一个α,β地中海贫血复合家系β珠蛋白基因的进一步研究

 前文~[1]曾报道广西一个α,β地中海贫血复合家系的血红蛋白组成及α珠蛋白基因分析结果,并讨论了各成员可能的β珠蛋白基因结构情况。本文利用先进的PCR即基因扩增技术,结合特异寡核苷酸探针斑点杂交及扩增后直接测定DNA序列的技术,进一步研究并彻底搞请了该家系各成员的β珠蛋白基因结构情况。结果显示:母亲及两个弟弟都是编码子41—42TTCT四个碱基缺失造成框架位移所致β地中海贫血的杂合子。父亲与先证者的β基因均属正常。前三个成员均为α地贫复合β地贫,其α与β珠蛋白链合成的不均衡状态得到改善,贫血症状也明显轻。     

血红蛋白疾病基因治疗研究进展

血红蛋白疾病是由于血红蛋白分子突变造成其结构或合成异常引起的一类疾病,分为血红蛋白病和地中海贫血两大类。前者表现为血红蛋白分子的珠蛋白肽链结构异常,如镰刀状贫血;后者表现为珠蛋白肽链合成速率的降低,如β-地中海贫血。本文主要以β-地中海贫血和镰刀状贫血为例,从DNA水平、RNA水平和基因调控及干细胞移植等方面介绍血红蛋白疾病基因治疗的研究进展,并结合生命科学的最新发现,对该领域将来可能出现的新的治疗方法提出展望。     

基因编辑技术在β-地中海贫血治疗中的研究

β-地中海贫血(β-地贫)是一种全球性的单基因遗传病,目前针对该病的治疗方法除造血干细胞移植外都是对症治疗,无法达到根治效果。基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病,达到根治疾病的目的。近年,随着基因编辑技术的发展,基因治疗越来越成熟完善,在β-地贫治疗中的应用也变得广泛。目前,基因编辑技术发展经历了4个阶段,分别为ZFN技术、TALEN技术、CRISPR/Cas9技术以及单碱基编辑技术。本综述将总结上述4种基因编辑技术在β-地贫治疗中的原理、研究、优缺点以及局限性,旨在优化β-地贫的治疗策略。     

APM 和Liped两程序在β-地中海贫血特征连锁分析上的比较研究

Liped程序已广泛地应用在遗传方式明确的遗传病（或性状）家系的连锁分析上，具有精确、简便、快速和多效（如还可考虑突变的影响，以及依赖年龄的外显率等分析上）诸优点；但显然不能用于遗传方式尚未搞清的遗传病家系的连锁分析。晚近由Weeks编制的APM (Affected-Pedigree-Member,暂译为家系患者连锁分析）程序突破了Liped程序的上述局限性，具有更广泛的应用，日有更强的检测力；但该法只能估计连锁的显著性，还不能揭示连锁强度，因而还难以用于人类整个基因组的序列分析研究上。 本文以一个β-地巾海贫血特征的大家系为实例，对上述两程序作了具体的比较研究。结果表明了上述两程序分别具有的优缺点，因此在连锁分析上可相互补充。     

非连续聚丙烯酰胺凝胶电泳在珠蛋白链的分离及地中海贫血研究中的应用

首次应用非连续聚丙烯酰胺凝胶(12％和7.5％)电泳将胚胎、胎儿及成人溶血液中各种正常珠蛋白链分离。其电泳移动顺序为:α、β、Gγ、δ、Aδ、ε和ζ链,δ与Gγ链得到较好的分离。10例β—地中海贫血杂合子血样的δ链光密扫描测定结果为2.62±0.76％。重型β—地中海贫血患者的Gγ与Aγ比1.09～1.27,各类样品的α/非α链含量比约为1。结合网织红细胞体外培育,~3H—亮氨酸标记新合成的珠蛋白链,以放射性荧光自显影技术测定了五例α—地贫患者的珠蛋白链合成速率,其α/β合成比均小于1(0.79～0.89),而正常对照为0.97。在珠蛋白链的研究中,该方法具有简单、灵敏等优点。     

人地中海贫血β654基因作为外源基因用于转基因的制备方法

目的探讨人地中海贫血β654基因为外源基因用于转基因小鼠制作时,外源基因的制备方法,为进一步制作转基因小鼠打下基础。方法采用反向点杂交法确诊人地中海贫血β654纯合子DNA,以PCR法扩增获得人地中海贫血β654基因,分离纯化后,通过连接酶反应将其克隆入含βLCR调控序列的基础载体pBGT51质粒中,经PCR扩增、酶切、反向点杂交及DNA测序鉴定重组质粒,用EcoRⅤ酶切获得转基因所用的外源基因。结果将人地中海贫血β654基因作为外源基因克隆入基础载体pBGT51质粒中构建了重组质粒βBGT51,用EcoRV酶切获得含人β654基因及βLCR调控序列的6.5kb的DNA片段,制备了可用于显微注射转基因的外源基因。结论采用该方法构建的含人地中海贫血β654基因的重组质粒,可获得用于显微注射转基因的外源基因。     

基因治疗的应用研究进展

基因治疗 (ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ)是向靶细胞引入正常有功能的基因 ,以纠正或补偿致病基因所产生的缺陷 ,从而达到治疗疾病的目的 ,通常包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活等。 80年代初 ,Ａｎｄｅｒｓｏｎ首先阐述了基因治疗的概况 ;1990年美国国立卫生研究院的Ｂｌｅａｓｅ等[1] 成功地进行了世界上首例临床基因治疗 ,即腺苷脱氨酶 (ａｄｅｎｏｓｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅ ,ＡＤＡ)缺陷病的人体基因治疗 ;1991年我国首例基因治疗Ｂ型血友病也获得成功。近年来 ,这一领域的研究取得了重大进展 ,基因治疗作为一种全新的疾病治疗…     

用错配PCR技术检测中国人β-地中海贫血基因突变

β-地中海贫血(β-地贫)的分子基础主要为点突变,目前中国β-地贫人群中已发现16种点突变。我们在基因频率调查的基础上,发现我国南方95％以上的β-地贫由5种点突变所致,它们是:codon 41-42(-CTTT)缺失突变,IVS-2 nt 654(C→T)突变,codon 17     

基因治疗中的基因调控研究进展

基因治疗的目的是将导入的外源基因能够得到时序上、水平上的正确表达,其产物发挥治疗作用。目的基因表达的调控是影响基因治疗效果的一个重要因素。本文系统介绍了基因靶技术在基因治疗中的地位,提高逆转录病毒载体滴度的方法,逆转录病毒载体与目的基因序列的影响,反式激活提高目的基因应用以及对基因治疗中目的基因表达调控的展望。     

重型β-地中海贫血异基因造血干细胞移植术后的护理

目的总结异基因造血干细胞移植治疗重型β-地中海贫血的护理要点。方法对2007年12月~2014年2月在我科行异基因造血干细胞移植治疗的112例重型β-地中海贫血患儿的临床资料进行回顾性分析。结果 96例从层流病房转入普通病房治疗的患儿通过环境保护、饮食护理、心理护理等,有效地减少了并发症的发生,为家庭护理管理起到了承上启下的作用。结论精心的护理可降低儿童造血干细胞移植术后并发症发生率,促进了患儿的康复。     

人类疾病的基因治疗研究进展

<正>基因治疗(gene therapy)是指插入一个正常的或经过修饰的基因到病人体内,通过体内合成丢失的或不足的基因产物来纠正遗传的或获得性疾病的一种方法。它是基因工程技术的一大突破,有着十分广阔的应用前景。1992年10月12日-10月14日,在北京召开了“人基因治疗”为题的国际学术讨论会,本文将此次大会涉及到人类疾病的基因治疗方面的文章作一综述。     

慢病毒载体介导的转人ahsp基因的β654地中海贫血小鼠的制备

目的：经慢病毒载体介导,制备转人α血红蛋白稳定蛋白基因（ahsp）的β654地中海贫血小鼠。方法：用巢式PCR从人血DNA中获得人ahsp基因,构建含有人ahsp基因的慢病毒载体,制备假病毒,通过卵周隙显微注射手段将其导入β654地贫小鼠的受精卵,经移植至假孕母鼠输卵管,最终孕育出转人ahsp基因的β654地贫小鼠;分析小鼠体内外源ahsp基因的表达情况及其遗传稳定性。结果：共获得了8只人ahsp阳性小鼠,转基因阳性率为32%（8/25）,其中3只同时具有β654突变基因;人ahsp基因在小鼠体内的表达水平维持在小鼠自身ahsp表达量的1%左右,且可稳定遗传至子代。结论：制备了转人ahsp基因小鼠,并可遗传至子代,为在个体水平上研究α血红蛋白稳定蛋白与β地贫之间的关系提供了工具。     

中国人β—珠蛋白基因—530基序的变异性研究

应用双链ＤＮＡ循环则序法,对中国人群２０例血液学正体个体,７７例β－珠蛋白合成异常患者（４３例）及其部分亲属（３４例）的β珠蛋基因上游－５３０基序进行了序列分析。结果表明,中国人－５３０基序存在（ＡＴ）８Ｔ５,（ＡＴ）７Ｔ７和（ＡＴ）９Ｔ５三种主要的重排类型,以及一种未见报道的稀有重排类型（ＡＴ）１０Ｔ３。进一步经家系连锁分析,获得由β珠蛋白结构基因与－５３０基序重排组成的单体型,结果显示ＩＶＳ－     

应用实时定量RT-PCR技术检测b地中海贫血 珠蛋白基因的表达

为了定量检测 b 地中海贫血(b 地贫)的 a、b 和γ珠蛋白基因表达水平, 提取正常成人对照组、正常胎儿对照组和b 地贫患者组组成的样本 DNA,采用反向点杂交法（RDB）分析b 地贫各种突变类型;提取样本RNA用于进行针对a、b 和γ珠蛋白基因的荧光实时定量RT-PCR（FQ RT-PCR）。根据FQ RT-PCR原理,设计合成分别对应于a、b 和γ珠蛋白基因的3对引物和3条荧光探针,FQ RT-PCR在ABI 7700系统进行。用SPSS 10.0对实验数据进行统计学分析,分别计算正常对照组 (bA/bA,aa/aa),脐带血组(bA/bA,aa/aa),轻型b 地贫组(bT/bA,aa/aa),重型b地贫组(bT/bT,aa/aa)的a、b 和γmRNA比值,其中a/b分别为4.62±1.20、7.81±2.89、13.51±5.12、188.24±374.04;a/(b +γ)分别为4.43±1.17、0.56±0.49、9.62±4.37、2.14±1.58;γ/(b+γ) 分别为0.04±0.03、0.92±0.06、0.28±0.18、0.95±0.04。由于组与组之间均值变异范围较大,将其进行对数转换后再进行方差分析。结果表明： a/b与a/(b+γ)在所有组与组之间均有显著性差异。γ/(b+γ)除了在脐带血组和重型b地贫组之间无显著性差异外,在其他组与组之间均有显著性差异。实验说明,人类b珠蛋白基因的表达水平从正常对照组到重型b地贫组急剧下降且以重型b地贫组为最低;相反γ珠蛋白基因表达却明显升高,以重型b地贫组为最高。与正常成人对照组相比,胎儿期b mRNA水平较低但γmRNA 水平较高。因此,正常个体不同时期和不同类型b 地贫之间a、b与γ珠蛋白基因表达不同而且互相影响。 Abstract：whole blood samples were collected from 100 normal healthy adults, from umbilical cord of 33 newborn infants, 111 individuals with b-thalassemia minor (bT/bA,aa/aa) and 39 with b-thalassemia major (bT/bT,aa/aa). Prior to quantitative analysis of globin gene expression, DNA was extracted from all blood samples and used for b-thalassemia genotype analysis. Different types of b globin gene mutations were analyzed using reverse dot blotting (RDB) method. Total RNA were extracted and subjected to real-time RT-PCR for quantitative measurement of a, b andγglobin mRNA using three sets of primers and fluorescent-labeled probes, designed according to the sequences of a, b andγhuman globin gene. Real-time RT-PCR was performed in ABI 7700 system. Following the real-time RT-PCR, the mean values of a, b andγglobin mRNA were calculated and the ratios of a/b, a/(b + γ) andγ/(b + γ) were determined to characterize the relative expression levels of different globin genes among normal adult, infant, b-thalassemia minor and b-thalassemia major patients. The resultant data were analyzed using SPSS 10.0 software to determine statistical significance of human globin gene expression among normal controls and b-thalassemia patients. Due to vast variations of the mean globin gene mRNA levels among different groups, log conversion of a/b + 1, a/(b + γ) + 1 andγ/(b + γ) +1 was used for statistical analyses and intergroup comparison. The a/b globin gene mRNA ratios were determined to be 4.62±1.20, 7.81±2.89, 13.51±5.12, and 188.24±374.04 for normal healthy adult (bA/bA,aa/aa), infant (bA/bA,aa/aa), b- thalassemia minor (bT/bA,aa/aa) and b-thalassemia major(bT/bT,aa/aa) respectively. The a/(b+γ) ratios were 4.43±1.17, 0.56±0.49, 9.62±4.37, and 2.14±1.58 for normal healthy adult (bA/bA,aa/aa), infant (bA/bA,aa/aa), b- thalassemia minor (bT/bA,aa/aa) and b- thalassemia major(bT/bT,aa/aa) respectively. Theγ/(b+γ) ratios were 0.04±0.03, 0.92±0.06, 0.28±0.18, and 0.95±0.04 for normal healthy adult (bA/bA,aa/aa), infant (bA/bA,aa/aa), b- thalassemia minor (bT/bA,aa/aa) and b- thalassemia major(bT/bT,aa/aa) respectively. Following statistical analyses, the a/b and a/(b+γ) globin gene mRNA ratios were significantly different among four different groups (normal adult, normal infant, b- thalassemia minor and b- thalassemia major). The γ/(b + γ) globin gene mRNA ratio was significantly different among all groups except for between infant and b- thalassemia major patients. Human b globin gene mRNA levels decrease progressively and dramatically from normal adults to b-thalassemia patients with b-thalassemia major having the lowest levels. On the other hand, the γglobin gene mRNA levels increase progressively from normal adult to b-thalassemia patients with b-thalassemia major having the highest levels. Infants have relatively lower levels of b but higher levels of γglobin gene mRNA as compared to those in normal adults. Thus, the relative expression levels of a, b or γglobin genes varied but inter-related among different ages of normal individuals and different b-thalassemia genotypes.     

慢性疼痛的基因治疗研究进展

慢性持续性疼痛是病人就医最常见的原因.总体来说,保守治疗,如药物疗法是疼痛的一线治疗方法.局部麻醉封闭和介入技术,如脊髓刺激和鞘内药物输注系统是二线治疗方法.然而,顽固剧烈的疼痛并没有得到有效的控制.新出现的技术手段有分子或基因治疗,随着技术的发展和成熟,分子或基因治疗技术可能得到越来越广泛的应用.本文主要从慢性疼痛基因治疗的治疗策略、导入手段、调节水平以及分子生物学潜在方向等方面进行了阐述.     

用直接测定基因组DNA序列的方法检测β-地中海贫血基因突变

本文报道一种结合聚合酶链反应(PCR)技术直接测定基因组DNA中单考贝基因片段序列的方法,以及利用这种方法测定两例β-地贫纯合子的β珠蛋白基因序到结果。测定出基因点突变,一例为编码子17(A→T)突变纯合子,另一例为编码子69(G→A)突变纯合子。针对上述两个点突变合成寡核苷酸片段,末端标记~(82)P后为探针进行斑点杂交的结果与测序结果一致。