用高表达α６β１并主要借其介导细胞在层粘连蛋白（ｌａｍｉｎｉｎ,ＬＮ）基质上粘附和铺展的肝癌细胞系Ｂｅｌ７４０２,采用“ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ”策略消除细胞表面α６β１受体的功能,以研究α６β１在人肝癌细胞生物学行为中的作用。用缺失胞质功能域的β４亚单位ｃＤＮＡ（β４－ｔｒ）转染细胞,其表达产物β４－ＴＲ可以和α６高亲和性竞争性地结合,形成因β４－ＴＲ缺失胞质功能域而无生物学功能的     

黄芩甙对肝癌细胞BEL-7402形态学的影响

目的观察黄芩甙对肝癌细胞BEL-7402凋亡的影响,同时观察对肝癌细胞形态及超微结构、线粒体超微结构、线粒体膜电位和细胞内Ca^2＋的影响,探讨线粒体损伤在黄芩甙诱导肝癌细胞凋亡中的作用及可能的机制。方法应用细胞培养技术培养肝癌细胞BEL-7402,光镜、倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜观察细胞形态及超微结构的变化尤其是线粒体的变化,应用流式细胞仪检测细胞凋亡百分率及线粒体膜电位、细胞内Ca^2＋的改变,免疫组化法检测细胞Bcl-2、Pax蛋白表达。结果黄芩甙诱导肝癌细胞BEL-7402凋亡呈剂量依赖关系,细胞形态、超微结构及线粒体超微结构出现明显改变,降低肝癌细胞线粒体膜电位,使细胞内Ca^2＋增加,细胞Pax表达增加,广泛分布于胞核和胞质中,Bcl-2表达减少。结论黄芩甙诱导肝癌细胞BEL-7402凋亡,线粒体损伤在黄芩甙诱导肝癌细胞凋亡中起重要作用,其机制可能为抑制肝癌细胞Bcl-2蛋白表达,促进Pax蛋白表达及细胞内Ca^2＋增加,激发线粒体膜通透性转运孔开放,线粒体跨膜电位降低,使肝癌细胞凋亡。     

Sirt1促进肝癌细胞增殖和侵袭活性的分子机制

目的:探讨Sirt1基因在肝癌组织和癌旁组织中表达差异,进一步检测其对肝癌细胞增殖和侵袭活性的调控.方法:收集30例肝癌手术患者的病变组织和癌旁组织,通过Real time-PCR检测Sirt1基因的表达差异,并对其中6例组织通过western blot验证.在转染Sirt1基因或干扰掉该基因后,采用MTT的方法检测HepG2细胞的增殖活性,通过Transwell小室的方法检测HepG2细胞的侵袭活性.结果:Real time-PCR检测发现Sirt1 mRNA在肝癌组织中高表达,同样,Western blot检测也发现Sirt1在肝癌组织中高表达,而在癌旁组织中表达较低.过表达Sirt1导致HepG2细胞过度增殖,侵袭能力增加;相反,敲除该基因,细胞增殖和侵袭活性被抑制.结论:Sirt1在肝癌组织中高表达并且介导肝癌细胞增殖和侵袭活性.该基因在肝癌组织中的过量表达有助于肝癌的临床诊断,同时Sirt1在肝癌的恶性肿瘤生物活性中发挥着重要的作用,因此,Sirt1是一个潜在的治疗肝癌的药物作用靶点,为开发新的抗肿瘤药物提供了新的治疗靶点.