SUA41蛋白表达和纯化及其多克隆抗体制备

旨在制备特异性SUA41多克隆抗体,为深入研究其在植物生长发育中的功能提供有力的分子生物学和生物化学的工具。PCR扩增拟南芥SUA41基因中编码280个氨基酸(401-680位氨基酸)的特异片段,经过GATEWAY的DNA重组技术构建了原核表达载体pDEST17-SUA41,用热休克法转化到E.coliBL21(DE3)star感受态细胞,以异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出6×His-SUA41融合蛋白,用8 mol/L尿素缓冲液溶解包涵体并且经过水逐级去除尿素获得提纯的融合蛋白,并利用Western blotting鉴定确认。融合蛋白经Ni金属螯合柱亲和层析得以纯化,用SDS-PAGE进一步纯化。纯化的融合蛋白经过SDS-PAGE后切胶回收,免疫小白兔,制备多抗血清,然后用Western blotting进行检测,鉴定血清特异性和效价。结果显示,融合蛋白6×His-SUA41免疫兔,产生特异性的SUA41兔抗血清,可以检测到细菌和拟南芥组织中SUA41蛋白。用水提纯变性剂尿素溶解的包涵体蛋白具有可行性。制备的特异性SUA41兔抗血清效价高,能够有效地识别大肠杆菌表达的和拟南芥的SUA41蛋白。在有合适的对照情况下,该兔抗血清可以用于分析植物中SUA41蛋白的功能。     

中心体蛋白Cenexin在大鼠精子发生过程中的表达特征

中心体蛋白Cenexin是成熟中心粒的唯一标志分子。为阐明中心粒在大鼠精子发生过程中的成熟以及功能,我们首先通过RT-PCR技术从大鼠睾丸组织中扩增出了Cenexin cDNA片段,原核表达重组蛋白后,用其免疫小鼠制备了高滴度的抗Cenexin的多克隆抗体,然后利用免疫荧光染色、Western Blot和半定量RT-PCR方法,研究了大鼠精子发生过程中Cenexin蛋白和基因的表达特征。结果显示Cenexin mRNA水平在精原细胞和精母细胞中较高,随后表达水平下降,而蛋白质分子在精原细胞到精子细胞中都定位于细胞的一个中心粒上,表示有成熟中心粒的存在,在长形精子细胞中该蛋白位于鞭毛的基体部。附睾的绝大多数成熟精子中Cenexin免疫染色消失。中心体蛋白Cenexin在精子变态期的表达变化可能与精子鞭毛形成的起始有关。     

中心体蛋白Centrin家族在大鼠精子发生过程中的表达

中心体蛋白Centrin家族在大鼠精子发生过程中的表达@孙晓冬$中国医学科学院基础医学研究所细胞生物学系! 中国北京100005 @俞作仁$中国医学科学院基础医学研究所细胞生物学系! 中国北京100005 @李赛$中国医学科学院基础医学研究所细胞生物学系! 中国北京100005 @马静$中国医学科学院基础医学研究所细胞生物学系! 中国北京100005 @葛晔华$中国医学科学院基础医学研究所细胞生物学系! 中国北京100005 @薛社普$中国医学科学院基础医学研究所细胞生物学系! 中国北京100005 @韩代书$中国医学科学院基础医学…     

中心体蛋白Cenexin在大鼠精子发生过程中的表达特征

中心体蛋白Cenexin是成熟中心粒的唯一标志分子。为阐明中心粒在大鼠精子发生中的成熟以及功能,我们首先通过RT－PCR技术从大鼠睾丸组织中扩增出了Cenexin cDNA片段,原核表达重组蛋白后,用其免疫小鼠制备了高滴度的抗Cenexin的多克隆抗体,然后利用免疫荧光染色、Western Blot和半定量RT－PCR方法,研究了大鼠精子发生过程中Cenexin蛋白和基因的表达特征。结果显示Cenexin mRNA水平在精原细胞和精母细胞中较高,随后表达水平下降,而蛋白质分子在精原细胞到精子细胞中都定位于细胞的一个中心粒上,表示有成熟中心粒的存在,在长形精子细胞中该蛋白位于鞭毛的基体部。附睾的绝大多数成熟精子中Cenexin免疫染色消失。中心体蛋白Cenexin在精子变态期的表达变化可能与精子鞭毛形成的起始有关。     

人视黄醇结合蛋白4在杆状病毒系统中的表达及其多克隆抗体制备

旨在利用杆状病毒系统表达、制备人视黄醇结合蛋白(RBP4)并检测其免疫原性。将人RBP4基因片段及信号肽SS64片段亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-dual(pFBd)中,获得相应的重组转移质粒;转化大肠杆菌菌株DH10bac,转座后经筛选获得重组穿梭质粒rbacmid,将重组穿梭质粒转染孔板培养的Sf9细胞,获得含人RBP4表达框的重组杆状病毒,经过扩增获得毒种。毒种感染对数生长期的Sf9细胞并表达人RBP4蛋白(I-RBP4),通过SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行检测和鉴定。用毒种感染悬浮培养的Sf9细胞制备一批RBP4蛋白,完成SDS、Western blotting的检测及少量的多抗制备。纯化重组蛋白并与E.coli重组人RBP4(E-RBP4)分别免疫家兔。实验结果,酶切鉴定及测序证实重组转移质粒构建正确;成功构建重组RBP4-bacmid;人RBP4蛋白在昆虫细胞获得高效表达。表达的RBP4蛋白可以分泌到培养基中,分子量约为23 kDa,经过计算表达量为100 mg/L;纯化蛋白免疫兔子制备了多抗血清,血清滴度为1∶100 000,高于原核表达的抗体滴度(1∶10 000),与人体提纯蛋白制备的抗体滴度相近。杆状病毒系统高效表达了人的RBP4蛋白,具有较好的抗原性,并获得高亲和力的抗血清,为下一步的人血RBP4检测试剂盒的制备打下了坚实的基础。     

拟态弧菌VMH蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

目的实现拟态弧菌热不稳定性溶血素(VMH)的原核表达,制备兔抗VMH蛋白的多克隆抗体。方法根据GenBank上已有的拟态弧菌vmh基因序列,设计并合成引物,通过PCR方法扩增vmh基因。PCR纯化产物酶切后,定向插入到PET-32a表达载体构建重组表达质粒PET-32a-vmh。重组表达质粒转化至E.coli Rosetta感受态细胞,在IPTG诱导下进行VMH蛋白表达。SDS-PAGE分析重组VMH蛋白(rVMH)的表达形式,并分别采用兔血平板扩散法和Western blot检测其溶血活性和免疫反应性。用纯化的rVMH蛋白免疫新西兰大白兔,3次免疫后采集免疫血清,采用饱和硫酸铵分级沉淀结合亲和层析法纯化多克隆抗体,并检测其纯度与效价。结果重组表达质粒PET-32a-vmh诱导表达后,经SDS-PAGE分析发现分子量约为77.8kDa的rVMH蛋白主要以包涵体形式表达,该蛋白经变性复性后具有溶血活性和免疫反应性。兔抗rVMH蛋白的多克隆抗体经纯化后,其纯度达95%,ELISA效价为1∶26843545600,琼扩效价为1∶32。结论成功制备了rVMH蛋白及其多克隆抗体,为进一步采用噬菌体肽库筛选技术鉴定VMH蛋白表位提供了物质基础。     

人硫氧还蛋白cDNA的克隆、表达及其多克隆抗体制备

目的 制备硫氧还蛋白1 （thioredoxin-1,Trx-1）多克隆抗体.方法 从乳腺癌细胞系MCF-7中用RT-PCR的方法得到了Trx-1全长基因,将它克隆到原核表达载体上进行大量的表达和纯化,纯化的蛋白对新西兰大白兔进行背部多点注射,40 d后取其血清用梯度饱和硫酸铵沉淀的方法进行多克隆抗体的纯化.用ELISA和Western印迹实验测定抗体效果.结果 成功获得了Trx-1全长cDNA,通过原核表达得到了大量Trx-1蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体.结论 此多克隆抗体对Trx-1蛋白具有良好的识别能力,可以应用于Trx-1的功能研究.     

Polycomb基因家族在大鼠精子发生过程中的表达

目的检测大鼠精子发生不同阶段细胞中Polycomb-group（Pc-G）家族在mRNA水平上表达是否有差异。方法提纯大鼠精子发生过程中的精原细胞、精母细胞、圆形精子细胞以及支持细胞,用荧光定量PCR方法检测Pc-G家族基因mRNA表达量。结果Pc-G基因家族中Ezh2、Eed、Bmi-1在精子发生中后期高表达;在各生精细胞中,YY1基因表达量低于支持细胞。结论Pc-G基因家族在精子发生各阶段细胞中特征性表达,与精子发生具有相关性,可能对精子发生分化和维持遗传稳定性都有重要的作用。     

SDHB蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

SDHB(succinate dehydrogenage complex,subunit B)基因可能介导呼吸链生物功能和调控细胞生长.采用PCR技术扩增出SDHB基因,并将其连接到pGEX-4T-1原核表达载体中,经酶切及测序鉴定后,转化BL21细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体.获得了SDHB原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗SDHB多克隆抗体,为SDHB进一步的功能研究奠定了基础.     

文昌鱼BRA蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

Brachyury编码的转录调控因子BRA参与脊索动物脊索的分化形成,文昌鱼是最早具有真正脊索的后生动物类群,因此开展文昌鱼Brachyury基因功能研究,将有助于揭示脊索的起源与进化。文昌鱼具有2个Brachyury基因:Bra1和Bra2,二者编码的蛋白序列相似度高达93%,缺少有效区分二者的特异抗原表位,转录组数据分析表明Bra2表达量显著高于Bra1,进一步对BRA2蛋白序列特征分析发现其N端拥有丰富的潜在抗原决定簇,因此本研究选择了Bra2 N端696 bp基因序列所编码的蛋白片段作为制备抗体的抗原蛋白。将该段基因序列克隆重组入p ET28a原核表达质粒,经诱导表达获分子量约31 ku的可溶性重组蛋白。通过Ni2+亲和层析柱纯化,得到1.3 g/L高纯度抗原蛋白,用3只ICR小鼠(Mus musculus)经4轮重组蛋白免疫[剂量50μg/(只·次)]后获得最高效价(1︰256 000)的多克隆抗体。Western印迹结果显示,本研究制备的鼠抗文昌鱼BRA多克隆抗体不仅可特异识别重组抗原蛋白,也可高效识别文昌鱼胚胎总蛋白中的BRA1和BRA2,为后续深入研究文昌鱼BRA在脊索发育调控中的作用提供了有力的分子工具。     

Nodal蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

斑马鱼心脏发育模型中Nodal编码转录因子调节心脏的左右不对称发育,为了进一步研究Nodal信号途径在心脏发育中的调控作用和心脏疾病发生的分子机制,需要获得斑马鱼Nodal蛋白并制备其抗体.采用从斑马鱼心脏组织中提取RNA,通过反转录得到心脏组织各种表达基因的cDNA为模板,PCR扩增得到Nodal部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达.经酶切及测序鉴定后,转化Rosseta细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体.获得了Nodal原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Nodal多克隆抗体,为Nodal功能的进一步研究奠定了基础.     

雄激素受体融合蛋白的表达及其多克隆抗体的制备与纯化

将雄激素受体的ｃＤＮＡ片段克隆到表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ内,在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达,得到可溶性表达产物ＧＳＴ－ＡＲ。用该融合蛋白制得的兔多克隆抗体,经ＧＳＴ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ亲和吸附纯化后,表现出较好的抗ＡＲ的专一性,可用于ＡＲ结构和功能的研究。     

Us11的表达及其多克隆抗体的制备

已有研究发现单纯疱疹病毒1(HSV-1)感染后,病毒的Us11蛋白在拮抗宿主先天性免疫反应中发挥重要作用。通过合成HSV-1的Us11基因,克隆表达制备针对Us11的多克隆抗体,为研究Us11的功能以及与宿主蛋白的相互作用提供的实验基础。通过人工合成Us11基因并以其为模板扩增,回收Us11基因片段,克隆至原核和真核表达载体;诱导表达Us11蛋白并纯化,制备Us11兔源多克隆抗体;转染质粒至293T细胞,对细胞表达的蛋白进行间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(WB)检测。成功构建p Cold-Us11和p FLAG-Us11质粒,实现可溶性Us11蛋白表达,纯化的Us11蛋白免疫动物获得针对Us11的多克隆抗体。IFA和Western blot结果显示,制备的抗血清能特异性检测到p FLAG-Us11转染293T细胞表达的Us11蛋白。     

果蝇odd蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究

odd是一个新发现的心脏特异表达基因。为了进一步研究odd在心脏发育中的功能,根据已报道的odd基因序列,以果蝇cDNA文库为模板进行PCR扩增,将所得的odd部分编码区序列连接到pET-28a载体上构建原核表达载体;重组子经酶切测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,纯化后的His-odd融合蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体,Western Blot检测抗体活性。结果表明,获得了odd原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Odd多克隆抗体,为后续的odd功能研究奠定了基础。     

果蝇Domeless蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究

在果蝇(Drosophila melanogaster)的研究中发现Domeless接受器参与发育期间的JAK/STAT信号调节,在心脏疾病的发生机制中发挥重要作用.为了克隆Domeless,我们利用生物信息学选择果蝇Domeless基因抗原亲水区,将扩增出的PCR片段克隆到原核表达pET-28a载体中,转入E.coli(Escherichia coli)中后通过IPTG(Isopropylβ-D-thiogalactoside)诱导融合蛋白表达,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,纯化后的His-Domeless融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.用Western blot检测抗体的效价和特异性.获得了Domeless原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Domeless多克隆抗体,为后续Domeless功能研究奠定了基础.     

大鼠RVLG cDNA的克隆、原核表达和小鼠抗RVLG蛋白多克隆抗体的制备

为了识别大鼠卵巢中的生殖细胞,在原核系统中表达和纯化RVLG蛋白并制备了多克隆抗体.采用RT-PCR方法从大鼠睾丸组织中扩增获得RVLG cDNA片段,然后克隆到pMD19-T载体上进行测序,经双酶切回收目的基因片段后,将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.纯化后的GST-RVLG融合蛋白免疫昆明(KM)小鼠,最后给小鼠腹腔注射S180细胞制备抗RVLG腹水多克隆抗体.用Western blotting及免疫组织化学法鉴定RVLG腹水多克隆抗体的特异性,间接ELISA法测定该抗体的效价.序列分析表明,所克隆的RVLG cDNA片段比GenBank中报道的大鼠RVLG cDNA(NM_001077647)多60 bp,原因是由于RVLG的可变剪切方式造成的.本研究成功构建了重组表达质粒pGEX-RVLG,且GST-RVLG融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的10%以上.制备的抗体可特异性识别RVLG蛋白,其效价达1:20 000.获得的高效价、高特异性的小鼠抗RVLG蛋白腹水多克隆抗体为下阶段研究RVLG的特异性表达奠定了基础.     

人copineV蛋白多克隆抗体的制备

目的：制备兔抗人copineV多克隆抗体。方法：将copineV N端423bp（626-1048bp）构建到原核表达载体pET28a（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在IPTG诱导下进行蛋白表达;以镍柱纯化后的蛋白为抗原,与等体积佐剂混合后免疫家免3次;用ELISA和Western印迹检测抗血清,用（NH4）2SO4沉淀法初步纯化抗体。结果：表达并纯化了copineV N端蛋白,ELISA检测表明抗血清具有高亲和性,Western印迹检测表明抗体能特异性识别内源性和过表达的copineV。结论：制备了具有高亲和性和特异性的抗人copineV多克隆抗体。     

游仆虫中心蛋白在大肠杆菌中的高效表达和多克隆抗体制备

中心蛋白是一种在微管组织中心的复制和分离中起着重要作用的蛋白质。为了进一步进行中心蛋白结构和功能的研究 ,我们克隆了单细胞真核生物游仆虫中心蛋白基因并构建了重组表达质粒pGEX 6P EoCen ,其在大肠杆菌BL2 1中经IPTG诱导后获得了大量的可溶性表达 ,融合蛋白表达水平达到了细菌总蛋白的 32 6 %。GST抗体进行Westernblotting检测结果为阳性。经GST亲和层析和superdex 75凝胶层析后得到 90 %以上电泳纯的蛋白。用纯化后的蛋白免疫大鼠产生抗血清 ,经ELISA检测抗体效价达 1∶2 5 6 0