草鱼鳃介导草鱼呼肠孤病毒免疫应答

采用草鱼呼肠孤病毒腹腔注射草鱼, 通过定量RT-PCR检测了12个抗病毒免疫相关基因在鳃中不同时间点的表达模式, 以了解鳃对内源性病毒的免疫应答。模式识别受体基因CiTLR3、CiTLR7、CiTLR22、CiRIG-I、CiMDA5、CiLGP2、CiNOD1和CiNOD2, 以及干扰素基因CiIFN-I的表达在注射病毒后12h、24h、48h及72h基本都上调。IgM基因的表达仅在72h上调。接头分子CiMyD88和CiIPS-1基因的表达在早期下调（6h）, 然后逐渐上升。为了证实病毒感染的可靠性, 通过RT-PCR检测了病毒VP4基因。结果表明草鱼鳃在抗病毒免疫方面发挥着重要作用。       

草鱼鳃介导草鱼呼肠孤病毒免疫应答（英文）

采用草鱼呼肠孤病毒腹腔注射草鱼,通过定量RT-PCR检测了12个抗病毒免疫相关基因在鳃中不同时间点的表达模式,以了解鳃对内源性病毒的免疫应答。模式识别受体基因CiTLR3、CiTLR7、CiTLR22、CiRIG-I、CiMDA5、CiLGP2、CiNOD1和CiNOD2,以及干扰素基因CiIFN-I的表达在注射病毒后12h、24h、48h及72h基本都上调。IgM基因的表达仅在72h上调。接头分子CiMyD88和CiIPS-1基因的表达在早期下调(6h),然后逐渐上升。为了证实病毒感染的可靠性,通过RT-PCR检测了病毒VP4基因。结果表明草鱼鳃在抗病毒免疫方面发挥着重要作用。     

cGAS/STING信号通路参与猪圆环病毒2型诱导猪肺泡巨噬细胞产生Ⅰ型干扰素

为研究猪圆环病毒2型 (Porcine circovirus type 2,PCV2) 感染的猪肺泡巨噬细胞 (Porcine alveolar macrophages,PAMs) 分泌Ⅰ型干扰素信号通路,以PCV2病毒感染PAMs为研究对象,采用酶联免疫吸附测定 (Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、实时荧光定量PCR和Western blotting,分析PCV2感染对PAMsⅠ型干扰素的诱导、cGAS/STING信号通路相关基因mRNA和蛋白表达的影响,并应用靶向cGAS和STING特异性siRNA、抑制剂BX795和BAY 11-7082,解析cGAS、STING、TBK1和NF-κB/P65在PAMs生成Ⅰ型干扰素中的作用。结果显示,PAMs感染PCV2病毒48 h后Ⅰ型干扰素的表达量显著升高 (P＜0.05),cGAS mRNA的表达量在感染48 h和72 h后显著升高 (P＜0.01),STING mRNA表达量在PCV2感染72 h后显著上升 (P＜0.01),TBK1 mRNA、IRF3 mRNA感染48 h后显著升高 (P＜0.01)。PCV2能够显著升高PAMs胞浆STING、TBK1和IRF3蛋白含量,降低胞浆NF-κB/p65的含量,促进NF-κB/p65和IRF3入核。敲低PAMs中cGAS或STING表达水平后,PCV2感染PAMs 48 h后,Ⅰ型干扰素的表达水平显著下降 (P＜0.01);BAX795抑制TBK1后,PCV2感染PAMs 48 hⅠ型干扰素的表达水平显著下降 (P＜0.01),BAY 11-7082 抑制NF-κB/P65表达后,PCV2感染PAMs 48 h I型干扰素的表达量与PCV2组相比无显著性差异 (P＞0.05)。结果表明,PAMs感染PCV2后通过cGAS/STING/TBK1/IRF3信号通路诱导Ⅰ型干扰素分泌。     

呼吸道合胞病毒感染上调Toll样受体7和3基因的早期表达

【目的】Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）7和3是两个重要的模式识别受体,分别通过识别病毒的单股和双股RNA而活化细胞。呼吸道合胞病毒（RSV）能被TLR7和TLR3识别。在RSV感染致病的早期阶段,对肺中TLR7、TLR3的表达动力学和表达丰度进行研究,并探讨其表达与肺部炎症反应的关系。【方法】我们以活RSV滴鼻感染BALB/c鼠诱导急性肺炎,在RSV感染0,1,4,8,16和24h的不同时间点,用半定量RT-PCR方法检测鼠肺TLR7、TLR3的mRNA表达,用western blot法检测核转录因子NF-κB的蛋白表达,HE染色观察肺的病理学改变。【结果】我们发现,RSV感染早期能快速上调TLR7和TLR3的基因表达水平,与正常组相比,其升高有显著性差异,并与RSV感染之间存在时间依赖关系;TLR7的反应（RSV感染1h）早于TLR3（RSV感染4 h）。肺中NF-κB在RSV感染的4 h即可被活化。RSV介导的TLR7和TLR3早期转录反应与RSV肺炎的严重程度是平行的。【结论】TLR7和TLR3确实可通过识别病毒RNA参与RSV肺炎的发生和发展,表明感染的器官在识别病毒感染和激发前炎反应时,可能经由多个TLRs。这将对开发制剂用以调节治疗性TLR配体的活性具有重要意义。     

TLR4在急性肝衰竭模型大鼠中的动态变化及意义

目的 探讨TLR4在D-Gal/LPS诱导的大鼠急性肝衰竭中的表达变化及其作用。方法 65只SD雄性大鼠随机分为正常对照组（n=5）、D-Gal/LPS模型组（n=25）、PDTC干预组（n=25）,于不同时间点检测肝功能,免疫组化观察肝组织TLR4的表达,TUNEL法观察肝脏细胞凋亡。结果 模型组大鼠4h开始ALT、AST明显升高,8h达峰值,4-24h ALT、AST明显高于正常对照组（P〈0.05）。模型组各时间点TLR4表达明显高于正常对照组（P〈0.05）。模型组凋亡的肝脏细胞数随时间的延长逐渐增多,均高于正常对照组（P〈0.05）。PDTC干预后ALT、AST水平,TLR4的表达及凋亡的肝脏细胞数低于模型组（P〈0.05）。结论 急性肝衰竭模型鼠TLR4表达增强,PDTC干预可下调其表达,提示TLR4在急性肝衰竭的发生发展中可能具有一定作用。     

赤眼鳟Mx基因全长cDNA克隆及其经GCRV攻毒后的组织表达分析

为研究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)Mx蛋白(Myxovirus resistance protein)的功能, 采用简并PCR和SMART RACE方法从赤眼鳟脾脏中克隆得到Mx基因全长cDNA, 并通过生物信息学方法分析其同源性, 再利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测其在脾、肝、肠、肾等9个组织中的表达, 以及感染草鱼呼肠孤病毒(Reovirus of Grass carp) GCRV-104后不同时间点赤眼鳟Mx的时空表达规律。结果表明: 赤眼鳟Mx基因cDNA序列(ScMx)全长2325 bp, 包含5'-UTR 40 bp, 3'-UTR 371 bp和ORF 1884 bp, 共编码627个氨基酸, 其编码的Mx蛋白分子量约为70.9 kD, 理论等电点 pI 为 8.25, 具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征; 赤眼鳟Mx与鲫鱼Mx3同源性最高; Mx在赤眼鳟脾、肝、肠、肾等9个组织中均有表达, 其中肝脏中的相对表达量最高, 脾脏次之, 肠组织中的表达量最低; 经GCRV-104病毒感染刺激后, ScMx在肝和脾组织中的表达量显著上调, 均在48h到达峰值, 分别为对照组的10倍(肝)和5倍(脾), 且在这两个组织中的表达模式相似, 均表现为先升高后下降的波动型变化趋势。研究表明ScMx参与了赤眼鳟抗GCRV-104病毒的免疫反应。       

日本鳗鲡TLR21基因的鉴定、免疫应答与启动子分析

为研究TLR21（Toll like receptor 21）在低等脊椎动物中的功能及表达调控机制,我们扩增获得了日本鳗鲡TLR21（AjTLR21）cDNA序列,其编码的蛋白具有TLR家族的共同特征。AjTLR21基因结构与其他鱼类和两栖类TLR21相同,由单个外显子编码。荧光定量结果显示,AjTLR21在血液、鳃、脾脏、中肾等11个组织/器官中转录表达,其中在血液中表达量最高。经Poly I:C诱导后8h,AjTLR21在脾脏和中肾中的表达量显著性上调;诱导后16h,AjTLR21在血液、鳃、肠和脾脏中的表达量显著性上调（P < 0.05）。双荧光素酶报告基因结果显示,在AjTLR21 5'上游调控序列-1179 bp到+117 bp存在Poly I:C调节的正调控元件。经Edwardsiella tarda诱导后16h和72h,AjTLR21分别在血液和中肾组织的表达量显著性上调,表明AjTLR21同时也参与了抗细菌免疫应答,其在机体免疫系统中的功能具有多样性。研究对于理解日本鳗鲡AjTLR21的免疫学功能具有重要的理论意义和应用价值。     

猴免疫缺陷病毒引起多形核嗜中性白细胞凋亡的可能机理

本实验目的是研究猴免疫缺陷病毒（SIV）引起多形核嗜中性白细胞（PMNs）凋亡的机理。实验用PCR技术扩增gag基因,用Western blot法测定p53和bcl-2基因的表达。结果显示PMNs在被SIV感染后随着保温时间的延长存活率下降,在感染后24h可以从PMNs中扩增出gag基因。PMNs中p53基因的表达在感染后24h增加。同时bcl-2基因的表达在对照组和SIV感染组都增加,但在SIV感染组bcl-2蛋白的表达明显低于对照组。结果揭示SIV能够感染PMNs,p53和bcl-2基因表达的改变可能是SIV感染PMNs引起细胞凋亡的机理。     

猪Mx1和牛Mx1蛋白在PK-15细胞中的表达及其对伪狂犬病病毒的抑制

目的:研究猪Mx1和牛Mx1蛋白在PK-15细胞中的表达并检测其是否对伪狂犬病病毒(PRV)具有抑制作用。方法:从IBRS-2细胞和MDBK细胞中分别调取猪Mx1和牛Mx1基因,并克隆到pc DNA3.1/myc-His(-)B,构建得到真核重组表达质粒,以脂质体转染的方法将其分别导入到PK-15细胞,从mRNA水平和蛋白质水平鉴定重组质粒在细胞内的表达情况,然后用细胞毒性试剂盒检测这两种蛋白是否对PK-15细胞具有毒性。之后,通过荧光定量PCR检测猪Mx1和牛Mx1在攻毒后不同时间、不同攻毒剂量的条件下对PRV的抑制情况,并观察100TCID50病毒攻击细胞72h后的病变程度。结果:成功克隆了猪Mx1和牛Mx1基因,经mRNA水平和蛋白质水平证实,两种重组质粒在PK-15细胞内能够正常表达。从荧光定量PCR和细胞病变的角度来看,细胞内表达的Mx1蛋白对PRV具有显著性的抑制(P0.001)。结论:猪Mx1和牛Mx1基因在PK-15细胞中表达的Mx1蛋白能够抑制PRV在胞内的复制。     

马立克氏病病毒可感染鸡大脑小胶质细胞并促进其Toll样受体15和1LB基因的转录

体外培养雏鸡大脑神经胶质细胞并纯化得到小胶质细胞。分别用马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)广西超强毒力(vv)株YL040920和弱毒疫苗株CVI988/Rispens感染小胶质细胞,每日观察病毒感染后的细胞病变效应(CPE);用免疫组织化学法检测病毒感染后小胶质细胞中MDV MEQ蛋白的表达,并用荧光定量PCR(qPCR)以及qRT-PCR法分别检测MDVmeq基因(meq-DNA)的复制以及gB基因mRNA(gB-mRNA)的转录水平。同时用qRT-PCR法检测MDV感染对小胶质细胞Toll样受体家族(TLRs)基因转录的影响。结果发现,YL040920株和CVI988/Rispens株病毒均能感染小胶质细胞,病变细胞呈多灶性脱落并形成空斑,随病变进展迅速增大并融合。可在MDV感染的小胶质细胞核内检测到MEQ蛋白,并在感染细胞中检测到meq-DNA的复制和gB-mRNA的转录。YL040920株感染的小胶质细胞中病毒载量和gB-mRNA的转录水平显著低于以相同病毒量CVI988/Rispens株感染的小胶质细胞中的相应量(P≤0.05/0.001)。MDV感染可上调小胶质细胞TLR15和TLR1LB基因的转录水平。小胶质细胞中TLR15和TLR1LB mRNA的转录水平在YL040920感染1 d后升高,于3 dpi达到最高值,到5 dpi时有所降低。检测到小胶质细胞中TLR1LB mRNA转录水平在CVI988/Rispens感染1 d后升高,到3 dpi时达最高值;而TLR15 mRNA的转录水平在3 dpi后开始升高,二者在5 dpi时均降低。比较YL040920和CVI988/Rispens对TLRs mRNA转录的影响发现vvMDV YL040920感染小胶质细胞后主要促进其TLR15基因的转录(P≤0.01/0.001),而弱毒疫苗株CVI988/Rispens感染后主要促进TLR1LB基因的转录(P≤0.001)。     

赤眼鳟Toll样受体3基因cDNA全长克隆及表达分析

为探究赤眼鳟（Squaliobarbus curriculus）Toll样受体3（Toll-like receptor 3,ScTLR3）基因是否参与抗病毒免疫反应,实验运用RACE技术,克隆得到ScTLR3基因cDNA全长序列,并进行了生物信息学分析;通过Real-Time qPCR技术,检测了ScTLR3 mRNA在健康赤眼鳟10个组织中的分布以及感染草鱼呼肠孤病毒（GCRV）后肝脏、脾脏、体肾和头肾中的表达特征。结果表明:ScTLR3基因cDNA序列全长4043 bp,包括5-非编码区（UTR）216 bp,开放阅读框（ORF）2715 bp和3-UTR 1112 bp;ScTLR3共编码904个氨基酸残基,推导的蛋白分子量102.67 kD,理论等电点8.76;SMART结构域预测显示,ScTLR3由N端的信号肽（SP）、富亮氨酸结构域（LRRs）、跨膜结构域（TM）和C端的Toll/白介素-1受体结构域（TIR）组成。实时荧光定量结果显示,ScTLR3mRNA在检测的各组织中均有表达,肝脏中的相对表达量极显著高于其他组织（P0.01）;感染GCRV后,肝脏、脾脏、体肾和头肾组织中ScTLR3 mRNA均上调表达,肝脏、脾脏和体肾组织中的相对表达量在24h达到峰值,分别为对照组的5倍、7倍和6倍。研究表明,ScTLR3具有TLRs家族基因的典型结构特征,并能被GCRV诱导表达,推测其在赤眼鳟抗GCRV入侵免疫反应中发挥了重要作用。     

Enhanced grass carp reovirus resistance of Mx-transgenic rare minnow (Gobiocypris rarus)

In the interferon-induced antiviral mechanisms, the Mx pathway is one of the most powerful. Mx proteins have direct antiviral activity and inhibit a wide range of viruses by blocking an early stage of the viral genome replication cycle. However, antiviral activity of piscine Mx remains unclear in vivo. In the present study, an Mx-like gene was cloned, characterized and gene-transferred in rare minnow Gobiocypris rarus, and its antiviral activity was confirmed in vivo. The full length of the rare minnow Mx-like cDNA is 2241 bp in length and encodes a polypeptide of 625 amino acids with an estimated molecular mass of 70.928 kDa and a predicted isoelectric point of 7.33. Analysis of the deduced amino acid sequence indicated that the mature peptide contains an amino-terminal tripartite GTP-binding motif, a dynamin family signature sequence, a GTPase effector domain and two carboxy-terminal leucine zipper motifs, and is the most similar to the crucian carp (Carassius auratus) Mx3 sequence with an identity of 89%. Both P0 and F1 generations of Mx-transgenic rare minnow demonstrated very significantly high survival rate to GCRV infection (P < 0.01). The mRNA expression of Mx gene was consistent with survival rate in F1 generation. The virus yield was also concurrent with survival time using electron microscope technology. Rare minnow has Mx gene(s) of its own but introducing more Mx gene improves their resistance to GCRV. Mx-transgenic rare minnow might contribute to control the GCRV diseases.     

变形链球菌细胞壁对EAhy926细胞TLR4、IL-6和IL-8表达的影响

【目的】观察变形链球菌细胞壁对EAhy926细胞的增殖活性、TLR4的表达和炎性细胞因子IL-6和IL-8分泌的影响,初步探讨变形链球菌致血管内皮细胞TLR4表达、炎症反应及其两者之间的关系。【方法】变形链球菌细胞壁作用于EAhy926细胞,MTT法检测EAhy926细胞的增殖活性;RT-PCR法检测EAhy926细胞TLR4、IL-6和IL-8 mRNA的表达;流式细胞术检测EAhy926细胞表面TLR4的表达;细胞生物活性方法和ELISA分别检测EAhy926细胞IL-6和IL-8的分泌;抗体阻断实验观察IL-6和IL-8的表达与TLR4的关系。【结果】不同浓度的变形链球菌细胞壁作用6 h可促进EAhy926细胞的增殖(P0.05),但12 h后可明显抑制该细胞的生长(P0.05),呈现显著的时间和剂量依赖性。变形链球菌细胞壁作用于EAhy926细胞后,TLR4 mRNA和蛋白水平的表达量随着作用时间延长而逐渐增高,在16 h达到高峰,24 h后又逐渐下降(P0.01);IL-6和IL-8的表达也呈现明显的时间依赖性增高(P0.05)。经TLR4抗体阻断后,变形链球菌细胞壁刺激EAhy926细胞IL-6和IL-8的产生明显减少(P0.01)。【结论】变形链球菌细胞壁可明显抑制EAhy926细胞的生长,上调该细胞TLR4的表达,促进炎性细胞因子IL-6和IL-8的分泌;IL-6和IL-8的产生与TLR4的表达上调密切相关。     

Cloning, characterization, and expression analysis of Toll-like receptor-7 cDNA from common carp, Cyprinus carpio L.

The Toll-like receptor 7 (TLR7) is activated by single strand RNA and RNA-like compounds (imidazoquinoline), and it induces interferon production. We identified and described carp TLR7 cDNA and its mRNA expression. The full-length cDNA of carp TLR7 gene is 3427 bp, encoding 1049 amino acids (AB553573). The similarities of carp TLR7 with zebrafish, rainbow trout, fugu, and human TLR7 were 89.6, 83.4, 80.6 and 74.6%, respectively, at the amino acid sequence level. Furthermore, the expression of TLR7 mRNA was investigated in normal tissues of carp by semi-quantitative RT-PCR analysis. Carp TLR7 expression was exhibited in healthy tissues (kidney, brain, spleen, skin, intestine, muscle, liver, gills and heart) and though the expression level in each tissue varied among healthy fish. Carp TLR7 expression was significantly increased in head kidney stimulated with TLR7 agonist, imiquimod, at 8, 24 and 48 h in vitro when compared to expression in the control group. Moreover, carp head kidney leukocytes produced elevated levels of pro-inflammatory and type 1 interferon cytokine mRNA in response to imiquimod stimulation.     

沙眼衣原体持续感染对Hela细胞TLR4/IL-6/STAT3信号通路的影响

目的：分析沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）持续感染对靶细胞TLR4/IL-6/STAT3信号通路的影响.方法：利用Hela细胞分别建立Ct急性感染及持续性感染模型,通过qRT-PCR、ELISA等方法比较Ct感染过程中靶细胞TLR4、STAT3、IL-6转录水平及细胞因子IL-6分泌量的变化.结果：Ct感染后靶细胞TLR4、IL-6、STAT3转录水平及细胞因子IL-6分泌量均呈现时间相关性上调,且持续性感染状态下比急性感染状态下的上调更为显著;IL-6/STAT3的表达量与TLR4转录水平正相关.结论：Ct持续感染过程中TLR4 的持续活化可大幅上调IL-6/STAT3信号通路表达,可能参与了Ct持续感染后慢性炎性损伤过程.     

斜带石斑鱼TLR3基因的克隆及其在刺激隐核虫感染时的表达分析

TLR3(Toll like receptor 3)是Toll样受体家族的重要成员,通过识别病原相关分子模式,诱导宿主天然免疫应答。研究从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)中克隆得到TLR3 cDNA序列,全长为2937 bp,包括107bp的5′非编码区、100 bp的3′非编码区和编码909个氨基酸的2730 bp的开放阅读框。TLR3全长氨基酸序列包含1个信号肽、18个富含亮氨酸的重复序列(Leucine-rich Repeat LRR)、1个跨膜结构域和1个胞内TIR结构域(IL-R1 homologous region)。同源比对显示,斜带石斑鱼TLR3与其他已报道硬骨鱼类的TLR3具有较高的同源性(52%—67%)。组织表达分析显示,TLR3在健康斜带石斑鱼的组织中具有较广的表达分布,其中在前脑、体肾和脾脏中表达量较高。刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)感染斜带石斑鱼后:在皮肤中TLR3的表达量呈现先降低后升高的趋势,从感染后第7天开始上调,并在第10天达到高峰;而在脾脏中,TLR3的表达量在感染6h时就显著上调并达到峰值。结果表明斜带石斑鱼TLR3在抗刺激隐核虫的免疫应答过程中可能发挥重要作用。