土壤含水量对华北大黑鳃金龟生长发育的影响

室内试验研究土壤含水量对华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita Faldermann生长发育的影响。结果表明,土壤含水量对华北大黑鳃金龟的影响因其发育阶段的不同而异。卵期适宜土壤含水量为10%～20%,幼虫期、蛹期适宜土壤含水量分别为10%～15%和15%～20%。土壤含水量为10%～15%时,成虫性比接近1∶1。土壤含水量为15%时,世代存活率最高。     

华北大黑鳃金龟幼虫血细胞的超微结构观察

应用光学和电子显微镜技术检查了华北大黑鳃金龟3龄幼虫血淋巴内的血细胞,识别出5种类型的血细胞(原血胞、浆血胞、颗粒血胞、珠血胞和凝血胞)并对每一种血细胞的超微结构特点进行描述。     

华北大黑鳃金龟中肠丝氨酸蛋白酶cDNA克隆、 序列分析及表达

丝氨酸蛋白酶是昆虫体内一类重要的消化酶, 为了了解该类酶的分子特性及功能, 本研究利用粉纹夜蛾Trichoplusia ni围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠cDNA表达文库, 首次得到编码华北大黑鳃金龟丝氨酸蛋白酶cDNA序列, 命名为HoSP1（GenBank登录号为FJ573146）。序列分析表明, 该基因长902 bp, 开放阅读框（ORF）长783 bp, 编码260个氨基酸, 推测分子量和pI值分别为26.7 kDa和4.19, 不含有N-糖基化位点, 但在Thr₁₅₇处有一个O-糖基化位点, 含有6个保守的半胱氨酸残基, 组成3对二硫键, 对于维持蛋白质的三级结构起着重要的作用。通过与几种丝氨酸蛋白酶的比对发现, 该酶具有组氨酸（His）、 天冬氨酸（Asp）、 丝氨酸（Ser）催化中心, 与褐新西兰肋翅鳃金龟Costelytra zealandica的14种丝氨酸蛋白酶有明显的相似性, 其中与CzSP3的序列一致性最高, 为52.47%。把该基因与pET21b载体重组后, 进行体外表达, 以BTEE为底物, 测得该酶的活力为0.0378 μmol/mg·min。HoSP1基因的克隆及体外表达为进一步研究该酶在华北大黑鳃金龟体内的表达及功能提供了依据。     

东北与华北大黑鳃金龟分类地位的研究（鞘翅目：鳃角金龟科）

采用RAPD技术和杂交方法对东北大黑鳃金龟（Holotrichia diomphalia Bates1888)和华北大黑鳃金龟（H.oblita(Faldermann1935)的分类地位进行了研究。作者应用40条引物,采用UPDGA法对华北大黑的南京和文登种群。东北大黑的沈阳种群。以及其外群矮臀鳃金龟（H.ernesti Reitter)进行了RAPD分析。所建立的系统发育树显示,东北大黑具有与华北大黑两个地理种群相同的分类地位。同时,作者对两种金龟甲进行了正反交的杂交试验。试验共得到21头正交F1代成虫,3头反交F1代成虫,F1代生活正常,采用东北大黑与F1代回交的方法研究F1代的可育性,2001年6月10日的检查结果显示,四个处理均得到大量回交杂种一龄幼虫和少量二龄幼虫,F1代的雌雄虫均具有正常的生殖力。以上结果表明;两种金龟的次异名。为无效名。     

华北大黑鳃金龟引诱剂配方筛选及引诱效果评价

【目的】筛选可有效引诱华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita成虫的引诱剂配方用于生态防控。【方法】选取5种植物挥发物、2种华北大黑鳃金龟聚集信息素和1种性信息素,根据各化合物单体最佳引诱浓度进行两两混配,得到植物挥发物+聚集信息素、植物挥发物+性信息素和聚集信息素+性信息素共17种二元引诱剂配方。通过触角电位(EAG)反应和趋性行为反应逐步筛选出引诱效果较好的配方。将所筛选配方与其单一组分通过趋性行为反应进行引诱效果比较,并通过室内笼罩诱捕检验配方对华北大黑鳃金龟成虫的引诱效果。【结果】通过EAG反应及趋性行为反应从17种二元引诱剂配方中逐步筛选出了对华北大黑鳃金龟成虫具有较强引诱作用的3种配方,即顺-3-己烯基乙酸酯+顺-9-十八烯乙酸酯,1-己醇+顺-9-十八烯乙酸酯和邻苯二甲酸二丁酯+甘氨酸甲酯,它们引起的华北大黑鳃金龟雌虫EAG反应相对值分别为5 981%, 5 796%和5 722%,引起的雄虫EAG反应相对值分别为3 983%, 4 712%和3 809%。趋性行为反应试验中,引起华北大黑鳃金龟成虫选择反应率最高的为配方邻苯二甲酸二丁酯+甘氨酸甲酯,成虫选择反应...     

华北大黑鳃金龟两种围食膜蛋白cDNA的分子克隆与序列分析

本文以华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠为材料,依据Stratagene公司文库构建试剂盒方法,构建其中肠cDNA表达文库,该文库滴度为1.9×106 pfu/mL,重组率为99.97%。依据现代免疫学原理,利用棉铃虫Helicoverpa armigera围食膜蛋白多克隆抗体筛选文库,得到两个编码华北大黑鳃金龟围食膜蛋白的cDNA克隆Ho-Peritrophin1与Ho-Peritrophin2,其cDNA长分别为2 385 bp和1 633 bp,在PolyA末端上游各有3个多聚腺苷酸信号序列AATAAA,最长开放阅读框(ORF)分别编码729个和477个氨基酸,与粉纹夜蛾Trichoplusia ni CBP2(chitin binding protein 2)的相似性最高,分别为21.9%和19.1%。结构域分析表明,Ho-Peritrophin1与Ho-Peritrophin2分别具有9个和6个几丁质结合功能域,只含有较少的O-糖基化位点,不含有类粘蛋白结构域。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对两种蛋白的作用位点主要位于几丁质结合功能域(chitin binding domain, CBD)内部,而因受几丁质结合功能域保护,这两种蛋白能够抵抗这些蛋白酶的降解。与正常CBD比较,这两种蛋白C端的CBD只含有4个Cys,只在第1与第3、第4与第5个Cys之间形成两对二硫键,缺少由第2与第6个Cys形成的二硫键。推测其N端还应包括信号肽序列和几丁质结合功能域的未知序列。     

华北大黑鳃金龟幼虫对3种寄主植物根系分泌物的趋性反应

华北大黑鳃金龟幼虫是我国北方地区为害植物根系的重要土壤害虫,探索寄主根系分泌物对其引诱作用,可以为开发大黑鳃金龟幼虫引诱剂等绿色防控提供理论基础.以纯净空气作为对照,利用“Y”型嗅觉仪分别测定了3龄幼虫对花生、大豆、玉米根系的趋性反应.以正己烷为对照,采用GC-MS分析鉴定3种根系分泌物的成分,观测试虫对其主要成分的嗅觉反应.结果表明: 华北大黑鳃金龟幼虫对花生、大豆和玉米根系都具有显著的趋向性.通过GC-MS分析鉴定发现,根系分泌物主要成分在3种植物中均有20种及以上,而且在不同植物之间除丙三醇、十二醇和乙苯3种共有组分之外,其余组分存在明显差异.分泌物的趋性反应结果显示,供试幼虫对分泌物同一组分不同浓度的趋性反应程度明显不同.在浓度为40和80 μg·mL^-1时,2-丁烯酸、甲基丁二酸、肉豆蔻酸、乙酸和邻苯二甲酸等的引诱虫数显著多于对照;在浓度为100、200 μg·mL^-1时,化合物十四烷和十六烷等的引诱虫数显著多于对照.在浓度为300、500 μg·mL^-1时,供试幼虫对对二甲苯、邻二甲苯和棕榈酸甘油酯等有显著的趋向性反应.可见,植物根系分泌物的主要成分对华北大黑鳃金龟幼虫具有显著的引诱作用.     

斜纹夜蛾酵母双杂交文库的构建及其在蜕皮激素受体互作蛋白筛选中的应用

【目的】蜕皮激素在昆虫变态发育中起着关键的调控作用。蜕皮激素活化为20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)后与蜕皮激素受体二聚体〔蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)和超气门蛋白(ultraspiracle protein,USP)〕结合,启动20E诱导的级联反应。本研究旨在从互作蛋白角度探究EcR/USP自身调控的分子机理。【方法】以重要农业害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura为研究对象,通过构建酵母双杂交筛选系统分别筛选了与EcR和USP相互作用的蛋白。【结果】文库转化效率达到3.0×106cfu/μg,文库滴度达到1.3×108cfu/m L,文库插入片段大小在500~2 000 bp之间。4种诱饵质粒(EcRA/p GBKT7,EcRB1/p GBKT7,USP1/p GBKT7和USP2/p GBKT7)对酵母细胞无毒性,并且无自激活性,说明构建的酵母双杂交文库质量可靠。用以上4种诱饵质粒筛选酵母双杂交文库,共得到110个互作蛋白,其中与EcRB1,USP1和USP2互作的蛋白分别有26,52和32个,未筛选到与EcRA互作的蛋白。随后,从中挑选了Dna J-5(Hsp40 homolog 5,一种热激蛋白分子伴侣),MBF2(mediator of Bm FTZ-F1 type 2,一种转录共激活子),polyubiquitin(多聚泛素类蛋白),esr16(ecdysteroid regulated 16k Da protein,一种蜕皮激素调控蛋白)和NEDD8-like(neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated protein 8,一种泛素调节相关蛋白)5种蛋白,利用酵母双杂交和Far-Western印迹法进一步验证了蛋白间的互作关系。【结论】分子伴侣和泛素化修饰等在蜕皮激素受体调控中可能起着重要作用。本研究对深入理解昆虫变态发育的分子机理具有重要意义。     

华北大黑鳃金龟对桃树挥发物的电生理反应

【目的】华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita是一种分布范围广,寄主种类多的农业害虫。本研究鉴定了桃树顶空挥发物中对华北大黑鳃金龟雌虫具有触角电生理活性的化合物,并探索桃树挥发物活性成分的剂量对华北大黑鳃金龟雌、雄虫触角电生理反应的影响。【方法】采用顶空吸附法收集桃树枝叶挥发物,用气相色谱 触角电位联用技术(GC-EAD)和气相色谱 质谱联用技术(GC-MS)鉴定有电生理活性的桃树挥发物成分,最后用触角电位(electroantennograph, EAG)技术测试这些挥发物在0.01,0.1, 1, 10和100 μg剂量下引起的华北大黑鳃金龟雌、雄成虫EAG反应。【结果】桃树挥发物中能引起华北大黑鳃金龟雌成虫触角电生理反应的成分有7种,包括Z-β-罗勒烯、顺-3-己烯乙酸酯、顺-3-己烯醇、壬醛、水杨酸甲酯以及2种未知化合物。所测试的对华北大黑鳃金龟雌成虫触角具有电生理活性的5种桃树挥发物成分在各剂量下都能引起雌、雄成虫明显的EAG反应。雌、雄虫对同种物质的EAG反应随着剂量的增加而有增大的趋势,并且雌虫的EAG反应显著高于雄虫。【结论】桃树挥发物中,罗勒烯、顺-3-己烯乙酸酯、顺-3-己烯醇、壬醛、水杨酸甲酯均能引起华北大黑鳃金龟雌、雄成虫的剂量依赖性的触角电生理反应,而且存在显著的性别差异。可利用这些化合物开展行为反应和田间诱集试验,进一步验证其对华北大黑鳃金龟的引诱活性。     

利用酵母双杂交系统在人脑cDNA文库中筛选与禽流感病毒核蛋白相互作用的蛋白质

禽流感病毒核蛋白 (NP) 在病毒的转录、复制以及决定病毒的宿主特异性方面都具有重要作用。通过酵母双杂交系统筛选与核蛋白相互作用的蛋白,为进一步了解NP蛋白与细胞内蛋白质的相互关系以及流感病毒与宿主的相互关系奠定基础。应用酵母双杂交系统,构建NP诱饵质粒,进而筛选人脑cDNA文库,寻找可能与禽流感病毒NP相互作用的蛋白质。经过酵母双杂交共验证,得到7个与NP相互作用的阳性克隆。该结果为深入了解病毒复制的分子机理及其在蛋白质水平上与宿主蛋白的相互作用关系提供了线索。     

应用酵母双杂交技术寻找与GGNBP相互作用的蛋白质

生殖细胞缺陷症(gcd)小鼠突变体是20个世纪90年代初发现的一种不育突变小鼠,其不育原因是由于其胚胎期原始生殖细胞的数目低于正常。FancL(也叫Pog)的缺失是引起gcd突变小鼠的原因,FancL基因缺失后可能影响了小鼠胚胎期原始生殖细胞的增殖／存活和成年期小鼠精母细胞的减数分裂。FANCL是一种含有PHD结构域的泛素E3连接酶,是Fanconi贫血复合物的组分之一。在生殖细胞中,FANCL与GGN1和GGN3相互作用,GGN1和GGN2又与一种新的蛋白质GGNBP特异作用。但GGNBP蛋白的功能还不清楚。为了研究GGNBP的功能以及揭示更多的参与该过程的蛋白质,运用Clontech公司新开发的第3套酵母双杂交系统,以GGNBP为诱饵从成年小鼠睾丸cDNA库中筛选与其相互作用的蛋白质基因,发现了一个主要在睾丸中表达的新的基因,其编码的蛋白质产物在酵母系统中与GGNBP特异作用。     

暗黑鳃金龟气味结合蛋白HparOBP15a基因的克隆及功能分析

【目的】暗黑鳃金龟Holotrichia parallela通过气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)识别性信息素和植物挥发物准确而迅速地定位配偶、寄主植物。本研究通过克隆暗黑鳃金龟气味结合蛋白15a(Hpar OBP15a)基因,解析该基因的编码蛋白特征、组织表达模式及与寄主植物气味等化合物的结合特性方面的研究,为阐明暗黑鳃金龟基于嗅觉识别的寄主植物选择机理奠定理论基础。【方法】根据暗黑鳃金龟成虫触角转录组测序的结果,利用RT-PCR克隆了Hpar OBP15a基因;Real-time PCR方法分析了该基因在成虫不同部位的表达量差异;荧光竞争结合测定了Hpar OBP15a蛋白和58种候选化合物的结合特征。【结果】暗黑鳃金龟Hpar OBP15a基因全长534 bp,编码147个氨基酸,Gen Bank登录号为AK1834747。Hpar OBP15a在触角中特异表达,且在雌虫触角中表达量显著高于雄虫。在被测的58种化合物中,Hpar OBP15a与46种气味化合物具有较好的亲和性,其中与十二烷、十二醇结合能力最强,其解离常数分别为8.5和11.3μmol/L;同时,对性信息素(L-异亮氨酸甲酯和R-芳樟醇)也有一定的结合能力(解离常数分别为21.0和18.5μmol/L)。【结论】Hpar OBP15a具有广泛的气味结合谱,其中对榆树挥发物十二烷的结合能力最强,因此该蛋白可能在暗黑鳃金龟对榆树的定位过程中具有重要作用。     

Identification of proteins that interact with a protein of interest: Applications of the yeast two-hybrid system

The yeast two-hybrid system is a molecular genetic test for protein interaction. Here we describe a step by step procedure to screen for proteins that interact with a protein of interest using the two-hybrid system. This process includes, construction and testing of the bait plasmid, screening a plasmid library for interacting fusion proteins, elimination of false positives and deletion analysis of true positives. This procedure is designed to allow investigators to identify proteins and their encoding cDNAs that have a biologically significant interaction with your protein of interest.     

Screening of proteins that interact with human thrombopoietin receptor c-Mpl using yeast two-hybrid system

Thrombopoietin (TPO) is the major cytokine involved in platelet production and exerts its effects via the receptor c-Mpl. The yeast two-hybrid system has been used to screen the proteins interacting with c-Mpl. First, the cDNA fragment of c-Mpl intracellular domain was cloned into two-hybrid vector pAS2, and the resulting plasmid is designated as pASMM. Then a human placenta cDNA library was screened using the pASMM as a target plasmid. Seven positive clones were isolated from 150 000 independent transformants. Sequence analysis of one of the positive clones demonstrates that a part of coding sequence of vimentin from 611 bp to 3′ end and flanking non-translation region was obtained. Therefore, there is an interaction between vimentin and TPO receptor. The results suggest that cytoskeletal protein may play an important role in TPO signal transduction pathway.     

Screening of proteins that interact with human thrombopoietin receptor c-Mpl using yeast two-hybrid system

Thrombopoietin (TPO) is the major cytokine involved in platelet production and exerts its effects via the receptor c-Mpl. The yeast two-hybrid system has been used to screen the proteins interacting with c-Mpl. First, the cDNA fragment of c-Mpl intracellular domain was cloned into two-hybrid vector pAS2, and the resulting plasmid is designated as pASMM. Then a human placenta cDNA library was screened using the pASMM as a target plasmid. Seven positive clones were isolated from 150 000 independent transformants. Sequence analysis of one of the positive clones demonstrates that a part of coding sequence of vimentin from 611 bp to 3' end and flanking non-translation region was obtained. Therefore, there is an interaction between vimentin and TPO receptor. The results suggest that cytoskeletal protein may play an important role in TPO signal transduction pathway.