Production and stabilization of cellulases fromTrichoderma reesei

Summary Production of exoglucanase and endoglucanase in batch culture ofT. reesei QM 9414 was growth-associated both in lactose and leached beet pulp media. Endoglucanase remained stable whilst the organism was in the stationary phase but exoglucanase activityy decreased sharply at the onset of the stationary phase. Addition of the protease inhibitor phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) towards the end of growth produced complete protection toward protease inactivation, exoglucanase being stabilized even in prolonged stationary phase. The stability of exoglucanase in the presence or absence of mycelium, with and without PMSF addition, showed that endogenous cell-free and cell-associated proteases weree responsible for exoglucanase inactivation in the stationary phase. Inactivation of exoglucanase depended on the physiological stage of the cultures, the enzyme remaining stable as long as the culture was in an active growth phase.

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Resumen La producción de exoglucanase y endoglucanasa deT. reesei QM 9414 en cultivo por lotes en medios con lactosa y coseta agotada de remolacha como fuentes de carbono, fue asociada al crecimiento. La endoglucanasa permaneció estable en fase estacionaria, pero la actividad de exoglucanase disminuyó drásticamente al entrar el cultivo en dicha fase. La adición del inhibidor de proteasas PMSF hacia el final de la fase de crecimiento provocó la total inactivación de las proteasas producidas, lográndose estabilizar la exoglucanasa aún en prolongada fase estacionaria. Se analizó la estabilidad de exoglucanasa en presencia y ausencia de micelio, con y sin adición de PMSF; los resultados muestran que proteasas endogenas extracelulares y asociadas a la célula son responsables de la inestabilidad de la exoglucanasa en fase estacionaria. La inactivación de la exoglucanasa depende del estado fisiológico del cultivo, ya que la enzima permanece estable mientras el cultivo se encuentra en crecimiento.

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Résumé La production d'exoglucanase et d'endoglucanase dans les cultures deT. reesei QM 9414 en milieu non renouvelé est associée à la croissance tant du lactose que du jus d'extraction de la pulpe de betterave. L'endo-glucanase reste stable tant que le microorganisme est dans sa phase stationnaire de croissance tandis que l'activité exoglucanasique décroit rapidement dès le début de cette phase stationnaire. L'ajour du fluorure de phenylmethylsulfonate (PMSF), un inhibiteur protéolytique, vers la fin de la croissance a exercé une protection complète contre l'inactivation par la protéase: l'exoglucanase était protégée dans ces conditions même en phase stationnaire prolongée. La stabilité de l'exoglucanase en présence ou en absence de mycelium, avec ou sans ajout de PMSF démontre la responsabilité des exo-protéases endogènes solubles et de protéases associées aux cellules dans l'inactivation de l'exoglucanase dans la phase stationnaire. L'inactivation de l'exoglucanase dépend de l'état physiologique des cultures. En effet, l'enzyme reste stable aussi longtemps que la culture est en phase active de croissance.

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Based on a paper presented at the First Latin American Congress on Biotechnology, Tucumán, Argentina, October 4–8, 1987.     

Variation in N2 fixation,N and P contents of mycorrhizalVigna unguiculata in relation to the progressive development of extraradical hyphae ofGlomus mosseae

Summary Vigna unguiculata cv. 58–185 grown in a sterile Dek soil was inoculated withRhizobium sp. orRhizobium sp. plusGlomus mosseae. Response of the host plant to the treatments was estimated by periodic measurements of shoot and nodule dry weights, N₂ fixation (C₂H₂ reduction activity) and N and P contents up to the 50th day of the growth cycle. It was only 45 days after planting that shoot dry weight of dually inoculated plants differed significantly from that of plants inoculated withRhizobium sp. alone. Nodule dry weight and N₂ fixation of dually inoculated plants were significantly higher than those of plants inoculated withRhizobium sp. alone from day 20 after planting, but there was no significant difference in N content (%). During the first 20 days, shoot P content (%) of both sets of plants decreased progressively, P content of dually inoculated plants being lower than that of the others. Later, P content of dually inoculated plants increased rapidly whereas P content of the other plants remained constant. Increase in nodule dry weight, N₂ fixation and P content of dually inoculated plants corresponded to the onset of the development of the extra-radical hyphae ofGlomus mosseae. In the rhizosphere.

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Resumen Se cultivóVigna unguiculata cv. 58–185 en un suelo estéril tipo Dek, se inoculó conRhizobium sp. o conRhizobium sp. másGlomus mosseae. La respuesta de la planta huésped a los tratamientos se estudió midiendo periodicamente el peso seco de la parte aerea y de los nódulos, la fijación de N (actividad reductora de C₂H₂) y los contenidos de N y P hasta el 50° día del ciclo de crecimiento. La diferencia entre el peso seco de la parte aerea de las plantas con doble inoculación y aquellas inoculadas conRhizobium sp. unicamente, no fue significativa hasta 45 días despúés de la siembra. A los 20 días de la siembra tanto el peso seco de los nódulos como la fijación de nitrógeno de las plantas con doble inoculación eran significativamente superiores a los valores obtenidos para las plantas con soloRhizobium sp., aunque no se observaron diferencias en el contenido en N (%). Durante los primeros 20 días del ciclo el contenido en P (%) de ambos grupos de plantas disminuyó progresivamente, siendo los valores obtenidos por las plantas con doble inoculación inferiores a los de las demás. Más tarde el contenido en P de las plantas con doble inoculación aumentó rapidamente manteniéndose constante el de las demás. El incremento en el peso seco de los nódulos, en la fijación de N y en el contenido en P de las plantas con doble inoculación se correspondió con el inicio del desarrollo de las hifas extraradiculares deGlomus mosseae.

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Résumé On a inoculéV. unguiculata poussant dans un sol Dek stérile avecRhizobium etRhizobium plusGlomus mosseae. On a recherché la réponse de la plante-hôte à ces deux traitements en estimant périodiquement les poids des nodules et des parties aériennes de la plante, la fixation d'azote (activité réductrice de C₂H₂), les teneurs en N et P jusqu'au 50^e jour du cycle de végétation. C'est seulement au 45^e jour après la plantation que le poids sec des parties aériennes des plantes inoculées avec deux symbiotes (plantes doublement inoculées) diffère significativement de celui des plantes inoculées avec Rhizobium seul. Le poids sec des nodules et la fixation N₂ des plantes doublement inoculées sont significativement plus élevés que ceux des plantes inoculées avecRhizobium seul au 20^e jour après la plantation mais il n'y a pas de différence significative pour la teneur en N (%). Pendant les 20 premiers jours, la teneur en P (%) des parties aériennes des deux catégories de plantes décroit progressivement; la teneur en P des plantes doublement inoculées est plus faible que celle des plantes inoculées seulement avecRhizobium. Plus tard, la teneur en P des plantes doublement inoculées augmente rapidement tandis que celle des autres plantes reste constante. L'accroissement du poids sec des nodules, de la fixation d'azote et de la teneur en P observé chez les plantes doublement inoculées correspond au démarrage du développement des hyphes extra-radicales deGlomus mosseae dans la rhizosphère.

     

Isolation of a hydroxyproline-secreting pigment-deficient mutant ofNostoc sp. by metronidazole selection

Summary A pigment-deficient mutant ofNostoc sp. was induced by N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine and selected in a medium containing metronidazole. It formed chains of heterocysts, grew more slowly than the control, and excreted hydroxyproline into the medium, imparting a pinkish-brown colour to the cultures.

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Aislamiento de un mutante do Nostoc sp. deficiente en pigmentos y secretor de hidroxiprolina en un medio selectivo con metronidazol

Resumen Un mutante pigmento-deficiente deNostoc sp. fue inducido mediante N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina y seleccionado en un medio conteniendo metronidazol. La cepa mutante creció más lentamente que la control formando cadenas de heterocistos y excretando hidroxiprolina al medio lo cual confirió una coloración rosa-parduzca a los cultivos.

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Isolement par sélection avec le métronidazole d'un mutant de Nostoc sp. excrétant de l'hydroxyproline et déficient en pigment

Résumé Un mutant deNostoc sp. déficient en pigment a été induit par la N-méthyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine et sélectionné dans un milieu contenant du métronidazole. Ce mutant forme des chaînes d'hétérocystes, pousse plus lentement que le contrôle, et excréte de l'hydroxyproline dans le milieu, conférant aux cultures une coloration brun rosâtre.

     

Some factors influencing permeability of cell walls/membranes of the osmotolerant yeastSaccharomyces rouxii grown in the presence and absence of 18% NaCl

Summary Saccharomyces rouxii is an essential micro-organism in the soy sauce/Japanese shoyu/Japanese miso fermentations. Its major activity occurs under conditions of high NaCl content, up to 18% or higher when the pH of the substrate is below 5.0.Saccharomyces rouxii grew much more rapidly and to higher cell population levels in the absence of added salt than with 18% (w/v) NaCl at either pH 7.0 or 4.5. Cells grown with 18% salt were smaller than those grown without added salt. Lower surface area combined with a thicker membrane decreased passive permeability. Growth in the presence of salt resulted in higher content of crude protein, total lipids, phosphatidyl choline and glycerol. The lipid content of the cells reflected the osmotic pressure whether it was caused by NaCl or sugar concentration in the medium. On the other hand, the cells grown in the presence of 18% NaCl contained much less K⁺ and retained potassium and sodium less efficiently. The triosephosphate isomerase (TPI) activity of cells grown in 18% NaCl medium was consistently higher than that of cells grown without added salt.

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Resumen Saccharomyces rouxii es un microorganismo esencial en los procesos fermentativos japoneses shoyu miso y de obtención de salsa de soja. La parte más importante de la actividad de esta levadura se desarrolla en medios con una elevada concentración de sal (hasta más de 18%) y pH inferiores a 5.0.Saccharomyces rouxii creció más rapidamente y alcanzó concentraciones celulares mayores en un medio sin sal que en un medio con 18% de sal, tanto a pH 7.0 como a pH 4.5. Las células desarrolladas en el medio con sal fueron de tamaño inferior que las obtenidas en el medio sin sal. La menor superficie de estas últimas combinada con un mayor espesor de su membrana celular resultan en una disminución del transporte pasivo. El contenido proteíco de las células desarrolladas en el medio sin sal fue de 36.0% contra 49.5% en las células obtenidas en el medio con 18% de NaCl y 43% en células desarrolladas en medios con un contenido en sal entre 6 y 12%. Las células obtenidas en un medio sin sal retuvieron de forma similar su contenido en Na⁺ y K⁺ independientemente de la solución de lavado y de la temperatura empleadas. El contenido de Na⁺ fue de 0.04–0.06 mg Na/g de materia seca y el de K⁺ 7.78–10.04 mg K/g de materia seca. Las células desarrolladas en un medio con adición de sal contenían menor cantidad de K⁺ (0.48–4.77 mg/g de materia seca) variando con las condiciones de lavado. Se observó que las células obtenidas en el medio con 18% de NaCl contenían más lípidos totales (10.13%) comparadas con las células desarrolladas sin sal (6.22%). La cantidad total de fosfatidilcolina y sus liso derivados fue de 72% para las células del medio salado contra 58% en las células sin sal. El contenido lipídico de las células refleja la presión osmótica, ya sea esta producto de la concentración de NaCl o de azucar. Al incrementar el contenido en sal de el medio desde 0–6% hasta 12–18% el contenido intracelular de glicerol aumentó proporcionalmente de 0.429–1.014 hasta 1.107–1.668 mg%. El contenido en triosafosfatoisomerasa de las células crecidas en el medio con 18% NaCl fue de 66.94 unidades/mg de proteína comparado con 42.82 unidades/mg de proteína en las células obtenidas en el medio sin adición de sal.

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Résumé Saccharomyces rouxii est un micro-organisme essentiel dans la fermentation des sauces de soja japonaises (shoyu, miso). Son activité optimale nécessite des concentrations en NaCl élevées, allant jusqu' à 18% (poids/volume), ou même davantage lorsque le pH du substrat est inférieur à 5,0. A pH 7,0 ou 4,5,S. rouxii se développe beaucoup plus rapidement et abondamment en présence qu'en l'absence de sel. Les cellules cultivées en présence de NaCl sont plus petites que celles cultivées sans sel. Du fait à la fois de leur surface moindre et de leur membrane plus épaisse, leur perméabilité passive est diminuée. Leurs teneurs en protéine brute, lipides totaux et glycérol sont sensiblement plus élevées. La teneur des cellules en lipides est déterminée par la pression osmotique, que celle-ci dépende de la concentration du milieu en NaCl ou en sucre. D'autre part, les cellules cultivées avec 18% de NaCl contiennent beaucoup moins de K⁺ et retiennent moins bien le potassium et le sodium que les cellules cultivées sans sel. L'activité triose-phosphate isomérase des cellules cultivées avec 18% de NaCl est supérieure à celle des cellules cultivées sans addition de sel.

     

Studies on the cellulolytic bacteria and cellulose degradation in a cattle waste-fed biogas digester

Summary Production of acetate, the key substrate for methane formation in anaerobic digesters, is limiting in cattle waste-fed biogas digesters due to the lignocellulosic nature of the substrate. Since the rate of cellulose hydrolysis affects acetate production, and the number and type of cellulolytic bacteria that exist in a cattle waste biogas digester is not known, 110 cellulolytic bacterial isolates belonging to the Bacillaceae, Propionibacteriaceae and Lactobacillaceae, and coryneform bacteria likeCellulomonas, were isolated from different depths of an operating 10³ KVIC type biogas digester. The population of cellulolytic bacteria varied between 2.0×10³ and 1.4×10⁵/g slurry. Some bacterial isolates exhibited higher cellulase activity than others, with acetate as the major end-product. In general, acetate, propionate and butyrate were the common end-products but one isolate was homoacetogenic and a few others produced propionate or butyrate orisobutyrate in small amounts with acetate. Cellulose degradation rate in the digester was dependent upon the cellulose: lignin ratio.

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Resumen La producción de acetato, substancia clave para la formación de metano en digestores anaerobios, es el factor limitante en las plantas de biogás, alimentadas mediante residuos de ganado, debido a la naturaleza lignocelulósica del material de partida. La velocidad de hidrolisis de la celulosa afecta a la producción de acetato, sin embargo, nose conocen ni el tipo ni la cantidad de bacterias que existen en una planta de biogas de dichas características. Se aislaron 110 cepas bacterianas con propiedades celulolíticas que pertenecían a los grupos de Bacillus, Propionibacterias, y coryneformes, (como el géneroCellulomonas). Estudiando la población de bacterias celulolíticas a distintas profundidades de un digestor de biogás del tipo 10³ KVIC, se observó que ésta variaba entre 2.10³ y 1.4 10³ celulas/g de residuo liquido analizado. Algunos de los aislados bacterianos mostraron una mayor actividad celulolitica que otros, siendo el acetato el producto final mayoritario. En general los productos finales más corrientes fueron: acetato, butirato y propionato; sin embargo, una de las cepas aisladas era homoacetogénica y algunas otras produjeron pequeñas cantidades de propionato, butirato oisibutirato junto con acetato. La velocidad de degradación de la celulosa dependía de la relación celulosa: lignina.

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Résumé Dans les digesteurs anaérobies produisant du biogaz à partir de fumier de bovins, la production d'acétate, qui est l'étape essentielle conduisant au méthane, est limitée à cause de la nature ligno-cellulosique de la matière première. Il a été procédé à des prelévements à différentes profondeurs dans un digesteur KVIC en service, et à 110 isolements de bactéries cellulolytiques appartenant aux Bacillaceae, Propionibacteriaceae, Lactobacillaceae et bactéries coryneformes du typeCellulomonas. Les populations de bactéries cellulolytiques dénombrées varient entre 2,0×10³ et 1,4×10⁵ par g. d'échantillon. Certaines des bactéries isolées ont une activité cellulase plus élevée que d'autres, et dans tous les cas l'acétate est le produit prédominant. D'une manière générale, l'acétate, le propionate et le butyrate constituent les produits principaux. Une souche est homo-acétogène. Un petit nombre d'autres produisent, en dehors de l'acétate, de faibles quantités de propionate, de butyrate et d'isobutyrate. La vitesse de dégradation de la cellulose dans le digesteur dépend du rapport cellulose/lignine.

     

Rhizobium biomass production in batch and continuous culture with a malt-sprouts medium

Summary The growth of nine strains of four different species ofRhizobium (R. leguminosarum, R. meliloti, R. phaseoli andR. japonicum) was studied with media containing malt sprouts extract (MSE), in place of yeast extract (YE), as source of nitrogen and growth factors. The results obtained in batch cultures indicated that all the strains grew well in MSE medium. In the case of fast-growing strains the biomass increased with increase in the concentration of MSE in the medium, but with the slow-growing strains, likeR. japonicum, growth was inhibited completely by using a concentration of MSE (containing 3.75% w/v of solids) of 40% v/v. With all the strains the concentration of cells attained was greater than 5×10⁹ cells/ml, which clearly indicates that MSE is a suitable component of media, and one which can be used instead of YE. The results of continuous culture experiments showed that a high productivity of cells (15.3×10⁸ cells/ml/h) could be obtained using MSE medium.

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Producción de Rhizobium en cultivos batch y continuo sobre medio conteniendo extracto de raiz de malta

Resumen Se estudió el crecimiento de nueve cepas de cuatro especies diferentes deRhizobium (R. leguminosarum, R. meliloti, R. phaseoli y R. japonicum) en medios de cultivo conteniendo extracto de raíz de malta (ERM), en reemplazo de extracto de levaduras (EL), como fuente de nitrógeno y factores de crecimiento. Los resultados obtenidos en cultivos en batch indicaron que todas las cepas crecieron bien en los medios con ERM. En el caso de las cepas de crecimiento rápido la biomasa se incrementó con la concentración de ERM en el medio de cultivo, pero con las cepas de crecimiento lento(R. japonicum) el desarrollo celular se inhibió completamente para concentraciones de ERM (conteniendo 3,75% p/v de sólidos) de 40% v/v. Con todas las cepas empleadas la concentración celular alcanzada fue superior a 5×10⁹ cél/ml, lo que indica claramente que el ERM es un adecuado componente para los medios de cultivo que puede reemplazar al EL. Los resultados de los experimentos realizados en sistema continuo mostraron que se puede alcanzar una alta productividad (15,3×10⁸ cél/ml/h) utilizando un medio de cultivo suplementado con ERM.

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Production de Rhizobium en culture discontinue et continue sur milieu à base de germes de malt

Résumé La croissance de neuf souches appartenant à quatre éspèces différentes deRhizobium (R. leguminosarum, R. meliloti, R. phaseoli etR. japonicum) a été étudiée avec des milieux contenant, comme source d'azote et de facteurs de croissance, un extrait de germes de malt (MSE) au lieu d'extrait de levure (YE). Les résultats obtenus en culture discontinue (batch) montrent que toutes les souches poussent bien en milieu MSE. Dans la cas des souches à croissance rapide, la biomasse augmente proportionnellement à la concentration de MSE dans le milieu. Par contre, pour les souches à croissance lente, commeR. japonicum, la croissance est complètement inhibée lorsque la concentration en MSE (contenant 3.75% w/v de solides) atteint 40% (v/v). Avec toutes les souches, on obtient une concentration en cellules supérieure à 5×10⁹/ml, ce qui indique clairement que le MSE convient bien et peut être utilisé à la place de YE. Les expériences réalisées en culture continue montrent qu'on peut obtenir avec le milieu MSE une productivité en cellules très élevée (15.3×10⁸ cellules/ml/h.).

     

Production of ethanol by aZymomonas sp strain,free and immobilized in pectin

Summary AZymomonas sp strain, alcohol tolerant, isolated from spontaneously fermenting sugarcane juice, was tested for the production of ethanol in batch, free and immobilized in pectin. CaCl₂ was used during the preparation of the beads and also added to the fermentation medium to improve the stability of the beads. It was found that immmobilization, as well as CaCl₂ above 1 gl^–1 impaired fermentation to some extent. As theZymomonas-pectin beads maintained their fermentative capacity and mechanical stability during about 40 successive batch fermentations, this opens up the possibility of using them for the continuous production of ethanol. The role of free cells as well as the effect of the preincubation of the beads on fermentation are also discussed.

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Resumen Una cepa deZymomonas alcohol tolerante, aislada de jugo de caña de azúcar en fermentación espontánea, fue utilizada para ensayos de producción en lote de etanol, tanto libre como inmovilizada en pectina. En este último caso se utilizó CaCl₂ en la preparación de las perlas como así también como componente del medio de fermentación, con el objeto de aumentar la estabilidad de las perlas. Los resultados obtenidos indican que tanto la inmovilización como una concentración de Cl₂Ca en el medio superior a 1 g/l perjudicaron en cierto grado la fermentación. Las perlas deZymomonas-pectina mantuvieron la actividad fermentativa y estabílidad mecánica durante 40 fermentaciones en lote sucesivas, abriendo la posibilidad de su utilización en la producción continua de etanol. También se analiza la influencia sobre la fermentación de las células libres y de la preincubación de las perlas.

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Résumé Une souche deZymomonas sp., tolérante à l'éthanol, isolée d'un moût spontanné de canne à sucre, a été testée pour sa faculté de produire de l'éthanol en milieu non renouvelé, à l'état libre ou à l'état immobilisé dans la pectine. On s'est servi du CaCl₂ pour la préparation des billes. Le CaCl₂ a également été ajouté au milieu de fermentation pour améliorer la stabilité des billes. Tant l'immobilisation que la présence du CaCl₂ au delà de 1 g par litre inhibent la fermentation jusqu'à un certain point. Mais le fait que les billes deZymomonas dans le pectine conservaient leur capacité fermentative et leur stabilité mécanique pendant environ 40 fermentations successives en milieu non renouvelé, ouvre la possibilité de les utiliser néanmoins en production continue d'éthanol. On discute aussi le rôle dans la fermentation des cellules libres ainsi que l'effet de la préincubation des billes.

     

Studies on N2-fixing bacteria associated with the salt-tolerant grass,Leptochloa fusca (L.) Kunth

Summary N₂-fixing bacteria were isolated from the rhizosphere of naturally grown salt tolerant grass (Leptochloa fusca). A broad spectrum of diazotrophs was found to be associated with the roots ofL. fusca. the systematic position of the three isolates, NIAB-1, C-2 and Iso-2 was determined by morphological, biochemical and mol % (G+C) DNA contents. Two isolates were identified asKlebsiella pneumoniae (NIAB-1) andBeijerinckia sp. (Iso-2).¹⁵N enrichment studies confirmed the nitrogen fixing ability of the isolates. The effects of different levels of combined nitrogen (NO ₃ ^– & NH ₄ ⁺ ), pH (5.5–9.0) and salt (NaCl) on nitrogenase activity of the isolates were determined at various time intervals. All isolates exhibited nitrogenase activity even in the presence of 5 mmol/l NO ₃ ^– or NH ₄ ⁺ in a semi-solid medium after 24 h of growth. Maximum nitrogenase activity was observed at alkaline pH and all isolates were able to tolerate up to 3% NaCl in the medium.

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Resumen Se han aíslado bacterias fijadoras de N₂ en la rizosfera del hábitat natural de la graminea halófilaLeptochloa fusca. Un amplio espectro de diazotrofos se encontró asociado con las raíces deL. fusca. La posición sistemática de tres aíslados: NIAB-1, C-2 y Iso-2 se determinó utilizando sus características morfológicas, bioquímicas y el % (G+C) molar del ADN. El aíslado NIAB-1 se identificó comoKlebsiella pneumoniae y el aíslado Iso-2 comoBeijerinckia. sp. Estudios mediante¹⁵N confirmaron la habilidad fijadora de N₂ de los aíslados. Se determinaron periodicamente los efectos de distintos niveles de nitrógeno combinado (NO₃ ^– y NH₄ ⁺), pH (5.5–9.0) y sal (NaCl) en la actividad nitrogenásica de los aíslados. Todas las cepas aísladas mostraron actividad nitrogenásica incluso en presencia de 5mmol/l de NO₃ ^– y NH₄ ⁺ en un medio semisólido desqués de 24 h. de crecimiento. La actividad nitrogenásica máxima se observó a pH alcalino y todos loa aíslados eran capaces de tolerar hasta 3% de NaCl en el medio.

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Résumé Des bactéries fixatrices de l'azote ont été isolées à partir de la rhizosphère de l'herbe halotoléranteLeptochloa fusca développée dans les conditions naturelles. Il a été constaté qu'un large spectre de diazotrophes est associé aux racines de la plante. La position taxonomique de 3 souches isolées, NIAB-1, C-2 et Iso-2, a été déterminée par des critères morphologiques et biochimiques et par le pourcentage de (G+C) de l'ADN. Deux souches on été identifiées commeKlebsiella pneumoniae (NIAB-1) etBeijerinckia sp. (Iso-2). Les études d'enrichissement en¹⁵N ont confirmé l'aptitude des souches à fixer l'azote. les effets de différents niveaux d'azote combiné (NO₃ ^– et NH₄ ⁺), de pH (5.5–9.0) et de sel (NaCl) sur l'activité nitrogénasique des souches ont été déterminés à divers intervalles de temps. Toutes les souches présentent une activité nitrogènase après 24 h de croissance en milieu semi-solide, et cela même en présence de 5 mmol/l de NO₃ ^– ou NH₄ ⁺. L'activité nitrogènase maximum est observée à pH alcalin, et toutes les souches tolèrent jusqu'à 3% de NaCl dans le milieu.

     

Isolation and reversion of protoplasts ofPleurotus sajor-caju

Summary The conditions for protoplast isolation and reversion inPleuro tus sajor-caju were determined. Spherical, osmotically sensitive protoplasts were released from the mycelia through the action of Novozym 234 and cellulase CP in a suitable osmotic solution. A maximum protoplast yield was obtained from young mycelia at an early exponential growth phase by the use of 0.6 mol/l MgSC₄ in a 0.01 mol/l phosphate buffer at pH 5.0. Mannitol appeared to be more suitable forPleurotus protoplast reversion. Two patterns of morphological development of the protoplasts were observed in the osmotic liquid medium. The reversion frequency was, however, low at 4–5%. There appeared to be no significant difference in the reversion frequencies of the protoplasts grown on the complete medium and on the minimal medium.

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Resumen Aislamiento y reversión de protoplastos en Pleurotus sajor-caju Se determinaron las condiciones para el aislamiento y reversión de protoplastos enPleurotus sajor-caju. Protoplastos esféricos y osmóticamente sensibles se obtuvieron a partir de micelio mediante la action de Novozym 234 y celulasa CP en un medio osmótico adecuado. El máximo numéro de protoplastos fueron obtenidos a partir de miclio joven en la primera parte de la fase exponencial de crecimiento utilizando 0.6 mol/l MgSO en un tampón fosfato (0.01 mol/l) a pH 5.0. Manitol parece ser adecuado para la reversion dePleurotus. Se observaron dos patrones de desarrollo morfológico de los protoplastos en el medio osmótico líquido. La frecuencia de reversion fue, sin embargo, baja (4–5%). No se observaron diferencias significativas entre los protoplastos obtenidos en el medio completo y los que lo fueron en un medio mínimo.

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Résumé Isolement et réversion des protoplastes de Pleurotus sajor-caju Les conditions pour l'isolement de protoplastes dePleurotus sajor-caju et pour leur réversion ont été déterminées. Des protoplastes sphériques et osmotiquement sensibles ont été préparés à partir du mycélium par action de Novozym 234 et de cellulase CP en milieu osmotiquement approprié. Le rendement maximum en protoplastes est obtenu à partir du mycélium jeune, en phase exponentielle précoce, dans un tampon phosphates 0,01 M à pH 5,0, contenant MgSO₄ 0,6 M. Pour la réversion des protoplastes, l'agent le plus favorable est le manitol. Deux modes de développement morphologique des protoplastes en milieu osmotique ont été constatés. Toutefois, la fréquence de réversion est faible (4 à 5%). Il ne semble pas que la fréquence de réversion soit significativement différente lorsque les protoplastes sont cultivés en milieu complet ou en milieu minimal.

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This work is part of the first author's PhD thesis submitted to the Department of Biology of the Chinese University of Hong Kong.     

Epuration biologique du lisier de porc par production de biomasses d'algues unicellulaires

Résumé Ce travail s'attache à l'épuration biologique du lisier de porc par l'entremise de bactéries aérobies (traitement secondaire) et de microalgues d'eau douce (traitement tertiaire). La minéralisation de la matière organique du lisier libère des éléments nutritifs nécessaires à la croissance des algues. Etant donné leur forte composition en protéines, les biomasses ainsi obtenues sont susceptibles d'être utilisées dans l'alimentation des animaux d'élevage. Le traitement secondaire consiste en une aération de 22 jours d'un lisier préalablement centrifugé; puis, dilué 30 fois, celui-ci sert à la culture deScenedesmus sp., dans les conditions naturelles. Nos résultats démontrent la faisabilité d'un tel procédé, qui pose cependant quelques problèmes. L'aération désodorise le lisier, et réduit la concentration d'ammoniaque de 97% en dix jours. La culture d'algues mène à un enlèvement satisfaisant des ions NH₄ ⁺, mais les biomasses produites restent faibles (220 mg poids sec/1). L'étude démontre qu'il est indispensable d'améliorer le système de diffusion de l'oxygène, afin de réduire le temps de rétention du traitement secondaire à environ une semaine et éviter le développement des bactéries dénitrifiantes.

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Biological treatment of pig manure by production of unicellular algal biomass

Summary This study proposes a biological treatment of pig manure by means of aerobic bacteria (secondary treatment) and freshwater microalgae (tertiary treatment). Degradation of the organic matter of the waste regenerates nutritive elements required for algal growth. The algal biomass, of high protein content, could be used for animal feed. The secondary treatment consists of a 22-day aeration of a centrifuged plg manure. This liquid is then diluted and submitted to cultures ofScenedesmus sp. under natural conditions. Our results show the practicability of the designed sequence of operations and indicate some problems. Besides deodorizing the manure, the aerobic fermentation decreased ammonium (NH₄ ⁺) concentrations by 97% within 10 days. The algal culture was satisfactory regarding NH₄ ⁺ uptake, but biomass production was relatively low, at 220 mg dry weight/1. The reactor (secondary treatment) could be improved with a better aeration device, to reduce retention time to about one week and avoid the appearance of denitrifying bacteria.

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Tratamiento biologico de estiercol de marranos mediante la producción de biomasa de algas unicelulares

Resumen Este estudio propone un tratamiento para los desechos de pocilgas mediante bacterias aerobias (tratamiento secundario) y algas de aguas dulces (tratamiento terciario). La degradación de la materia organica procedente de estos desechos regenera los elementos nutritivos necesarios para el crecimiento de las algas. La biomasa producida por las algas, de elevado contenido proteico, puede utilizarse para la alimentación animal. El tratamiento secundario consiste en la aeración durante 22 dias de residuos de pocilgas centrifugados. El líquido resultante es entonces diluido y tratado con cultivos deScenedesmus sp. en condiciones naturales. Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de realizar las operaciones antes indicadas y esbozan algunos problemas. Aparte de desodorizar el estiércol la fermentación aerobia disminuye en diez días las concentraciones de amoniaco (NH₄ ⁺) hasta en un 97%. El cultivo de algas fue satisfactorio en relación a la absorción de NH₄ ⁺ pero la producción de biomasa fue relativamente baja consiguiendose tan solo 220 mg peso seco/ litro. El reactor, donde tiene lugar el tratamiento secundario podria mejorarse mediante un nuevo mecanismo de aeración que redujera el tiempo de retención a una semana, se evitaria con ello la aparición de bacterias desnitrificantes.

     

Addendum: Recovery of cellulases from spent broth of sugar beet pulp fermentation byTrichoderma reesei

Summary The exo- and endo-glucanases ofTrichoderma reesei were recovered after growth on sugar beet pulp by vacuum concentration followed by (NH₄)₂SO₄ or acetone precipitation. Final respective recoveries were 53% and 57% for the exoglucanase and 41% and 42% for the endoglucanase. The resuspended acetone precipitates of both enzymes showed no loss of activity after 30 d at 4°C, pH 4.8 and in the presence of 0.5% sorbic acid. (NH₄)₂SO₄-precipitated exoglucanase lost activity in the same period.

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Resumen Las exo y endoglucanasas deTrichoderma reesei se recuperaron después de su crecimiento en pulpa de remolacha azucarera mediante concentración al vacío seguida de precipitación con (NH₄)₂SO₄ o acetona. La recuperación final fue de 53% y 57% para la exoglucanasa y de 41% y 42% para la endoglucanasa. La resuspensión de los precipitados cetónicos de ambos enzimas no mostró perdidas de actividad después de 30 d a 4°C y pH 4.8 en presencia de ácido sórbico. La exoglucanasa precipitada con (NH₄)₂SO₄ perdió actividad durante este mismo periodo.

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Résumé Les exo- et endoglucanases deTrichoderma reesei ont été récupérées après croissance sur pulpe de betterave sucrière, par concentration sous vide après précipitation par le sulfate ammonique ou l'acétone. Les récupérations ont été respectivement de 53% et 57% pour l'exoglucanase et de 41% et 42% pour l'endoglucanase. Les resuspensions des deux enzymes après précipitation à l'acétone n'ont révélé aucune perte d'activité après 30 jours à 4°C, pH 4.8 et en présence de 0.5% d'acide sorbique. L'exoglucanase précipitée au sulfate ammonique avait perdu toute activité dans le même laps de temps.

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(Based on a paper presented at the First Latin American Congress on Biotechnology, Tucumán, Argentina, October 4–8, 1987)     

Effect of moisture and salt stress on selectedRhizobium phaseoli strains

Summary Studies in Rossmoyne silt loam by the plate count (PC) and fluorescent antibody (FA) techniques showed that flooding had no detrimental effects on survival and N₂-fixing capacity ofR. phaseoli strains. Short-term flooding apparently stimulated the activity of the bacteria, as indicated by the increase in nodulation and yield ofPhaseolus vulgaris. The strains also differed in their ability to survive desiccation, and a decline in the population of all strains occurred at moisture tensions greater than 15 bars. The inhibitory concentrations of salts to growth ofR. phaseoli in solution were 0.3% for Na and K chlorides and 1.0% for Ca and Mg chlorides. The effects of Na and K sulphates were similar to the Na and K chlorides at 0.3% except for strain C-05 which was inhibited by 0.1% Na sulphate. Comparative growth averaged over all strains grown with 0.1% salts showed that the degree of inhibition was the same for both chloride and sulphate salts but that Na salts showed the greatest, and Mg salts the least, inhibition. It was concluded that some strains ofR. phaseoli can survive soil flooding, desiccation, and salt stress in large enough numbers to initiate nodule formation in some soils.

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Resumen Estudios realizados en Rossmoyne, en suelos de tipo limoso, ricos en materia orgánica han mostrado mediante técnicas de conteo en placa (PC) y de anticuerpos fluorescentes (FA) que la inundación de campos no iba en detrimento de la supervivencia y de la capacidad de fijación de N₂ de algunas cepas deR. phaseoli. La actividad de las bacterias parece verse estimulada por inundaciones de corta duración según se deduce del incremento en la nodulación y en la cosecha dePhaseolus vulgaris. Las distintas cepas mostraron diferencias en su habilidad para sobrevivir a la sequía, observándose una disminución en la población de todas las cepas a tensiones superiores a 15 bars. Las sales en disolución inhibieron el crecimiento deR. phaseoli a las concentraciones siguientes: 0.3% para los cloruros de Na y K, y 0.1% para los cloruros de Ca y Mg. Los efectos de los sulfatos de Na y K a una concentración de 0.3% fueron similares a los observados para los cloruros, excepto para el caso de la cepa C-05 que fue inhibida por 0.1% de sulfato de Na. El crecimiento medio, comparativo, de todas las cepas en un medio con un 0.1% de sales mostró que cloruros y sulfatos tenían un mismo grado de inhibición y que las sales de Na tenían el mayor efecto inhibidor, teniendo las de Mg el menor.

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Résumé Des études effectuées sur la terre limoneuse de Rossmoyne par les techniques de numération sur gélose (PC) et d'anticorps fluorescents (FA) ont montré que l'inondation n'a pas d'effet défavorable sur la survie et la capacité à fixer l'azote de certaines souches deR. phaseoli. Une brève inondation du sol parait stimuler l'activité des bactéries, comme l'indique le fait que la nodulation et le rendement dePhaseolus vulgaris sont accrus. L'aptitude des souches à survivre à la dessication est variable. D'autre part, les populations de toutes les souches diminuent lorsque la tension d'humidité dépasse 15 bars. Les concentrations salines inhibant la croissance deR. phaseoli en milieu liquide sont de 0,3% pour le chlorure de Na et de K, et de 0,1% pour le chlorure de Ca et de Mg. Les sulfates de Na et de K sont, comme les chlorures, inhibiteurs à la concentration de 0,3%, sauf dans le cas de la souche C-05 qui est inhibée par 0,1% de sulfate de Na. A la concentration de 0,1%, les chlorures et les sulfates exercent le même degré d'inhibition sur toutes les souches, mais les sels de Na sont plus inhibiteurs que ceux de Mg. En conclusion, certaines souches deR. phaseoli peuvent survivre à l'inondation, à la dessication et à l'action des sels en nombres suffisants pour initier la formation de nodules.

     

Fruiting ofLentinus edodes (Shiitake) in liquid media

Summary Eight dikaryotic stocks ofLentinus edodes (Berk.) Sing. were studied in respect to fruiting in several different formulations of chemically-defined liquid media. On the two media which included the same four solutions (minerals, trace elements, vitamins and salicylic acid) the stocks differed only slightly in growth but were markedly different in primordia and fruitingbody formation. Stocks also showed variation in respect to fruiting, following incubation in media from which one of the solutions was omitted, and it was suggested that this was a consequence of differences in genes controlling fruiting. Inorganic substances (glass wool, vermiculite and perlite) served satisfactorily in supporting fruiting bodies in liquid media. Light was essential for borwn-pigment formation of the mycelial coat and for fruiting-body maturation but was not required for formation of primordia.

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Resumen Se estudío la fructificación de ocho cepas dikaríoticas de Lentinus edodes en varias fórmulas químicas diferentes de medio líquido definido. En dos medios que contenían las mismas cuatro soluciones (mineral, elementos trazas, vitaminas y ácidos salicílico) las diferencias en crecimiento entre las cepas eran apenas perceptibles pero eran marcadamente diferentes en relación a la formación del primordio y del cuerpo fructífero. Las cepas también mostraban variación en la fructificatión cuando se incubaban en un medio al cual una de las soluciones se le omitía, sugiriéndose ésto como una consecuencia de diferencias en los genes controlando la fructificación. Sustancias inorgánicas (lana de vidrio, vermiculita y perlita) fueron usadas satisfactoriamente como soporte de los cuerpos fructíferos en medio líquido. La luz era esencial para la formación del pigmento marrón de la capa micelial y para la maduración del cuerpo fructífero, pero no era requerida para la formación de primordio. Received 1 November 1986; accepted 29 December 1986

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Résumé Huit souches dicaryotes deLentinus edodes (Berk.) ont été étudiées en ce qui concerne la fruitification dans différentes formulations de milieux liquides chimiquement définis. Sur les deux milieux contentant les quatre mêmes solutions (composés minéraux, oligo-éléments, vitamines et acide salicylique), les souches différent peu en ce qui concerne la croissance, mais par contre foretement en ce qui concerne la formation de primordia et de fructifications. La fructification des souches varie aussi lorsque l'incubation est effectuée dans des milieux où l'une gènes contrôlant la frucitification. Certaines substances minérales (laine de verre, vermiculite et perlite) soutiennent efficacement les fructifications en mlieu liquide. La lumière est nécessaire à la pigmentation brune du mycélium et à la maturation des fructifications, mais n'influe pas sur la production de primordia.

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Visiting Professor in the Department of Biology, CUHK, from the State University of New York at Buffalo, USA.     

Cassava starch fermentation pattern ofRhizopus oligosporus

Summary Rhizopus oligosporus UQM 145F was grown on cassava starch medium without a preliminary treatment of starch. The fermentation pattern ofR. oligosporus is shown to be influenced significantly by the medium composition, pH of the growth culture and the size of the spore inoculum. By varying the carbon, nitrogen and mineral salt concentrations, it was found that either glucose accumulated due to excess hydrolysis of starch or single cell protein production became dominant. In the case of the carbon source, increases in the concentration of starch led to higher biomass values, but lower rates of protein production. These observations led to a new formulated medium, resulting in an 82.9% cassava starch utilization and a true protein yield of 5.32 g/100 g initial substrate. The response ofR. oligosporus to inorganic compounds such as (NH₄)₂SO₄, urea, NaCl and MgSO₄ indicates an interesting fermentation control system.

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Resumen Rhizopus oligosporus UQM 145F se hizo crecer en un medio a base de almidón de casava sin que hubiera pasado por un tratamiento previo con almidón. Se demostró que el patrón de fermentación seguido porRh.oligosporus estaba significativamente influenciado por: la composición del medio, su pH y el tamaño del inóculo. Al variar las concentraciones de carbono, nitrógeno y sales minerales se observó que predominaba la acumulación de glucosa o bien la producción de proteínas unicelulares. Un incremento en la fuente de carbono aumentó la biomasa pero disminuyó el ritmo de producción de proteínas. Estas observaciones permitieron elaborar un nuevo medio de cultivo que resultó en la utilización del 82.9% del almidón de casava con un rendimiento en proteínas de 5.32 g/100 g de sustrato inicial. La respuesta deRh. oligosporus a compuestos inorgánicos como sulfato amónico, urea, cloruro sódico y sulfato magnésico indican la existencia de un sistema de control de la fermentación muy interesante.

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Résumé On a fait croîtreRhizopus oligosporus UQM 145 F sur un milieu à base d'amidon de manioc sans traitement préalable de l'amidon. Le profil de fermentation parR. oligosporus apparaît être influencé de manière significative par la composition du milieu, le pH de la culture en croissance et la taille de l'inoculum de spores. En variant les concentrations en carbone, en azote et en sels minéraux, on remarque la prédominance tantôt de la protéine unicellulaire, tantôt de l'accumulation de glucose. Un accroissement en concentration conduit à des valeurs plus élevées de la biomasse mais en une moindre production de protéines. Ces observations ont abouti à une nouvelle formulation du milieu avec pour résultat une utilisation à 82.9% de l'amidon de manioc et un rendement vrai en protéines de 5.32 g/100 g de substrat initial. La réponse deR. oligosporus aux composés inorganiques comme le sulfate d'ammonium, l'uréi, le chlorure de sodium et le sulfate de magnésium sont indicateurs d'un système très intéressant de contrôle de la fermentation.

     

Effect ofRhizobium inoculation and the application of phosphate on the growth,yield and nitrogen fixation of soybeans

Summary Application of phosphate at 60, 90 and 120 kg P ha^–1 to the Bragg variety of soybeans inoculated with a mixture of three strains ofRhizobium japonicum (TAL 102 + TAL 377 + TAL 379) and grown in silty loam soil in a pot experiments, significantly improved the number of nodules per plant and increased production of shoots and roots by 65, 36 and 17%, the yield of pods by 38, 12 and 3% and N₂-fixing capacity by 57, 29 and 20%, respectively. Rhizobium inoculation alone with the test strains caused a positive but poor nodulation of the crop and increased its dry-matter production of shoots and roots by 22%, pods yield by 7% and N₂-fixing capacity by 6%. Soybean plants from uninoculated treatments were without nodules indicating that indigenous rhizobia associated with this crop are absent in the test soil. Phosphate concentration in the total dry matter of mature crop exhibited an increasing tendency as a result of all the applied levels of phosphorus.

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Resumen La adición de fosfato (60, 90, y 120Kg P ha^–1) a plantas de soja de la variedad Bragg inoculadas con una mezcla de tres cepas deRhizobium japonicum (TAL 102 + TAL 377 + TAL 379) cultivada en contenedores en un suelo arcillo-limoso, mejoró significativamente el número de nódulos por planta, aumentó la producción de tallos y raíces en un 65, 36 y 17%, el rendimiento de la cosecha en un 38, 12 y 3%, y la capacidad fijadora de N₂ en un 57, 29 y 20% respectivamente. La sola inoculación con las cepas deRhizobium ya mencionadas produjo una nodulación positiva aunque pobre del cultivo, incremetando la producción de tallos y raíces en un 22%, el rendimiento de la cosecha en un 7% y la capacidad fijadora de nitrógeno en un 6%. Las plantas de soja de los tratamientos no inoculados no tenían nódulos lo que indica que no habían rizobios específicos para esta planta en el suelo ensayado. La concentración de fosfato en la materia seca de las plantas maduras mostraba una tendencia a incrementarse como resultado de la aplicación de los distintos niveles de fosfato.

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Résumé L'application du phosphate à raison de 60, 90 et 120 kg en phosphore par hectare à la variété Bragg de soja inoculée avec un mélange de 3 souches deRhizobium japonicum (TAL 102, TAL 377 et TAL 379) et cultivée sur un sol gras limoneux dans des expériences en jarre de croissance, a augmenté de manière significative le nombre de nodules par plant et a augmenté la production des pousses et racines respectivement de 65, 36 et 17%, le rendement des cosses respectivement de 38, 12 et 3% ainsi que la capacité de fixer l'azote, respectivement de 57, 29 et 20%. L'inoculation seule avec les souches testées de Rhizobium a causé une nodulation positive mais faible de la plante, et a augmenté la production en matière sèche des racines et pousses de 22%, le rendement en cosses de 7% et la capacité de fixer l'azote de 6%. Les plants de soja dans les expériences sans inoculation ne présentaient pas de nodules, indiquant par là que les rhizobia endogènes associés avec cette plante étaient absents dans le sol expérimental. La concentation en phosphate dans la matière sèche totale de la plante mûre a marqué une tendance à l'augmentation comme suite aux applications du phosphore à tous les niveaux.

     

Cellulolytic activities ofTrichoderma hamatum grown on different carbon substrates

Summary The exoglucanase, endoglucanase and -glucosidase produced byTrichderma hamatum cultured on four different carbon sources, cellulose, cellobiose, carboxymethylcellulose (CMC) and starch, were monitored. Cellulose gave the best overall mycelial growth and highest endoglucanase activity. Exoglucanase activity was best on CMC and -glucosidase greatest on starch. The data suggest that a carbon source suitable for mycelial growth may not be suitable for cellulolytic activities, and that cellulose may not be the best substrate for the development of activity of the three enzyme components of cellulase of a particular fungus.

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Resumen Se estudió la producción de exoglucanasa, endoglucanasa y -glucosidase porTrichoderma hamatum en medios con cuatro fuentes distintas de carbono: celulosa, celobiosa, carboximetilcelulosa (CMC) y almidón. En celulosa se dió el mejor crecimiento de micelio y la mayor actividad endoglucanásica. La actividad exoglucanásica fue mejor en CMC y la -glucosidásica en almidón. Los datos obtenidos sugieren que una fuente de carbono adecuada para el crecimiento de micelio puede no serlo para las actividades celulolíticas y que la celulosa puede no ser el mejor sustrato para el desarrollo de las actividades de los tres enzimas componentes de la celulasa de un determinado hongo.

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Résumé Les exo-glucanase, endo-glucanase et -glucosidase produites patTrichoderma hamatum cultivé sur diverses sources de carbone (cellulose, cellobiose, carboxyméthyl-cellulose (CMC) et amidon) ont été étudiées. La cellulose procure la meilleure croissance mycélienne et l'activité endo-glucanase la plus élevée. L'activité exo-glucanase est plus élevée sur CMC et l'activité -glucosidase sur amidon. Ces résultats montrent qu'une source de carbone convenant à la croissance mycélienne peut ne pas convenir aux activités cellulolytiques et que la cellulose peut ne pas être le meilleur substat pour l'activité des trois enzymes composantes de la cellulase produite par un champignon donné.

     

Purification and some properties of a thermostable protease ofThermoactinomyces thalpophilus

Summary A thermostable protease fromThermoactinomyces thalpophilus was purified to give a single protein band on disc PAGE with a molecular size of 55000 Da. Optimal proteolytic activity of the purified protease was at pH 6.0 and 70°C. The enzyme was maximally stable between pH 5.0 and 8.0 and retained 62% of its original activity at 70°C after 30 min. Temperature stability was not improved in the presence of Ca²⁺ (1mm). Enzyme activity was inhibited by AG⁺, Hg²⁺, Ba²⁺ and Co²⁺, partially inhibited byo-phenanthroline but not by diisopropylfluorophosphate (5mm).

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Resumen Se purificó una proteína termoestable deThermoactinomyces thalpophilus que dió una sola banda proteica al someterla a una electroforesis en columna de poliacrilamida (PAGE) y un tamaño molecular de 55.000 Da. La actividad proteolítica de la proteína purificada era óptima a pH 6.0 y 70°C. El enzima tenía máxima estabilidad entre pH 5.0 y 8.0 y retuvo un 62% de su actividad original despues de 30 min at 70°C. La estabilidad térmica no mejoró en presencia de Ca²⁺ (1mm). La actividad enzimática fue Inhibida por Ag⁺

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Résumé Une protéase thermostable deThermoactinomyces thalpophilus a été purifiée jusqu'à donner une bande protéique unique sur un disque PAGE avec un poids moléculaire de 55000 daltons. L'activé protéolytique optimum de la protéase purifiée se situe à pH 6.0 at à 70°C. L'enzyme présente son maximum de stabilité entre pH 5.0 et 8.0 et conserve 62% de son activité originelle après 30 min à 70°C. La stabilité à la température n'est pas améliorée en présence de Ca²⁺ 1mm. L'activité enzymatique est inhibée par Ag⁺, Hg²⁺, Ba²⁺ et Co²⁺. Elle est partiellement inhibée par l'o-phénanthroline mais elle n'est pas inhibée par le di-iso-propylfluorophosphate 5mm.

     

Effects of cotyledons and nitrate on the nitrogen assimilation ofPhaseolus vulgaris

Summary In an experiment performed under greenhouse conditions usingPhaseolus vulgaris cv. Carioca inoculated withRhizobium strain CO5, effects of cotyledons and mineral nitrogen on the initial process of nitrogen assimilation were evaluated. Plants were maintained intact or had either both or half of both cotyledons removed six days after planting. Levels of mineral nitrogen corresponded to the addition of 0 or 1.5 mg N/plant/day three days before each of the four harvests (8, 10, 12 and 14 days after planting). Cotyledon removal generally decreased nodule number and dry weight and total nitrogenase activity, although there was no effect on specific nodule efficiency, but the nitrate reductase activity was increased in both shoots and roots. Mineral nitrogen decreased nodulation and nitrogenase activity when applied 9 and 11 days after planting, but increased shoot and root nitrate reductase activity and total nitrogen incorporation, indicating that plants could be nitrogen limited during the initial period of growth.

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Resumen En un experimento realizado en invernadero conPhaseolus vulgaris, cv. Carioca, inoculado conRhizobium (cepa CO5) fue evaluado los efectos de los cotiledones y del nitrógeno mineral en el proceso inicial de la assimilación de N. Las plantas fueron mantenidas intactas o con la mitad o todos los cotiledones retirados a los 6 dias despues de la siembra (DDS). El N mineral fue aplicado en la dosis de 0 ó 1.5 mg N/planta/dia, 3 dias antes de cada una de los 4 casechas realizadas (8, 10, 12 y 14 DDS). La retirada de los cotiledones generalmente disminuyó el número y el peso seco de los nódulos y la actividad de la nitrogenase, mas não hubo influencia en la eficiencia específica de los nódulos. La actividad de la nitrato reductasa aumentó tanto en la parte aérea como en las raíces. El nitrógeno mineral disminuyó la nodulación y la actividad de la nitrogenasa cuando la aplicación ocurrió a los 9 y 11 DDS, mas aumentó la actividad de la nitrato reductasa de las raíces y de la parte aérea, asi como el contenido de N en la planta, indicando que estas podrian estar limitadas por nitrógeno en la fase inicial de crescimento.

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Résumé Dans une expérimentation réalisée dans les conditions de serre au moyen dePhaseolus vulgaris cv Carioca inoculée avec la souche CO5 deRhizobium, on a évalué les effets de cotylédons et de l'azote minéral sur le processus initial de l'assimilation azotée. Les plants ont été soit maintenus intacts soit amputés des deux ou de la moitié des deux cotylédons, 6 jours après la plantation. Les teneurs en azote minéral correspondaient à l'ajout de 0 ou 1.5 mg d'azote par plant et par jour, trois jours avant chacune des 4 récoltes (8, 10, 12 et 14 jours après la plantation). L'amputation de cotyledon diminue d'une manière générale le nombre de nodules, le poids sec et l'activité totale de nitrogénase, bien qu'il n'y ait aucun effet sur l'efficience spécifique de nodule mais l'activité de nitrate réductase était augmentée tant dans les pousses que dans les racines. L'azote minéral a déterminé la nodulation et l'activité de nitrogénase lorsque l'application avait lieu les 9ème et 11ème jours après la plantation, mais elle a augmenté l'activité de nitrate réductase chez les pousses et les racines ainsi que l'incorporation totale d'azote, indiquant par là que la plante pouvait être limitée en azote durant la période initiale de croissance.

     

A general view of domestic digesters' development in China

Summary By 1980 there were 7 million domestic digesters in China. Presently 5 million digesters are in use with a mean volume of 6 to 10 m³ each. The reasons for this reduction are (1) poor construction in the early years because of lack of technical research and experiments, (2) mistakes in statistics, and (3) natural degradation. But China has kept on paying attention to the development of domestic digesters and about 0.5 million units have been built every year since 1980. Moreover, as living conditions improve in rural areas and daily maintenance of domestic digesters is not convenient, domestic digesters are being less and less considered. People prefer the use of biogas supply stations that insure a constant gas supply. In these cases, the investment is co-financed by the local government and the households. The investment is recovered in 5 to 10 years by selling the gas and the fertilizer.

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Resumen En 1980 habían en China 7 millones de digestores domésticos Actualmente tan solo estan en funcionamiento 5 millones, con un volumen medio de 6–10 m³ cada uno. Las razones para esta disminución pueden ser: (1) mala construcción en los primeros años debido a faltas en la investigación técnica o en la experimentación, (2) errores en las estadísticas o (3) degradación natural. A pesar de ello China ha seguido prestando atención al desarrollo de digestores domèsticos y cerca de 0.5 millones de unidades se construyen anualmente desde 1980. Hay que considerar además que las condiciones de vida en las zonas rurales han experimentado una mejora substancial y el mantenimiento diario de los digestores domésticos no se ve favorecido, por lo cual estos van perdiendo en popularidad. Los habitantes de estas zonas rurales prefieren la utilización de centrales de biogas que aseguran un suministro continuado de gas. En este caso la inversion se cofinancia entre el gobierno local y los futuros usuarios. El coste de la inversión se recupera en 5–10 años mediante la venta del gas y del fertilizante producidos.

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Résumé En 1980, il y avait 7 millions de digesteurs domestiques en Chine. Actuellement 5 millions de digesteurs sont opérationnels, avec un volume moyen de 6 à 10 m³. Les raisons de cette diminution sont soit (1) une mauvaise construction dans les premières années à cause du manque de recherche technique et d'expérience, soit (2) des erreurs dans les statistiques ou (3) la dégradation naturelle. Mais la Chine a continué à accorder de l'attention au développement des digesteurs domestiques et 0.5 million d'unités ont été construites chaque année depuis 1980. Cependant l'amélioration des conditions de vie en milieu rural et la charge que représente la gestion journalière d'un digesteur domestique font que ces derniers sont de moins en moins mis en oeuvre. On leur préfère les stations de distribution qui assurent un approvisionnement constant. Dans ce cas l'investissement est co-financé par l'administration locale et les ménages. Il est recouvert en 5 à 10 ans par la vente du gaz et de l'effluent en tant que fertilisant.

     

A comparative study by electron microscopy of the structures of effective and ineffective nodules ofTrifolium subterraneum induced byRhizobium trifolii andRhizobium leguminosarum

Summary Bacteroid formation and haemoglobin pigment were observed 3 days after the appearance of nodules formed by the effectiveRhizobium trifolii strain TA1 onTrifolium subterraneum. Effective nodules were large and cylindrical and evidence of bacteroid degeneration did not appear until about 21 days. Electron microscopy of ineffective nodules formed byRhizobium trifolii strain 6 showed limited meristematic activity and vascular development, and infection threads were sparse. Degeneration of plant cells and bacteria was visible by 3 days and mostly complete by 14 days. Both types of nodules occurred randomly over the root system. In contrast, the ineffective nodules formed byRhizobium leguminosarum strains onTrifolium subterraneum, occurred mainly at lateral root junctions with vascular connections to either the primary or lateral root depending on strain. Infection thread development was widespread and most cells were invaded. The released bacteria became pleomorphic and rounded, the nodules became cylindrical, enlarged slightly but remained white. Degeneration was apparent at 5 days and complete by 14 days in nodules formed by strain 1020A, but nodules formed by strain 1013 degenerated more slowly and degenerate cells sometimes showed secondary invasion by vegetative rhizobia.

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Estudio comparativo mediante microscopia electronica de las estructuras de nodulos eficaces e ineficaces de Trifolium subterraneum inducidos por Rhizobium trifolii y Rhizobium leguminosarum

Resumen Se observó la formación de bacteroides y de (leg)hemoglobina tres días después de laapparación de nódulos formados por la cepaeficaz TA1 deRhizobium trifolii enTrifolium subterraneum. Los nódulos eficaces eran grandes y cilíndricos. No hubo evidencia de degeneración de bacteroides hasta pasados 21 dias. El estudió al microscopio electrónico de nódulos no eficaces formados por la cepa 6 deR. trifolii mostro una actividad meristemática reducida al igual que el desarrollo vascular, siendo escasas la lineas de infección. La degeneración de las células de la planta y de las bacterias era observable a los 3 días y practicamente completa a los 14. Los nódulos formados por ambas cepas se distribuyen al azar en todo el sistema radicular, en cambio, los nódulos ineficaces formados enT. subterraneum porR. leguminosarum se encuentran principalmente en conexiones vasculares laterales con raíces primarias o secundarias, dependiendo de la cepa. La línea de infección en este caso está ampliamente desarrollada y la mayoría de las células estan invadidas. Las bacterias que han sido liberadas se vuelven esféricas y pleomórficas, los nódulos se vuelven cilíndricos y aumentan ligeramente de tamaño pero permanecen blancos. La degeneración de los nódulos formados por la cepa 1020A era aparente a los 5 días y completa a los 14. Sin embargo, los nódulos formados por la cepa 1013 degeneraron más lentamente y las células degeneradas mostraron una invasión secundaria porRhizobium vegetativos.

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Etude comparative en microscopie électronique de la structure des nodules efficaces et inefficaces de Trifolium subterraneum induits par Rhizobium trifolii et Rhizobium leguminosarum

Résumé La formation de bactéroides et la production de leg-hémoglobine ont été observées 3 jours après l'apparition des nodules formés surTrifolium subterraneum par la souche efficace TA1 deRhizobium trifolii. Les nodules efficaces sont larges et cylindriques, et les signes de la dégénérescence en bactéroides n'apparaissent pas avant 21 jours. La microscopie électronique des nodules inefficaces formés par la souche 6 deR. trifolii montre une activité méristématique et un développement vasculaire faibles, et les filaments d'infection sont rares. La dégénérescence des cellules végétales et des bactéries est visible au bout de 3 jours et presque complète en 14 jours. Les deux types de nodules sont répartis au hasard sur le système racinaire. Par contre, les nodules inefficaces formés par les souches deR. leguminosarum surT. subterraneum sont répartis préférentiellement sur les jonctions racinaires latérales, les connections vasculaires étant, suivant la souche, dirigées vers la racine primaire ou vers la racine latérale. Le développement des filaments d'infection est très répandu et la plupart des cellulessont envahies. Les bactéries relâchées deviennent pléomorphes et arrondies; les nodules deviennent cylindriques et légèrement renflés, mais restent incolores La dégénérescence est apparente après 5 jours et complète en 14 jours dans les nodules formés par la souche 1020A, mais ceux formés par la souche 1013 dégénèrent plus lentement et les cellules dégénérées présentent parfois une invasion secondaire par des rhizobiums végétatifs.