双壳纲动物核糖体RNA 18S-ITS1序列及其在分子系统发育研究中的应用

测定了双壳纲不同科、属、种及种内共11个个体的核糖体RNA 18S-ITS1序列。结果表明,该序列在种间存在很高的多态性,长度从558bp到784bp不等,碱基差异百分比在10．7％～61．7％之间,ITS1序列同源性很低,有片段的插入与缺失。种间18S部分序列碱基差异百分比在0．9％～23．7％之间,变化主要是碱基的转换。用邻接法(NJ)构建了8个种的18S部分序列(约240bp)的系统发育树,与传统形态学分类结果相符。马氏珠母贝(Pinctada martrtensi)4个不同地域个体间的序列差异百分比在0．6％～1．9％之间。分析指出：18S基因可以作为双壳纲动物高阶元系统发育的分子标记;ITS1序列种间变化很大,可以应用于该纲物种的分类及鉴别．在亲缘关系相近种及种内变异相对较小,但核苷酸变异位点信息量丰富,可用于属内种间、亚种和群体间的遗传多样性研究。     

兰州地区无偿献血人群血清TTV-DNA的检测

为了解兰州地区人群TTV的感染状况,作者采用套式PCR法,以TTV-DNA的ORFl中的一段309nt的序列为扩增序列,对36份兰州地区无偿献血人群血清DNA进行扩增,将扩增阳性片段测序并进行序列同源性比较,结果发现兰州地区无偿献血人群TTV感染率为52．7％。10份兰州序列之间的同源性为88．6％～95．4％,兰州序列与日本TA287株的同源性为88．1％～93．3％,表明兰州地区无偿献血人群TIN感染非常普遍,兰州地区TTV流行株存在变异,至少有基因亚型存在。     

6株0型口蹄疫病毒结构蛋白vpl基因的克隆与序列分析

提取6株O型口蹄疫病毒(FMDV)(T1-T6)的RNA,用一对通用引物经RT-PCR方法将6株FMDVVP1基因片段扩增出来。克隆测序,核苷酸序列分析表明,T1-T6六株vpl基因的核苷酸序列同源性在95％～99．8％之间,氨基酸序列同源性在94．8％～100％之间。T1-T6六株病毒vpl基因的核苷酸序列与已经发表的O／HKN／14／82、O/TAW/81,97、O／PHI／7／96、O／HKN／1／99和O／HKN／16／96的同源性较高,核苷酸序列同源性在86．1％～95．8％之间：发现6株毒株的主要中和抗原表位140-160、200-213位的氨基酸序列完全相同,推测它们有相近的中和抗体表位和抗原性。故推断本试验中的6株FMDV株属于同一基因型,即FMDV O型中国拓朴型(Cathay topotype)。     

新疆3种雅罗鱼线粒体DNA控制区序列的差异和系统进化关系

对分布在新疆的准噶尔雅罗鱼(Leuciscus merzbacheri)、贝加尔雅罗鱼(Leuciscus leuciscus baicalensis)和高体雅罗鱼(Leuciscus idus)3个鱼种共24尾个体的线粒体DNA D-loop控制区核苷酸序列进行了测定,获得24条长度为667—669bp的同源基因序列。3种雅罗鱼之间的序列差异在6．39％—9．89％之间,贝加尔雅罗鱼与高体雅罗鱼种间序列同源性高,变异程度小;贝加尔雅罗鱼与准噶尔雅罗鱼种间序列同源性最低,变异程度最大。所采集的贝加尔雅罗鱼两个地理群体(赛里木湖和额尔齐斯河)内mtDNA的平均核苷酸碱基序列差异为1．07％和1．08％;两群体间的序列差异为1．07％,显示两个地理群体间无明显分化。DNA序列数据显示,这3种鱼类线粒体DNAD-loop序列变异丰富,24尾个体呈现独自的单倍型。同源基因序列平均含AT碱基64．1％,GC碱基35．9％,显示准噶尔雅罗鱼、贝加尔雅罗鱼、高体雅罗鱼的线粒体DNAD-loop区核苷酸组成的不均一性。分子系统树提示,贝加尔雅罗鱼与高体雅罗鱼亲缘关系较近,准噶尔雅罗鱼是3种雅罗鱼中较古老的鱼种。     

猪圆环病毒2型分离毒株全基因组的克隆及序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV－2）基因序列,设计两对特异性引物,用PCR方法从接种疑似PMWS仔猪病料的细胞中分段扩增2个分离毒株全基因组。将扩增片段克隆入pGEM-T easy载体,筛选获得含有相应片段的阳性重组质粒。对质粒中的插入片段进行测序拼接,获得2株均为1768bp的全基因组序列。应用DNA star序列分析软件,对所测PCV－2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行同源性比较,并绘制系统发生树,结果发现：所测两毒株之间的核苷酸序列同源性极高,可达99．8％,亲缘关系密切;与PCV－2参考毒株的同源性介于95．3％－99．7％之间,其中与美国的一株PCV－2同源性最高,分别为99．5％和99．7％,亲缘关系很近;与国内两分离株同源性分别为96．4％和98．8％－98．9％;与PCV－1参考毒株同源性仅为77．1％－77．5％。     

红鲫部分线粒体DNA序列变异分析

对红鲫19尾个体的线粒体tRNA-Thr基因、tRNA-Pro基因和部分控制区的核苷酸序列进行了测定．获得19条长度为836～837bp的同源基因序列,共发现18个变异位点．定义了4种单元型．在红鲫4种单元型中确认了DNA复制终止相关的序列TAS、中央保守区序列（CSB-F、CSB-E和CSB-D）和保守序列CSB1．在18个变异位点中,除一个缺失外,序列变异全部为转换,无颠换发生．4种单元型之间的序列差异在0．1％。1．7％之间．结果显示,红鲫群体具有较高的遗传多样性水平,因而暗示了它具有较强的适应外界环境变化的能力,同时说明它是鱼类遗传育种的较好实验材料．     

NDV山东分离株的生物学特性及其HN基因的克隆与序列分析

2004年从山东某鸡场发病蛋鸡群中分离到一株新城疫病毒（编号：ShD-2-04）,对其生物学特性进行了研究,并对其HN基因进行了克隆和序列分析。结果表明：该病毒的最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间（MDT）为50．4,1日龄SPF鸡脑内接种分离病毒致病指数（ICPI）为1．85,6周龄SPF鸡静脉接种致病指数（IVPI）为2．42,表明该病毒具有新城疫强毒株的一些特征;其HN基因开放性阅读框架（ORF）为1,716bp,编码571个氨基酸;与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,核苷酸序列的同源性在81．6％-87．2％之间,氨基酸同源性在87．6％-90．7％之间。     

三株牛源亚洲1型口蹄疫病毒聊基因的克隆与序列分析

以3株国内分离的亚洲1型口蹄疫病毒（分别命名为F1、F2、F3）为研究目标,根据GenBank中注册的FMDV VP1基因的序列设计1对引物,采用RT-PCR方法成功地扩增出含有VP1全基因的片段,并测定了3个毒株VP1基因的序列。结果表明,3株亚洲1型FMDV毒株VP1基因长度均为633bp,编码211个氨基酸。3株毒株彼此之间的核苷酸序列同源性在82．8％～99．1％之间,雅导氨基酸序列同源性在89．1％～99．1％之间。从系统发生树看,F1株与我国香港2005年牛毒株序列同源性99．5％,属同一遗传谱系,F2株、F3株与2005年引起河北省万全县、北京市延庆县、甘肃静宁县疫情的毒株分属同一个基因群。     

与绵羊KAP6-1相似的6个绒山羊全长cDNA的克隆与序列分析

用SMART^TM技术构建了绒山羊体侧部皮肤组织的cDNA文库,随机挑选克隆提取质粒,用M13正向测序引物对插入片段进行测序,得到636个cDNA序列。与GenBank数据库比对,有41个序列与绵羊角蛋白关联蛋白(Keratin Associated Protein,KAP6-1)cDNA高度同源。41个序列可归为6个不同的cDNA,GenBank登陆号分别为AY310749、AY310750、AY310751、AY310752、AY310753和AY310754。与绵羊KAP6-1基因组基因比较,推测这6个序列为全长cDNA,分别为编码82、84、71、71、83和83个氮基酸的碱性蛋白质,甘氮酸和酪氮酸的含量大于60％,它们之间核苷酸序列的一致性大于55．4％,读码框氮基酸序列的一致性大于79．8％。与其他物种KAP6s比较,绒山羊的6个eDNA和绵羊的KAP6-1 cDNA的序列一致性最高,为81．9％～98．8％,不同物种KAP6-1之间氮基酸序列一致性大于50％。     

葡萄叶绿体rbcL基因的结构分析

以玫瑰香葡萄（Ｖｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａ Ｌ．）为材料,克隆了含有叶绿体ｒｂｃ Ｌ基因的３．１ ｋｂ Ｂａｍ ＨⅠ片段,构建了该基因的限制性酶切图谱,测定了该基因的核苷酸序列。所测的核苷酸序列总长度为２００４ ｂｐ,其中基因的编码区为１４２８ ｂｐ,编码一个含４７５ 个氨基酸的蛋白质,其分子量约为５３ ｋＤ;测定基因的５上游含启动子的部分共３５８ ｂｐ,包括－ １０ 区（ＴＡＡＡＡＴ）、－ ３５区（ＴＴＧＣＧＣ）和ＳＤ 序列（ＧＧＡＧＧ）;基因的３下游区共２１８ ｂｐ,含有３ 个转录茎环终止结构。玫瑰香葡萄ｒｂｃ Ｌ基因编码区的核苷酸序列与烟草、矮牵牛、菠菜、苜蓿、水稻和玉米之间的同源性分别为９１．５％ 、９１．４％ 、９０．２％ 、８９．８％ 、８６．３％ 和８４．５％ ;推导出的氨基酸序列的同源性分别为９２．２％ 、９１．６％ 、９２．２％ 、９３．７％ 、９３．５％ 和９０．１％ 。     

鲤春血症病毒中国分离株糖蛋白基因和氨基酸序列的初步解析

2002～2004年间从国内养殖鲤科鱼类和观赏鱼类中分离出8株鲤春血症病毒(SVCV)。根据SVCV参考株 全序列,设计引物,用逆转录聚合酶链式反应扩增出8株SVCV糖蛋白编码基因片段,并对扩增产物进行了克隆和 序列测定。用生物信息学方法对测得的序列进行分析,结果8个国内分离株的糖蛋白基因序列与参考株的基因序 列相似性均在92％以上,8个国内分离株之间基因序列相似性均在97．7％以上;8个国内分离株之间糖蛋白推导 出的氨基酸序列相似性均在94．5％以上,与参考株氨基酸序列相似性在92．9％-94．9％之间。系统发育树分析结 果表明,SVCV国内分离株与USA株、980451株、980528株和970469株的进化方向一致,与其它SVCV毒株在进 化方向上不同。8个毒株有19个共同的酶切位点,推导出的氨基酸序列中有10个亲水区、10个可能的抗原位点 和10个跨膜蛋白区域,其峰值基本一致。对SVCV国内分离株的糖蛋白6个功能位点(天冬酰胺糖基化位点、精 氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪氨酸磷酸化位点和肉豆蔻酰 基化位点)进行了初步分析。     

用细胞色素b部分序列研究斑马鱼的分子分类与系统发育

用细胞色素b特异性引物,对长尾斑马鱼、短尾斑马鱼、豹纹斑马鱼、食蚊鱼和青石斑鱼的总DNA进行PCR扩增、克隆、测序后与Genbank数据库的团头鲂、青鲻鱼、草鱼、金桔鱼的细胞色素6基因同源序列进行序列比较。结果显示,长度为426bp的细胞色素b同源序列的平均碱基组成是：26．7％A,26．1％c．16．6％G．30．5％T,密码子第三位点的碱基组成存在较大的偏倚,G的含量仅占6．4％。长尾斑马鱼、短尾斑马鱼和豹纹斑马鱼之间细胞色素b DNA序列变异很小,相似性高于99%。NJ法构建的分子系统树表明：豹纹斑马鱼先与长尾斑马鱼聚在一起,再与短尾斑马鱼聚为一组。本研究结果支持Frankel和David等人认为豹纹斑马鱼应该是Danio rerio的一个亚种,而不是单独的一个种的观点。     

犬冠状病毒大熊猫株纤突蛋白全基因的克隆与序列分析

在国内首次对犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCVDXMV)纤突蛋白基因进行了克隆和序列测定。该基因全长4362bp,编码1453个氨基酸,N端前18个氨基酸为推测的信号肽序列,后1435个氨基酸构成成熟蛋白。与GenBank中已发表的11个CCV毒株s基因相比,s基因核苷酸序列同源性在40．2％-99．5％之间;推导的氨基酸序列同源性在15．9％-99．O％之间。DXMV株s基因变异区主要集中在该基因前1／2处,其中350．370、439．478、1718．1818三个区域碱基变异较大,而1060．1700区却十分保守。基于s全基因及其蛋白的聚类分析表明,DXMV株与K378、NVSL和USpatent株亲源关系最近。推导的DXMV株s蛋白氨基酸序列潜在的N-联糖基化位点与CCV强毒V54相同,为34个,比Insavc．1弱毒多一个;其中第566．568位糖基化位点为多数强毒拥有而弱毒没有的。另外,DXMV株S蛋白疏水性及抗原表位与其它毒株有一定的差异,这些差异对DXMV株致病性和免疫原性等影响尚待进一步的研究。     

帘蛤科贝类rDNA内转录间隔区序列的研究

根据18SrDNA、5．8SrDNA和28SrDNA保守序列设计引物,应用聚合酶链式反应（PCR）扩增了文蛤（Meretrix meretrix L．）、青蛤（Cyclina sinensis G）、硬壳蛤（Mercenaria mercenaria L．）和江户布目蛤（Protothaca jedoensis L．）4种帘蛤科贝类的第一内转录间隔区（ITS1）和第二内转录间隔区（ITS2）序列,并进行了测序。结果表明,文蛤、青蛤、硬壳蛤和江户布目蛤的ITS1扩增产物大小分别为978bp、663bp、757bp和942bp,GC含量分别为61．55％、60．78％、62．48％和64．86％～64．97％,其中ITS1序列长度分别为900bp、585bp、679bp和864bp,是迄今已报道双壳贝类中变化范围最大的,GC含量分别为61．67％、61．03％、63．03％和65．51％～65．62％,江户布目蛤种内ITS1序列有个体差异;ITS2扩增产物大小分别为644bp、618～620bp、593bp和513～514bp,GC含量分别为61．18％、61．29％～61．81％、62．73％和61．48％61．60％,其中ITS2序列长度分别为412bp、386～388bp、361bp和281～282bp,GC含量分别为65．29％、65．21％～66．06％、67．87％和67．38％～67．62％,青蛤和江户布目蛤种内ITS2序列有个体差异。4种蛤ITS1和ITS2序列种间差异很大,有明显的长度多态性,ITS2种间序列相似度73．0％～89．1％,与ITS1的种间序列相似度48．7％～81．5％相比略高。此外,在4种蛤ITS1和ITS2序列中各发现2个与rRNA加工有关的保守区。通过对ITS1和ITS2序列的组装获得了4种蛤5．8SrRNA基因完整序列,序列长度都是157bp,GC含量57．96％～58．60％,4种蛤5．8SrRNA基因相对保守,种间序列差异度0-6．0％,共有10个变异位点,其中转换4处,颠换6处,硬壳蛤和江户布目蛤5．8SrRNA基因序列完全相同。以ITS2序列（包含5．8SrRNA和28SrRNA基因部分序列）为标记,调用北极蛤科的Arctica islandica相应序列数据作外群,构建了帘蛤科贝类的系统发育树,其拓扑结构显示江户布目蛤与硬壳蛤亲缘关系最近,青蛤与其他3物种的亲缘关系最远。     

我国猪瘟病毒兔化弱毒株囊膜糖蛋白E0基因的克隆及序列测定

采用异硫氰酸胍一步法从４８０代猪瘟病毒兔化弱毒株（ＨＣＬＶ）脾毒中提取总ＲＮＡ,以该ＲＮＡ为模板,进行反转录,然后采用套式ＰＣＲ扩增出ＨＣＬＶ的囊膜糖蛋白Ｅ０基因,琼脂糖凝胶电泳表明其大小与预计相符。将扩增出的Ｅ０基因克隆到ｐＧＥＭＴ载体中,用自动序列分析仪对其进行序列测定。将测得的序列及推导的氨基酸序列与国外测得的Ｃ株相应序列进行比较,结果发现,它们之间核苷酸序列同源性为９９．０８％,氨基酸序列同源性为９８．４２％。     

一株杜氏藻的分子鉴定与耐盐特性

杜氏藻属（Dunaliella）是绿藻门的一类极端耐盐的单细胞藻。本文通过核基因ITS序列和叶绿体基因rbcL序列确定了一株分离自舟山群岛的杜氏藻D3的分类地位,并比较了4种NaCl浓度对该藻的生长、蛋白质含量、总脂含量和叶绿素荧光参数的影响,以期为该藻在今后的科研与应用提供基础资料。结果表明,该藻与23株杜氏藻的ITS序列之间的遗传距离在0．026—0．136之间,与21株同属藻rbcL序列之间的遗传距离在0．005～0．060之间,由遗传距离和聚类图推断该杜氏藻D3属于D．viridis。不同NaCl浓度对该藻D3生长影响表明1．00mol·L^-1NaCl培养藻生长最快,培养至10d时,0．44mol·L^-1、2．00mol·L^-1和3．00mol·L^-1NaCl培养藻细胞数分别是它的85．9％、93．2％和80．7％;该藻可溶性蛋白含量在1．00mol·L^-1 NaCl培养最高;藻细胞总脂含量在0．44-2．00mol·L^-1NaCl浓度范围内随盐度升高总脂含量增加,2．00mol·L^-1 NaCl培养最高（占干重的22．3％）;叶绿素荧光参数（F√Fm、ФPSII qp）在高盐（3．00mol-LL^-1 NaCl）培养显著降低,而NPQ则升高。     

人乙型肝炎病毒前表面抗原preS基因的克隆与序列分析

从杭州、兰州两地各一例乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原阳性血清中提取病毒DNA,采取PCR技术扩增出前表面抗原（preS)基因片段,重组到质粒载体上,对该基因进行了全序列测定[GenBank索取号CpreS-HZ:AF 325674;preS-LZ:325675].克隆的HBVpreS基因杭州分离物（preS－HZ）和兰州分离物（preS－LZ）全长522个核苷酸,编码174个氨基酸。preS－HZ与已发表的HBV adr亚型上海分离物、北京分离物、日本分离物、HBVadw亚型和ayw亚型preS基因的核苷酸序列同源性分别为96．7％、96．2％、97．3％、88．7％和84．1％,氨基酸序列同源性分别为96．0％、94．9％、97．1％、85．1％和85．4％;preS－LZ与相应序列的核苷酸序列同源性分别为96．4％、96．2％、96．9％、88．7％、83．7％,氨基酸序列同源性分别为94．9％、94．9％、96．0％、85．1％、84．1％,分子进化分析（ADNASTAR,1999）表明,相对于以上报道的序列二者含有四个特异的氨基酸突变位点,在免疫保护区内二者具有较好的保守性,可用于表达乙肝重组亚单位疫苗。     

蝽科部分昆虫细胞色素b基因序列及其系统发育关系的探讨

以线粒体细胞色素b(Cyt b)基因作为分子标记,对蝽科蝽亚科3种、益蝽亚科2种、荔蝽亚科1种、盾蝽亚科2种昆虫进行序列测定,获得Cyt b基因432bp的序列片段,该片段中碱基T、C、A、G的平均含量分别为31．3％、12．4％、37．6％和18．7％,A T平均含量为68．9％,明显高于G C含量(30．1％);密码子第三位点A T含量更高达82．7％。属和种间序列变异大,碱基替换多发生在第三位点。以筛豆龟蝽(Megacopta cribraria)为外群构建系统发育树,结合形态特征与序列变异率,赞同将盾蝽亚科、荔蝽亚科从蝽科划分出来并提升为科的观点,它们之间的系统关系为：盾蝽科与荔蝽科形成姊妹群,较蝽科发育得早;蝽科作为一个单系群,是蝽总科中最为进化的类群。     

15株中国TT病毒基因型鉴定和部分序列分析

ＴＴ病毒（ＴＴＶ）为一种新鉴定的输血后肝炎相关的病毒。用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增ＴＴＶ ＤＮＡ序列核苷酸１９１５到２１８５之间的片段,并将该片段克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体。重组克隆经酶切鉴定后,用全自动测序仪测序,发现本组病例中１５侏ＴＴＶ毒株间的同源性在６６．８％到９９．３％之间,与ＴＴＶ日本株比较同源性在６６．１％到９７．４％之间,分析结果显示在我国不仅有国外已报告的不同基因亚型毒株     

三株散发性戊型肝炎病毒变异株的部分序列比较

对三株散发性戊型肝炎病毒Ｃｈ－Ｔ１１、Ｃｈ－Ｔ２１、Ｃｈ－Ｆ４０的部分基因组做克隆测序,经比较发现与其它国内外ＨＥＶ株ＯＲＦ２部分相应核苷酸序列同源性在７８．３－８１．３,Ｃｈ－Ｔ２１与Ｃｈ－Ｔ４０的核苷酸同源性９８．８％,而Ｃｈ－Ｔ１１与前两者的同源性则分别为８９．８％和９０．２％。Ｃｈ－Ｔ１１、Ｃｈ－Ｔ２１、Ｃｈ－Ｔ４０与其它ＨＥＶ株相应氨基酸序列同源性在９５．８－９７．９％,它们之间的氨基酸