以减毒沙门氏菌为载体的小鼠肝炎病毒DNA疫苗的构建及其免疫原性

目的：构建以减毒沙门氏菌为载体的小鼠肝炎病毒DNA疫苗,研究该疫苗的免疫原性。方法：以小鼠肝炎病毒S1基因的重组真核表达质粒pVAX1—S1免疫BALB／c小鼠,ELISA检测其诱导抗体产生情况;再将重组质粒pVAX1—S1电转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建运送S1基因的重组减毒沙门氏菌SL7207（pVAX1—S1）,口服免疫BALB／c小鼠,间接免疫荧光试验鉴定减毒沙门氏菌运送的DNA疫苗的免疫原性。结果：与pVAX1空载体对照组相比,重组真核表达质粒pVAX1—S1免疫组二免及三免后抗体水平分别存在显著性差异（P〈0．05）和极显著性差异（P〈0．01）。减毒沙门氏菌运送的DNA疫苗SL7207（pVAX1—S1）诱导小鼠产生了特异性的血清抗体。结论：构建的重组减毒沙门氏菌SL7207（pVAX1—S1）具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生特异性的体液免疫应答。这为进一步研制冠状病毒新型基因疫苗奠定了基础。     

乙型肝炎病毒全S基因疫苗诱导小鼠的特异性免疫应答

乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)感染是我国常见病及多发病。ＨＢＶ难以清除的原因之一就是机体的免疫功能障碍。目前虽然基因重组ＨＢＶ表面抗原 (ＨＢｓＡｇ)疫苗预防ＨＢＶ感染取得了较好的效果 ,但基因重组ＨＢｓＡｇ疫苗主要能诱导特异性体液免疫 ,不能刺激机体的细胞免疫应答。近年来发现基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应 ,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗 ,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗[1,2 ] 。为了探讨应用ＨＢＶ基因疫苗预防ＨＢＶ感染的可能性 ,本文构建了ＨＢＶ全Ｓ基因和ＨＢｓＡｇ基因疫苗 ,观察和比…     

携带TGEV DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及安全性与免疫性分析

【目的】探讨以减毒沙门氏菌为载体,进行TGEV DNA疫苗口服免疫可行性。【方法】通过RT-PCR扩增TGEV四川株（SC-H）S基因5’端约2.1 kb的主要抗原位点片段,将其插入真核表达载体pVAX1,构建重组质粒pVAX-S,体外转染COS7细胞,间接免疫荧光检测S基因表达。通过电转化将pVAX-S转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建SL7207（pVAX-S）重组菌,并在体外感染小鼠腹腔巨噬细胞,以RT-PCR、间接免疫荧光检测细胞内S基因的转录与表达情况。将SL7207（pVAX-S）重组菌以5×108、1×109、2×109CFU剂量口服接种BALB/c小鼠,分析其安全性,并以1×109CFU剂量的重组菌3次免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA检测免疫小鼠的血清IgG与肠道粘膜IgA抗体。【结果】成功构建重组质粒pVAX-S,且重组质粒能在COS7细胞中表达。重组菌SL7207（pVAX-S）感染巨噬细胞后检测到目的基因的转录、表达。小鼠口服接种不同剂量重组菌,具有良好的安全性。免疫小鼠于二免后两周可检测到针对TGEV S蛋白的特异性血清IgG与肠道粘膜IgA抗体,且三免后两周与SL7207（pVAX1）空载体免疫组间分别存在显著性差异（P<0.05）和极显著性差异（P<0.01）。【结论】携带TGEV DNA疫苗的减毒沙门氏菌小鼠试验显示了良好的免疫原性与安全性。     

减毒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的研究进展

随着沙门氏菌基因组学的深入研究以及DNA重组技术的发展,使得对沙门氏菌进行精确的不可回复性的基因缺失减毒成为可能。减毒沙门氏菌可作为DNA疫苗载体,特异性地将其携带的质粒DNA靶向性的传递给巨噬细胞、树突细胞等抗原递呈细胞,从而有效激发相应的体液与细胞免疫应答。减毒沙门氏菌已作为疫苗载体在针对细菌、病毒、寄生虫等的DNA疫苗研究中得以广泛应用。     

减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的实验免疫效果研究

将运送H5亚型禽流感病毒DNA疫苗重组减毒鼠伤寒沙门氏菌以1.0×1010CFU剂量口服接种1日龄SPF雏鸡,结果表明重组菌对雏鸡具有良好的安全性。将重组菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-HA)以2×109CFU的剂量两次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡,同时,将重组菌分别与pVAX1-IFN-γ或pVAX1-IL2(200μg/只)联合免疫,通过测定小肠粘膜抗体效价,结果显示,重组菌单独免疫组和联合免疫组能激发机体产生粘膜免疫应答,且与空载体组、空白对照组以及油苗组之间存在显著性差异(P<0.05)。攻毒后,免疫保护结果显示无论是重组菌单独免疫组还是联合免疫组均与空载体组和空白对照组之间存在显著性差异(P<0.05),而重组菌单独免疫组与联合免疫组之间不存在显著性差异,说明重组菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-HA)能够提供机体抵抗HPAIV H5亚型强毒攻击的良好的免疫保护作用,这为进一步筛选出基于粘膜免疫途径的新型禽流感基因工程疫苗奠定了基础。     

运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌载体系统

减毒沙门氏菌通过自然感染的方式高效地将DNA疫苗直接运送给体内的抗原提呈细胞(APCs)如树突细胞(DCs)和巨噬细胞,在粘膜和全身淋巴组织诱发以Th1型应答为主的细胞免疫和体液免疫,APCs尤其是DCs可能在其中起到了关键作用.减毒沙门氏菌已被应用于运送病毒、细菌和肿瘤DNA疫苗并取得一定效果,该途径所诱发的细胞免疫要强于肌注途径接种的相同DNA疫苗,原核表达的重组沙门氏菌和接种蛋白质抗原等免疫方法.本文还对如何增强携带DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌的免疫效果作了探讨.     

运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌载体研究

减毒沙门氏菌通过自然感染的方式高效地将DNA疫苗直接运送给体内的抗原提呈细胞（APCs)如树突细胞（DCs)和巨噬细胞,在粘膜和全身淋巴组织诱发以Th1型应答为主的细胞免疫和体液免疫,APCs尤其是DCs可能在其中起到了关键作用。减毒沙门氏菌已被应用于运送病毒,细菌和肿瘤DNA疫苗并取得一定效果,该途径所诱发的细胞免疫要强于肌注途径接种的相同DNA疫苗,原核表达的重组沙门氏菌和接种蛋白质抗原等免疫方法。本文还对如何增强携带DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌的免疫效果作了探讨。     

乙型肝炎病毒全S基因疫苗诱导小鼠的特异性免疫应答

乙型肝炎病毒(HBV)感染是我国常见病及多发病.HBV难以清除的原因之一就是机体的免疫功能障碍.目前虽然基因重组HBV表面抗原(HBsAg)疫苗预防HBV感染取得了较好的效果,但基因重组HBsAg疫苗主要能诱导特异性体液免疫,不能刺激机体的细胞免疫应答.近年来发现基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗[1,2].为了探讨应用HBV基因疫苗预防HBV感染的可能性,本文构建了HBV全S基因和HBsAg基因疫苗,观察和比较了这两种疫苗经肌肉注射接种到Balb/C小鼠体内后的细胞及体液免疫功能的变化.     

减毒鼠伤寒沙门氏菌运送的鸡传染性支气管炎病毒s1基因DNA疫苗及其免疫效力研究

为研制鸡传染性支气管炎新型基因工程疫苗,构建和表达了运送鸡传染性支气管炎病毒(IBV)DNA疫苗的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。首先将鸡传染性支气管炎病毒M41株的全长s1基因插入到嵌合CpG DNA的真核表达质粒pVAX1中,构建出重组真核表达质粒pVAX1-S1-CpG。然后将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建出运送DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)。将重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)分别以1×109CFU,5×109CFU,1×1010CFU的剂量滴鼻和口服接种4日龄雏鸡,2周内所有试验鸡均无任何不良反应,试验结果表明重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)具有良好的安全性。在免疫后35 d,商品鸡体重测定结果表明重组菌免疫不影响鸡体增重。以5×109CFU重组菌滴鼻和口服两次接种4日龄商品代伊莎褐蛋鸡,二免3周后,血清抗体和小肠黏膜抗体测定结果表明,SL7207(pVAX1-S1-CpG)免疫组抗体水平与空白对照组、空载体对照组之间分别存在极显著性差异(P<0.01)。攻毒试验结果表明,重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)免疫组有较高的免疫保护效力,与灭活苗和减毒苗效力相当,显示出一定的应用前景。     

携带新城疫病毒DNA疫苗的鼠伤寒沙门氏菌及其安全性与免疫效力

根据GenBank中发表的新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因序列,设计一对引物,通过RTPCR扩增出鹅源新城疫病毒分离株JS5F基因,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1,获得重组真核表达质粒pVAX1F。将pVAX1F转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1F)。重组菌以不同剂量口服免疫1日龄雏鸡,结果表明,细菌对雏鸡具有良好的安全性,且不影响鸡的增重。将SL7207(pVAX1F)分别以108CFU和109CFU的剂量3次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡,抗体检测结果显示,在三免后1周,SL7207(pVAX1F)109CFU剂量组的血清抗体效价与空载体组之间存在显著性差异(p<0.05)。重组菌两个剂量组在首免后2周开始出现粘膜抗体,并于二免后2周和3周达到较高水平。免疫保护试验结果显示,SL7207(pVAX1F)109CFU剂量组的保护率为77.27%,与空载体组之间存在显著性差异(p<0.05)。     

减毒鼠伤寒沙门菌体内定位分析…

分析减毒鼠伤寒沙门菌口服感染后在小鼠体内定位的情况.将构建的红色荧光蛋白(RFP)原核质粒pYA33-DsRed,以电穿孔法转化减毒鼠伤寒沙门菌X4550,重组菌命名为X4550(33-DsRed).重组菌分别感染巨噬细胞RAW264.7和骨髓源树突状细胞(BMDC),并用流式细胞术检测红色荧光细胞荧光强度.此外,以不同剂量重组菌口服免疫BALB/c小鼠,并于免疫后1d、2d、3d、5d、7d取小鼠脾、肝、肠系膜淋巴结(MLN)、派伊尔氏结(PP)、腹股沟淋巴结(ILN)细胞,检测各组织器官中的红色荧光阳性细胞百分率.重组菌对RAW264.7细胞和BMDC均具有良好的侵袭力.口服小鼠后,第1d,仅在MLN及PP中检测到RFP阳性细胞,其中PP中阳性细胞达到1.4%;第2 d,在ILN中达到0.4%;第3 d,各个组织器官中RFP阳性细胞均有上升趋势,此时在脾、肝中也检测到RFP阳性细胞.第5 d,RFP阳性细胞均减少,第7 d则未检测到任何RFP阳性细胞.减毒鼠伤寒沙门菌具有良好的侵袭力,其黏膜移行方式以及对免疫组织器官靶向定位性,在优化黏膜疫苗以及提高疫苗免疫效力等方面都具有重要作用.     

以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的人呼吸道合胞病毒F蛋白DNA 疫苗滴鼻免疫抗体分析

[目的]以减毒鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium aroA strain SL7207,SL7207)为载体携带可表达呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial vrius,RSV)密码子优化的融合蛋白(Fusion glycoprotein,F)的真核表达质粒,探讨不同黏膜免疫途径及密码子优化对免疫效果的影响.[方法]通过对RSV野生型F基因(Fwt)进行密码子优化,获得密码子优化的F基因(Fsyn),并构建可表达Fsyn的真核表达质粒pcDNA3.1/Fsyn,转化SL7207得到SL7207/pcDNA3.1/Fsyn.分别经滴鼻和灌胃途径,免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA方法比较免疫效果.[结果]与灌胃组相比,滴鼻组诱导小鼠产生了更高水平的血清IgG和黏膜SIgA,获得了更好的免疫效果(P＜0.05).与野生型相比,密码子优化的F蛋白具有更好的免疫原性(P＜0.05).[结论]经滴鼻途径免疫和密码子优化能够提高以SL7207为载体的RSV DNA疫苗免疫效果.     

稳定携带山羊痘病毒DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建

为构建质粒稳定型山羊痘DNA疫苗,采用PCR与限制性酶切技术去除真核表达质粒pcDNA3.1(+)的氨苄抗性bla基因启动子序列,构建改良质粒pmcDNA3.1(+),然后插入山羊痘病毒P32基因,获得重组表达质粒pmcDNA3.1-P32,通过TSS法将其转化至减毒沙门氏菌中,构建成功携带山羊痘DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌SL7207(pmcDNA3.1-P32);体内和体外试验结果表明,重组质粒pmcDNA3.1-P32在沙门氏菌中的稳定性显著高于pcDNA3.1-P32。这为下一步减毒沙门氏菌介导的山羊痘DNA免疫研究奠定了基础。     

重组质粒在减毒沙门氏菌中的稳定性及其对细菌侵袭力的影响

将含有外源基因的重组真核表达质粒pcDNA3-F和pCI-F转化减毒鼠伤寒门氏菌,探讨质粒类型和插入片段对重组质粒在细菌内的稳定性和细菌侵袭力的影响。结果表明,外源质粒可降低减毒沙门氏菌在体外的增殖能力和侵袭力,也影响细菌在鸡体内的存活力;就质粒类型而言,pCI的影响大于pcDNA3,而以携带外源基因的重组质粒影响较为显著;外源基因插入也影响质粒在宿主菌内的稳定性。提示利用减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗研究时,要考虑质粒类型与其在宿主菌内稳定性的关系、携带外源基因重组质粒对载体菌侵袭力和存活力的影响等问题。     

Efficacy of a DNA vaccine delivered in attenuated Salmonella typhimurium against Eimeria tenella infection in chickens

The efficacy of an oral DNA vaccine carrying the Eimeria tenella 5401 antigen gene delivered by attenuated Salmonella typhimurium was examined in an experimental challenge study. The DNA vaccine preparation was made by transforming the recombinant plasmid pcDNA3-5401 into the attenuated S. typhimurium strain (Dam(-) and PhoP(-)) (designated hereafter as ZJ111/pcDNA3-5401). The chickens were randomly divided into six groups, 50 per group. Group A were given PBS as control. Chickens in group B were fed with 10(8) colony forming units (CFU) of attenuated S. typhimurium carrying pcDNA3. Group C were immunised with 100 microg of the recombinant 5401 protein via intramuscular injection. Groups D to F orally received ZJ111/pcDNA3-5401 at doses of 10(7), 10(8) and 10(9)CFU per chicken, respectively. All immunisations were boosted 2 weeks later. The immunised chickens were challenged with 6x10(4) homologous sporulated oocysts 14 days after the second immunisation. No significant differences in body weight were detected between the groups before immunisation and at week 4 after the booster immunisation. The ZJ111/pcDNA3-5401 was eventually eliminated from the spleen and liver on week 6 post-immunisation. The plasmid pcDNA3-5401 was stably maintained in over 80% of the attenuated S. typhimurium population after 100 generations of growth in antibiotic-free media. Oral immunisation of chickens with ZJ111/pcDNA3-5401 elicited specific humoral responses and stimulated proliferation of peripheral blood lymphocytes. The lymphocyte proliferation response was significantly higher in all vaccinated groups than in the control chickens. Antibody response was significantly lower in group C than in groups immunised with strain ZJ111/pcDNA3-5401. Vaccination with the strain ZJ111/pcDNA3-5401 at 10(8) (group E) and 10(9) (group F) CFU per chicken provided 55.0 and 57.5% protection against E. tenella challenge, respectively. These results have important implications for the development of DNA vaccines against avian coccidiosis by bacteria-vectored oral delivery system.     

用体内激活的启动子调控HCV核心抗原表达可增强重组鼠伤寒沙门氏菌的免疫原性

为提高抗原表达质粒在重组伤寒沙门氏菌中的稳定性以增强重组伤寒沙门氏菌诱导的免疫应答 ,克隆鼠伤寒沙门氏菌pagC基因启动子 ,以其为转录调控元件构建HCV核心抗原表达质粒 ,转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌中。体外培养时 ,Mg2 能够剂量依赖性抑制该重组菌表达HCV核心抗原。将该重组菌和组成性表达的重组菌分别口服接种BALB/c小鼠 ,观察质粒的稳定性和小鼠的免疫应答。结果表明 ,体内激活的pagC基因启动子能明显提高质粒在重组鼠伤寒沙门氏菌中的稳定性和增强重组菌诱导的体液和细胞免疫应答 ,这为发展高效免疫、成本低廉的口服丙肝疫苗提供了一个新思路     

以减毒沙门氏菌运送的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的构建及其对小鼠的免疫原性

根据GenBank中已发表的H5亚型禽流感病毒HA基因序列,设计一对引物,通过RTPCR扩增鹅源H5亚型高致病力禽流感病毒HA基因,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1和asdpVAX1得到重组表达载体pVAX1HA和asdpVAX1HA。将重组质粒转染P815细胞,经间接免疫荧光试验证实,HA基因在细胞内得到了瞬时表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550得到两种运送DNA疫苗的重组沙门氏菌X4550（pVAX1HA）和X4550（asdpVAX1HA）,以1×109CFU/只的剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠不仅可以检测到HA特异性的血清抗体应答,而且还能抵抗稳定表达H5亚型禽流感病毒HA基因的P815肥大细胞瘤的攻击,说明该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒,并且能够刺激机体产生保护性免疫应答。