软腐芽孢杆菌D20产环糊精葡糖基转移酶的条件和酶性质

软腐芽孢杆菌(Bacillus macerans)D20菌株在适宜培养基中产大量环糊精葡糖基转移酶。玉米淀粉、硫酸铵和麦麸是适合的营养物质。酶反应最适pH为5.5,温度为50℃,酶用量为500U／g以上。A-、β-和r-GD产量比约为61：32：7。据此,作者认为,该菌株可用于环糊精生产工业。     

β-环糊精葡基转移酶的纯化方法及酶学性质的研究

β-环糊精葡基转移酶的粗酶液应用酚酞分光光度法测得该酶的环化活性为11.79U/mL。该粗酶液先经过淀粉-酒精沉淀或淀粉-硫酸铵沉淀初步纯化,然后经Sephacryl S-100凝胶层析后,比活力分别提高了16、21、50倍,由原来的11.44U/mg蛋白质增加到572.67U/mg蛋白质,回收率分别为72.4%、66.4%、40.9%,经SDS-PAGE电泳显示为单一的蛋白带,酶的分子量约为70kDa。酶学性质研究表明该酶的最适pH和最适温度分别为6.0和60℃,在pH6.0~10.0范围内,55℃以下保温30min基本保持稳定。纯化后的β-环糊精葡基转移酶的环化活性每克相当于35727U。     

α-环糊精糖基转移酶活性区域突变提高选择形成γ-环糊精能力

探讨α-环糊精糖基转移酶(CGT酶)活性区域-3亚位点(47位赖氨酸残基),-7亚位点(146~152位氨基酸残基)以及环化中心位点(195位酪氨酸残基)对其催化底物形成γ-环糊精(CD)能力的影响。将α-CGT酶相应位点分别进行如下突变:K47T,Y195I,以及146~152位氨基酸残基替换为异亮氨酸(命名为△6),并在大肠杆菌BL21中实现异源活性表达。以可溶性淀粉作为底物进行转化,利用HPLC分析各种突变酶的催化产物中3种环糊精产量和比例。结果表明,和野生酶相比,所有突变酶的淀粉水解活性和环糊精总生成量都有不同程度的下降。在产物的组成方面,突变酶Y195I的催化产物中,α-CD的含量由68%降为30%,β-CD由22.2%提高为33.3%;而γ-CD由8.9%提高为36.7%,含量提高了4倍,取代α-CD成为产物中的主要成分;γ-CD的实际产量为1.1 g/L,是野生酶(0.4 g/L)的3倍。突变酶K47T和△6的转化产物中α-CD比例有不同程度下降,但仍然是产物中的主要组分,β-和γ-CD的比例都有所增加。由此可见,活性区域中195位氨基酸对于α-CGT酶的活力和催化选择性具有重要的影响,Y195I突变体酶最有利于选择性形成γ-CD。纯化后突变酶Y195I的酶学性质试验表明,其最适反应温度和野生酶相同,但最适反应pH有所提高,且比野生酶具有更好的pH稳定性。因此,突变酶Y195I具有生产制备γ-CD的潜力。     

一种α-环糊精葡萄糖基转移酶的纯化及性质研究

本文报道了一种主要转化产物是α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶的纯化、酶学性质和转化特性。将发酵上清液通过硫酸铵分级沉淀、疏水柱层析和离子交换层析获得表观电泳纯的酶蛋白。纯酶的分子量约为75KDa,等电点5.3。最适反应温度为50℃,最适反应pH为6。对可溶性淀粉的Km值和Vmax分别是50mg/ml和6.07 mg/ml/min。色氨酸残基为酶活力的必需基团。酶的N末端序列为-SPDTSVDNKV-。Ca2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Fe2+、Ag+对酶活力有强烈抑制作用。纯酶催化转化条件试验表明,廉价的马铃薯淀粉是酶催化制备α-CD的适宜底物,最佳转化条件为：酶量200u/g淀粉,温度40℃,反应时间24h,总转化率达41%,其中α-环糊精占总转化产物的78%。因此,该酶不仅表现出特殊的酶学特性,而且有较好的产业化开发前景。     

固氮类芽孢杆菌YUPP-5中环糊精糖基转移酶基因的克隆与功能分析

从魔芋根际分离的固氮类芽孢杆菌Paenibacillus azotofixans YUPP-5对多种β-1,4糖苷键连接的多糖具有水解作用。通过构建该菌的fosmid文库,克隆到2 157 bp的基因片段,编码环糊精糖基转移酶。大肠杆菌中表达此酶,能降解葡甘聚糖、羧甲基纤维素钠盐、几丁质、木聚糖等多种β-1,4糖苷键连接的多糖,同时该酶还能以葡甘聚糖为底物生成β-1,4糖苷键连接的环糊精,而文献报道这种酶仅能利用α-1,4糖苷键连接的淀粉为底物生成环糊精;并展示了环糊精糖基转移酶的一些新功能。     

短小芽孢杆菌2080碱性蛋白酶的纯化与性质

短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）2080碱性蛋白酶的发酵液经超滤、硫酸铵沉淀、CM Sepharose Fast Flow和DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析得到了纯化的组分。SDS-PAGE电泳分析显示其分子量约为61kDa。酶学性质研究表明,该纯化酶的最适pH为10．5,最适温度为50℃。     

黄鳝碱性磷酸酶的分离纯化及其部分性质研究

经Tris-HCl缓冲液(pH8.6)抽提,正丁醇处理,30%-75%硫酸铵分级沉淀分离,DEAE-Sepharose离子交换柱层析,Sephacryl S-200凝胶过滤纯化,从黄鳝内脏组织中分离纯化出电泳纯的碱性磷酸酶。该酶提纯倍数为564倍,比活力达到3015U/mg。酶学性质和动力学性质研究表明,该酶催化磷酸苯二钠的水解反应,最适pH值为10.2,pH小于7和大于12均不稳定;最适温度为40℃,温度高于50℃不稳定;米氏常数Km值为1.17mmo1/L。金属离子对该酶的催化活力有不同的影响,K+对该酶活力无影响,Mg2+对该酶有激活作用,Zn2+对该酶有抑制作用。       

M-26碱性木聚糖酶的分离纯化及酶学性质研究

从Bacillus pumilus M-26发酵液中分离纯化碱性木聚糖酶,进行酶学性质研究,同时制备工业用碱性木聚糖酶制剂。首先将M-26发酵液进行硫酸铵盐析,制备工业用碱性木聚糖酶干品;然后进行sephadexG-25层析脱盐和cellulose DE-52层析得以纯化。硫酸铵的饱和度50%,酶制剂的酶活可达9 000 IU/g,收率为85%;分离纯化使酶的比活为126.32 IU/mg蛋白,纯化倍数为19.89,酶的回收率12.83%;分子量约为20 ku;M-26碱性木聚糖酶的最适温度和pH分别是55℃和pH 8.0,具有一定的耐碱性;该酶无纤维素酶活性,Fe2＋对其有激活作用;Mn2＋、Zn2＋、Fe3＋、Cu2＋对其具有抑制作用。短小芽胞杆菌M-26碱性木聚糖酶具有纸浆生物漂白应用前景。     

Bacillus clarkii 7364 γ-环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达及其催化特性分析

按照大肠杆菌偏爱密码子对Bacillus clarkii 7364来源的γ-环糊精葡萄糖基转移酶(γ-CGTase)进行优化,构建γ-CGTase原核表达菌株,摸索γ-CGTase的可溶性表达条件及纯化条件,并对其催化特性进行研究。结果表明:在28℃条件下实现了γ-CGTase的高效可溶性表达,可溶性蛋白占总蛋白表达量的63%,酶活可达3 830 U/mL。经(NH4)2SO4沉淀和α-CD-Sepharose 6B亲和柱纯化后,酶蛋白纯化了12.97倍,酶收率20.31%。使用该酶对木薯淀粉进行转化,转化产物中γ-环糊精(γ-CD)的比例可达90.9%,几乎无α-环糊精(α-CD),与天然酶的79%相比提高了15%。将该基因工程菌在20 L发酵罐中发酵,10 h后酶活达到4 375 U/mL,证实了其工业化放大的可能。该酶具有非常高的转化专一性,有非常好的工业化前景。     

重组海栖热袍菌极耐热甘露聚糖酶的纯化和性质研究

研究了海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8甘露聚糖酶基因(TM_1227)的克隆、重组酶的纯化和性质.该基因全序列2010 bp,编码669个氨基酸,分子量为76.827 kD.根据氨基酸同源性分析,该β-甘露聚糖酶与Thermotoga sp.RQ2来源的β-甘露聚糖酶(GenBank登录号ACB09927.1)同源性最高,为99%.重组转化子经IPTG诱导酶比活可达39.7 U/mg蛋白.粗酶液经金属亲和层析,得到电泳纯甘露聚糖酶.以槐豆胶为底物时,该酶的最适反应温度和pH分别为95℃和pH 8.0,85℃处理30min酶活保存50%以上,很有潜力用于高温、偏碱性的造纸工业.对椰子甘露聚糖和槐豆胶的主要水解产物是不同聚合度的甘露寡糖,几乎没有单糖生成,适合生产低聚甘露糖.