酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端(36～45)CP~(m~1)IpψpGpGpGpApGpApG十核苷九磷酸片段的合成

本文报道利用T_4 RNA连接酶酶促合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′端(36～45)Cp~(m~1)Ip-ψpGpGpGpApGpApG十核苷九磷酸片段的工作。合成制备时,我们采用将Cp~(m~1)IpψpG、GpG、ApGpApGp三片段从5′向3′延伸的合成路线。在合成路线的探索中我们发现了一些新现象:1.在T_4 RNA连接酶催化反应中Cp~(m~1)Ipψ作为受体有局限性。2.GpG等二核苷一磷酸可以与pCp等供体分子连接。3.60℃预温育对GpG片段的标记和六核苷酸、十核苷酸连接反应提高产率有明显的作用。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸分子中一个十三核苷酸片段(顺序23～35)CpGpCpm_2~2GpCpUpCpCpCpUpUpIpGp的合成

以CpGpCpm_2~2G、CpUpCpC、CpUpUpI和Gp为原料,采用T_4RNA ligase催化连接的方法,通过用3′-端带有起保护怍用的磷酸单酯的寡核苷酸作供体(途径A)以及除最后一步外各步都用3′-端是自由OH基的寡核苷酸作供体(途径B)的两种途径,都合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸分子中一个十三核苷酸片段(顺序23～35)CpGpCpm_2~2GpCpUpCpCpCpUpUpIpGp。产率较高。产物的连接点、末端和序列都经过严格鉴定。研究表明,位于受体分子3′-端的稀有嘌呤核苷m_2~2G对T_4RNA ligase催化的连接反应没有不利影响,并再次证实,在用3′-端是自由OH基的寡核苷酸作供体进行T_4RNA ligase催化的连接反应时,为了得到高的产率,避免或降低同时产生供体分子的自聚和环化,并不一定需要受体分子大大过量。用本法合成的CpGpCpm_2~2GpCpUpCpCpCpUpUpIpGp已用于酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-端半分子和全分子的合成中。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-端GpGpGpCpGPUpGpUp~(m~1)GpGpCpGpU十三核苷十二磷酸片段(1～13)的合成

本文介绍用T_4 RNA连接酶酶促合成方法合成酵母丙氨酸转移核糖核酸5′端十三核苷十二磷酸片段(1～13)GpGpGpCpGpUpGpUp~(m~1)GpGpCpGpU的工作。我们将这一片段分为二段来合成,先合成5′-端6Nt和3′-端7Nt(A合成路线)或5′端7Nt和3′-端6Nt(B合成路线),再将它们连接起来。并对由于片段含鸟便嘌呤核苷酸较多而在合成和分离上出现的一些特性进行了探讨。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸5'-半分子顺序14～22九核苷酸的合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸5'-半分子中二氢尿嘧啶环区的九核苷酸AGDCGGDAG的合成工作。合成的方案是采用先合成AGD、CGG和DAG三个三核苷二磷酸片段,然后再以AGD pCGGDAG(3 p6)或AGDCGG pDAG(6 p3)两种方式用T_4 RNA连接酶连接成为所需要的九核苷酸。CGG和DAG是采用磷酸二酯法进行化学合成,AGD是用AG>P同D借核糖核酸酶N_1酶促合成。这个路线的优点是三个三核苷二磷酸片段易于大量合成制备,无论是3 p6或6 p3两条路线的中间产物AGDOGG(产率61%)和CGGDAG(产率64%)和最终的九核苷酸产物都能得到好的连接产率和分离纯度。3 p6和6 p3两条路线所得的九核苷酸的连接产率分别为52%和82%。合成的产物均经过毗邻分析,5'末端~(32)P标记后的电泳-同系层折双向纯度鉴定或凝胶电泳以及核苷酸顺序分析证明了合成产物的均一性和结构的正确性。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸5’-半分子顺序14～22九核苷酸的合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子中二氢尿嘧啶环区的九核苷酸AGDCGGGDAG的合成工作。合成的方案是采用先合成AGD、CGG和DAG三个三核苷二磷酸片段,然后再以AGD pCGGDAG(3 p6)或AGDCGG pDAG(6 p3)两种方式用T_4RNA连接酶连接成为所需要的九核苷酸。CGG和DAG是采用磷酸二酯法进行化学合成,AGD是用AG>P同D借核糖核酸酶N_1酶促合成。这个路线的优点是三个三核苷二磷酸片段易于大量合成制备,无论是3 p6或6 p3两条路线的中间产物AGDCGG(产率61%)和CGGDAG(产率64%)和最终的九核苷酸产物都能得到好的连接产率和分离纯度。3 p6和6 p3两条路线所得的九核苷酸的连接产率分别为52%和82%。合成的产物均经过毗邻分析,5′末端~(32)P标记后的电泳-同系层析双向纯度鉴定或凝胶电泳以及核苷酸顺序分析证明了合成产物的均一性和结构的正确性。     

5′-和3′-末端带双羟基的寡聚核糖核苷酸具有不寻常的聚丙烯酰胺凝胶电泳行为

为了制备核糖核酸酶P的底物——人工合成的tRNA前体,我们用五核苷四磷酸_(HO)U_PC_PC_PA~*_PC_(OH)(~*P代表~(32)P)与天然的酵母丙氨酸tRNA或其5′半分子在T_4RNA连接酶催化下反应,连接产率甚低。但观察到一个很奇特的现象:不管何种反应条件,甚至不加tRNA和不加酶的对照实验中,经聚丙烯酰胺凝胶(PAG)电泳分析反应产物时发现,在约相当于RNA序列分析“梯子”18核苷酸(nt)处总     

多核苷酸合成的研究——Ⅰ.酶促合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端接受茎区八核苷七磷酸CpUpCpGpUpCpCpA

本文报道了用RNase N_1(核糖核酸酶、鸟嘌呤核苷酸-2’-移换酶,Neurospora Crassa,E.C.2.7.7.26)连接CpUpCpG>p与UpCpCpA合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3’-端接受茎区八核苷七磷酸GpUpCpGpupCpCpA。反应条件包括:供体(CpUpCpG>p),0.07～0.09M;受体(UpCpCpA)浓度为供体浓度的三至七倍;RNase N_1,每毫升250单位;pH7.5磷酸缓冲液,0.1M;0°±2℃反应48小时。在这一反应中,CpUpCpGpUpCpCpA的产率随着受体与供体的克分子比例的增大而升高,当这一比例超过6,产率超过30%。本方法一次可得到纯的CpUpCpGpUpCpCpA数毫克。关于从最终产物中除去RNase N_1的问题,我们发现在pH3.5条件下进行DEAESephadexA-25(Cl~-型)柱层析或用pH2.7条件下的纸电泳法均可得到较满意的效果。当把反应物在6M NH_4OH,0.04M DTP,37℃保温15分钟,或者在pH7.4 Tris-HCl缓冲液和0.04MDTP,0℃保温7小时以后,RNase N_1即完全失活。可是,一旦除去上述DTP等抑制条件以后,失活后的RNase N_1在空气中可以逐步恢复其大部分活力。在我们的实验中没有向反应物中加入0.1%的明胶蛋白,很可能底物本身对RNase N_1具有一定的保护作用。在合成CpUpCpGpUpCpCpA的同时,我们还用RNase N_1合成了GpC,GpΨ,GpU,GpUp,GpUpCpC及CpUpCpGpUpCpC等寡核苷酸,并且都得到了较好的产率。对RNase N_1酶促合成CpUpCpGpUpCpCpA反应中产生的几个付产物进行了分离纯化和初步鉴定。     

多核苷酸合成的研究——Ⅰ.酶促合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端接受茎区八核苷七磷酸CpUpCpGpUpCpCpA

本文报道了用RNase N_1(核糖核酸酶、鸟嘌呤核苷酸-2′-移换酶,Neurospora Crassa,E.C.2·7·7·26)连接CpUpCpG>p与UpCpCpA合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端接受茎区八核苷七磷酸CpUpCpGpUpCpCpA。反应条件包括:供体(CpUpCpG>p),0.07～0.09M;受体(UpCpCpA)浓度为供体浓度的三至七倍;RNase N_1,每毫升250单位;pH7.5磷酸缓冲液,0.1M;0°±2℃反应48小时。在这一反应中,CpUpCpGpUpCpCpA的产率随着受体与供体的克分子比例的增大而升高,当这一比例超过6,产率超过30%。本方法一次可得到纯的CpUpCpGpUpCpCpA数毫克。关于从最终产物中除去RNaseN_1的问题,我们发现在pH3.5条件下进行DEAMSephadexA-25(Cl~-型)柱层析或用pH2.7条件下的纸电泳法均可得到较满意的效果。当把反应物在6M NH_4OH,0.04M DTP,37℃保温15分钟,或者在pH7.4 Tris-HCl缓冲液和0.04M DTPJ 0℃保温7小时以后,RNase N_1即完全失活。可是,一旦除去上述DTP等抑制条件以后,失活后的RNase N_1在空气中可以逐步恢复其大部分活力。在我们的实验中没有向反应物中加入0.1%的明胶蛋白,很可能底物本身对RNase N_1具有一定的保护作用。在合成CpUpCpGpUpCpCpA的同时,我们还用RNase N_1合成了GpC,GpΨ,GpU,GpUp,GpUpCpC及CpUp(UpGpUpCpC等寡核苷酸,并且都得到了较好的产率。对RNase N_1酶促合成CpUpCpGpUpCpCpA反应中产生的几个付产物进行了分离纯化和初步鉴定。     

多核苷酸合成的研究——ⅩⅢ.酵母丙氨酸转移核糖核酸3′端半分子中Cpm~1IpψpG的酶促合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′端半分子反密码区的四核苷酸片段Cpm~1IpψpG的合成。先以Cpm~1Ipψ为引物,GDP为底物,在PNPase和RNase T_1两个酶的协同作用下,生成Cpm~1IpψpGp,对应用这两个酶进行合成的规律作了摸索与归纳,使合成Cpm~1IpψpGp的产率达到90%以上,它再经固定化碱性磷酸单酯酶脱磷得到Cpm~1IpψpG,脱磷率达到98%,此工作通过合成方法旁证了RNase T_1不水解m~Ip-N键。     

多核苷酸合成的研究 Ⅶ.RNA连接酶合成十六核苷酸 (CpUpCpGpUpCpCpApCpUpCpGpUpCpCpA)

~(32)pCUCGUCCA(作为供体),CUCGUCCA(作为受体),其比例为1∶50,在RNA连接酶催化下,进行连接反应,形成16核苷酸片段即CUCGUCCA~(32)pCUCGUCCA。反应后产物经Sephadex G-75柱分离,分离后得到的产物通过下列鉴定:抗碱性磷酸单酯酶;同系层析;毗邻分析等。证明是我们所希望的产物,其产率经过重复在50～70%之间。这种RNA连接酶对合成具有一定排列顺序的RNA片段,可以认为将是一种很好的工具酶。     

多核苷酸合成的研究——Ⅶ.RNA连接酶合成十六核苷酸(CpUpCpGpUpCpCpApCpUpCpGpUpCpCpA)

~(32)pCUCGUCCA(作为供体),CUCGUCCA(作为受体),其比例为1:50,在RNA连接酶催化下,进行连接反应,形成16核苷酸片段即CUCGUCCA~(22)pCUCGUCCA。反应后产物经Sephadex G-75柱分离,分离后得到的产物通过下列鉴定:抗碱性磷酸单酯酶;同系层析;毗邻分析等。证明是我们所希望的产物,其产率经过重复在50～70%之间。这种RNA连接酶对合成具有一定排列顺序的RNA片段,可以认为将是一种很好的工具酶。     

多核苷酸合成的研究 Ⅷ.用T_4RNA联结酶酶促合成 GpCpmIpΨpGpGp

本文报导了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子反密码区中GpCpm~1IppGpGp的酶促合成。作者发现,当以~(32)pGpGp(2′,3′)为供体,GpCpm~1Ip为受体,用T_4RNA 联结酶在一般条件下联结时(37℃,2小时),产率只有10%左右;但在10℃条件下,供体与受体比为1:5时,可以得到50～60%的较高产率。将~(32)pGpGp(2′,3′)与GpCpm~1lp用T_4RNA 联结酶在pH8.3,10℃下反应48小时后,再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析分离纯化,即可得到GpCpm~1Ip~(32)pGpGp(2′,3′)。产物经双向电泳层析图谱分析,抗单酯酶测定,毗邻分析,用牛胰核糖核酸酶水解然后5′端用~(32)p 标记,再经双向图谱和核苷酸组成比例等鉴定,证明产物的纯度和排列顺序符合预定要求。     

多核苷酸合成的研究 Ⅷ.用T_4RNA联结酶酶促合成GpCpm~1ⅠpφpGpGp

本文报导了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子反密码区中GpCpm~1IpψpGpGp的酶促合成。作者发现,当以~(32)pGpGp(2′,3′)为供体,GpCpm~1Ipψ为受体,用T_4RNA联结酶在一般条件下联结时(37℃,2小时),产率只有10%左右;但在10℃条件下,供体与受体比为1:5时,可以得到50～60%的较高产率。将~(32)pGpGp(2′,3′)与GpCpm~1Ipψ用T_4RNA联结酶在pH8.3,10℃下反应48小时后,再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析分离纯化,即可得到GpCpm~1Ipψ~(32)pGpGp(2′,3′)。产物经双向电泳层析图谱分析,抗单酯酶测定,毗邻分析,用牛胰核糖核酸酶水解然后5′端用~(32)p标记,再经双向图谱和核苷酸组成比例等鉴定,证明产物的纯度和排列顺序符合预定要求。     

免疫亲和层析法纯化T_4RNA连接酶

自1972年Silber等入首先从T_4噬菌体感染的大肠杆菌中分离出RNA连接酶后,人们对分离纯化这种酶的工作进行了很大的改进。目前有些实验室已能制备较纯的T_4RNA连接酶,但方法比较繁琐,通常要经过六个层析牲才能得到较好的结果。甲此寻求一种简单有效的纯化方法是很有意义的。我们将免疫亲和层析用于T_4RNA连接酶的纯化,方法简便,同时所得到的酶测不到RNase的活性,可用于一定序列寡聚核糖核酸的合成。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸分子中一个十二核苷十一磷酸片段(顺序46～57)的合成

我们用T_4RNA连接酶,通过两条路线分别将GpUpCpU,CpCpGpG和TpψpCpG三个寡核苷酸片段连接成十二核苷十一磷酸,GpUpCpU~(32)pCpCpGpG~(32)pTpψpCpG,即相当于酵母丙氨酸转移核糖核酸分子中顺序46～57的一段序列。我们找到了供体3'-端不带磷或其他保护基时,其自聚或自身环化的产生都不明显的条件,从而使供受体用量比大大降低。在有的情况下,供体量大于受体,也获得了比较满意的连接产率。此外,在我们的实验中,5'端是二个稀有嘧啶碱基T和ψ的供体~(32)pTpψpCpG与受体CpCpGpG连接的产率不低于由普通碱基供体的连接产率。我们合成的GpUpCpU~(32)pCpCpGpG~(32)pTpψpCpG已用于酵母丙氨酸转移核糖核酸3'端半分子和全分子的合成中。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸分子中一个十二核苷十一磷酸片段(顺序46～57)的合成

我们用T_4RNA连接酶,通过两条路线分别将GpUpCpU,CpCpGpG和TpψpCpG三个寡核苷酸片段连接成十二核苷十一磷酸,GpUpCpU~(32)pCpCpGpG~(32)pTpψpCpG,即相当于酵母丙氨酸转移核糖核酸分子中顺序46～57的一段序列。我们找到了供体3′-端不带磷或其他保护基时,其自聚或自身环化的产生都不明显的条件,从而使供受体用量比大大降低。在有的情况下,供体量大于受体,也获得了比较满意的连接产率。此外,在我们的实验中,5′端是二个稀有嘧啶碱基T和ψ的供体~(32)pTpψpCpG与受体CpCpGpG连接的产率不低于由普通碱基供体的连接产率。我们合成的GpUpCpU~(32)pCpCpGpG~(32)TpψpCpG已用于酵母丙氨酸转移核糖核酸3′端半分子和全分子的合成中。     

酵母丙氨酸tRNA的纯化、半分子制备及其末端鉴定

本文报道了用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化酵母丙氨酸tRNA的方法,纯化的tRNA,按接受丙氨酸的活力计算,其纯度达60～70%。经核糖核酸酶T_1(RNase T_1)限制性降解(tRNA与RNase T_1的比率为1毫克/15单位,0℃,4分钟),柱层析,制备了tRNA的两个半分子。用萤光标记法,[~3H]标记法,测得5′半分子的3′末端为鸟苷酸;用[~(32)P]标记法测得3′半分子的5′末端为胞苷酸。因此,RNase T_1限制性降解丙氨酸tRNA的切点在反密码子的G—C键之间。     

酵母丙氨酸tRNA的纯化、半分子制备及其末端鉴定

本文报道了用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化酵母丙氨酸tRNA 的方法,纯化的tRNA,按接受丙氨酸的活力计算,其纯度达60～70%。经核糖核酸酶T_1(RNase T_1)限制性降解(tRNA 与RNase T_1的比率为1毫克/15单位,0℃,4分钟),柱层析,制备了tRNA 的两个半分子。用萤光标记法,[~3H]标记法,测得5′半分子的3′末端为鸟苷酸;用[~(32)P]标记法测得3′半分子的5′末端为胞苷酸。因此,RNase T_1限制性降解丙氨酸tRNA 的切点在反密码子的G—C 键之间。     

多核苷酸合成的研究——ⅩⅢ.酵母丙氨酸转移核糖核酸3′端半分子中Cpm~1IpψpG的酶促合成

本文报道了酵母丙氯酸转移核糖核酸3’端半分子反密码区的四核苷酸片段Cpm~1IpΨFpG的合成。先以Cpm~1pΨ为引物,GDP 为底物,在PNPase 和RNase T_1两个酶的协同作用下,生成Cpm~1lpΨpGp,对应用这两个酶进行合成的规律作了摸索与归纳,使合成Cpm~1IpΨpGp的产率达到90%以上,它再经固定化碱性磷酸单酯酶脱磷得到Cpm~1IpΨpG,脱磷率达到98%,此工作通过合成方法旁证了RNase T_1不水解m~1Ip-N 键。     

酵母tRNA~(Ala)3’端第四个核苷酸在tRNA-氨酰基tRNA合成酶识别中的作用

用逐步高碘酸氧化法除去酵母tRNA~(Ala)3′端的pACCA;最终产物用tRNA_O~(Ala)表示;用T_4RNA连接酶使tRNA_O~(Ala)接上pAp、pGp、pCp、pCCCA和pUCCA;经磷酸单酯酶处理、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,测得tRNA_(OA)~(Ala)、tRNA_(CG)~(Ala)、tRNA_(CO)~(Ala)、tRNA_(CCCCA)~(Ala)和tRNA_(CUCCA)~(Ala)接受丙氨酸的活力,分别是80%、36%、12%、6%和8.8%(以tRNA~(Ala)的活力为100%计)。tRNA_(CA)~(Ala)、tRNA_(CG)~(Ala)和tRNA_(CC)~(Ala)首先被混合氨酸基tRNA合成酰制剂中的转核苷酸酶,在CTP和ATP存在的情况下,加上了CCA末端。实验证明,酵母tRNA~(Ala)3′端第四个核苷酸对于合成酶-tRNA的识别是重要的,但又非绝对必需的。