新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的：利用酵母Pichia pastoris蛋白表达系统,表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白。方法：根据新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白(MPAFP5)基因序列设计引物,并分别在5’引物和3’引物中引入了EcoRI和SalI酶切位点,经PCR扩增MPAFP5基因成熟肽序列后与pGEX4T-1载体相连,再将MPAFP5从pGEX4T-1载体上切下亚克隆至穿梭质粒pGAPZαA上,获得的重组穿梭质粒pGAPZαA-MPAFP5,经线性化后采用电转化法将重组穿梭质粒转入酵母细胞SMD1168内,Zeocin^ 筛选鉴定重组子,小瓶发酵后取上清作SDS-PAGE检测,并用Western-blot检测表达蛋白的正确性。结果：MPAFP5成功地在酵母表达系统获得表达,Western-blot检测表明表达产物为准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白。结论：酵母表达系统能够高效表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白,为高密度发酵大量生产抗冻蛋白奠定了基础。     

准噶尔小胸鳖甲融合抗冻蛋白活性的比较研究

为了比较准噶尔小胸鳖甲Microdera punctipennis dzhungarica原核表达的不同融合抗冻蛋白活性是否存在差异,分别利用重组表达质粒pGEX-4T-1-Mpafp5和pMAL-p2x-Mpafp5在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达融合抗冻蛋白GST-MpAFP5和MBP-MpAFP5,并利用亲和层析纯化蛋白。SDS-PAGE分析结果证明获得了两种高效表达纯化的GST-MpAFP5和MBP-MpAFP5融合蛋白。在浓度为0.5 mg/mL时,两种蛋白的热滞值分别为0.51℃和1.336℃,其溶液冰晶形态均为棱型。抗冻保护实验结果显示： 准噶尔小胸鳖甲两种融合抗冻蛋白均能够显著提高细菌在低温下的存活率,并且MBP-MpAFP5对细菌的保护效果显著高于GST-MpAFP5。研究结果对于准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白的应用具有重要的理论意义。     

准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698在真核细胞中的表达与鉴定

目的:构建真核表达质粒pEGFP-N1-mpafp698,转染人胚肾293T细胞,并表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698.方法:PCR扩增出mpafp698序列,将其克隆入本室保存的真核表达载体pEGFP-N1中,转染293T细胞;利用RT-PCR、流式细胞仪、免疫荧光、Western 印迹检测蛋白表达.结果:构...     

准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MPAFP5毕赤酵母表达产物的理化性质

研究准噶尔小胸鳖甲Microdera punctipennis dzhungarica Kasz抗冻蛋白MPAFP5真核表达产物的功能及理化性质。首先用硫酸铵浓度梯度沉淀初步纯化酵母真核表达产物,然后通过细菌低温保护实验检测抗冻蛋白MPAFP5低温保护功能,同时探讨抗冻蛋白MPAFP5在酸碱环境和100℃时的稳定性,并通过等电聚焦凝胶电泳检测其等电点。研究表明MPAFP5真核表达产物在低温下能够提高细菌的存活率,能够耐受高温和一定程度的强酸强碱,其等电点约为5.8左右。准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MPAFP5真核表达产物与赤翅甲抗冻蛋白(DAFP)的比较表明拟步甲类昆虫抗冻蛋白具有相似的理化性质。     

荒漠甲虫光滑鳖甲和小胸鳖甲抗冻蛋白基因及其3'-UTR的序列分析

拟步甲科昆虫光滑鳖甲Anatolica polita Kaszab和小胸鳖甲Microdera punctipennis Kaszab分别是新疆准噶尔盆地荒漠地区的广布种和特有种。它们的生活习性有很大差异,光滑鳖甲白天活动,且活动范围广,而小胸鳖甲喜阴避光夜晚活动,活动范围小,但在两者体内都发现有多拷贝的抗冻蛋白基因,并且抗冻蛋白基因在夏季也有表达。为了比较这两种昆虫的抗冻蛋白序列以及不同时期表达的抗冻蛋白序列的差异情况,本研究分别以光滑鳖甲和小胸鳖甲的过冬和夏季成虫为材料,根据已克隆的抗冻蛋白基因序列设计通用引物,扩增新的抗冻蛋白基因及其3'-非翻译区(3'-UTR)。序列分析结果表明,无论是冬季还是夏季表达的抗冻蛋白在两种昆虫中都具有拟步甲科昆虫抗冻蛋白的特点,即含有不同数量的"TCTXSXXCXXAX"12个氨基酸的重复序列;光滑鳖甲抗冻蛋白基因的变异性大于小胸鳖甲,并且在重复基序的保守位点都有突变现象。小胸鳖甲抗冻蛋白在C末端有较大变异。光滑鳖甲抗冻蛋白基因的3'-UTR区变异较大,而小胸鳖甲抗冻蛋白基因的3'-UTR区几乎没有变异。推测两种昆虫抗冻蛋白及抗冻蛋白基因3'-UTR的变异性可能与抗冻蛋白的表达调控以及昆虫对微环境的适应性有关。     

准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因Mpafp149的生物信息学分析

利用生物信息学方法对准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因Mpafp149所编码蛋白MPAFP149进行分析,分别从氨基酸组成、理化性质、二三级结构和功能、进化关系等方面进行预测。结果表明MPAFP149与其他昆虫抗冻蛋白在氨基酸水平上具有79％的相似性,二级结构上预测其为水溶性蛋白,含有信号肽和跨膜区。三级结构上与黄粉虫抗冻蛋白YL-1具有较高的相似性,并且具有昆虫抗冻蛋白所特有的结构域。本研究为准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白功能的研究鉴定了基础。     

小胸鳖甲热激蛋白基因(Mphsp70)的克隆、序列分析及温度对其表达的影响

采用RACE-PCR技术,从荒漠甲虫小胸鳖甲Microdera punctipennis Kaszab克隆hsp70基因全长cDNA序列,命名为Mphsp70。测序结果表明,序列全长2207bp,该序列覆盖了完整编码区,编码647个氨基酸,分子量大小为70.69ku,理论等电点为5.57(GenBank登录号JF421286.1)。此序列包含142bp的5'端非翻译区和124bp的含有多聚腺苷酸信号序列AATAAA和poly A尾的3'端非翻译区以及1941bp的开放阅读框。该基因无内含子,符合诱导型Hsp70的特征。经BLAST检索分析,由Mphsp70的核苷酸序列推定的氨基酸序列与已知的光滑鳖甲Hsp70高度同源,同源性高达97.22%。通过荧光定量RT-PCR技术研究昆虫受到高温胁迫时该基因的表达,结果表明:经37℃和42℃处理昆虫1h后诱导昆虫体内hsp70的表达,其表达量分别为对照组(25℃)的21.57倍和389.3倍,随着处理时间的延长,表达量降低。该研究结果为深入研究小胸鳖甲的抗逆机理提供了新的思路。     

准噶尔小胸鳖甲短时低温胁迫响应的转录组分析

【目的】拟步甲科昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis是分布于中国新疆古尔班通古特沙漠的特有物种,具有很强的耐寒性,但其低温响应的分子机制尚不明确。本研究旨在利用转录组测序技术丰富小胸鳖甲的已知基因信息,分析在短时低温胁迫下,上调表达基因的主要类群及参与的主要代谢通路。【方法】利用Trinity软件对分别在4℃低温和25℃(对照)下处理3 h的小胸鳖甲成虫RNA-Seq数据进行从头组装,利用Blast2go软件进行基因注释。通过DESeq和GFOLD软件分析差异表达基因,并对上调表达基因进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢途径富集分析。【结果】测序过滤后得到68 165 001个有效读序,51 712个平均长度为984 bp的非冗余基因,其中29 925个基因(约57.87%)有同源序列(E-value10-5),与拟步甲科的赤拟谷盗Tribolium castaneum相应基因相似性最高(核苷酸序列一致性为72.75%)。低温响应上调表达基因有514个,富集到35个GO类群,18个KEGG途径。其中胁迫响应类群、生物调节类群和免疫系统过程类群都占有重要比例,嘌呤代谢、硫胺素代谢、糖酵解/糖异生等代谢通路显著富集。在胁迫响应类群中,热激蛋白Hsp90基因、超氧化物歧化酶(SOD)基因和钙联接蛋白Calnexin基因等8个非生物胁迫相关基因显著上调表达。【结论】荒漠昆虫小胸鳖甲低温转录组揭示,在4℃冷驯化过程中,代谢过程、胁迫响应、生物调节和免疫系统等生物学过程相关基因表达显著上调,其中几个非生物胁迫响应基因提示小胸鳖甲可能从分子伴侣、细胞周期阻滞、线粒体稳定性、抗氧化胁迫等多方面应对低温胁迫。KEGG富集分析所揭示的小胸鳖甲在低温下的转录组代谢通路与其他物种有较大差异。研究结果为后续生物信息学分析及小胸鳖甲耐寒关键基因的发掘及耐寒机制的揭示提供了基础数据。     

植物抗冻蛋白及抗冻性分子改良

概述了植物抗冻蛋白及其相关基因的研究现状,主要包括植物低温诱导蛋白、具有热滞活性的植物抗冻蛋白及其相关基因的分离、鉴定与表达调控,以及植物抗冻性基因工程研究动态.在此基础上,讨论了该领域研究中的主要问题、发展趋势及近期研究热点.     

洛氏脊漠甲抗冻蛋白基因的克隆、表达和功能检测

为了研究抗冻蛋白基因是否在新疆荒漠昆虫洛氏脊漠甲 Pterocoma loczyi 中存在,利用 RT-PCR 技术克隆获得了洛氏脊漠甲抗冻蛋白的 cDNA 片段,命名为 Plafp743。测序结果表明洛氏脊漠甲 Plafp743 所编码的蛋白质由 94 个氨基酸组成,蛋白序列呈现规则结构 CTX₁X₂X₃X₄CX₅X₆X₇X₈X ₉。利用原核表达载体构建重组质粒 pGEX-4T-1-Plafp743,转化 Escherichia coli BL21 进行融合蛋白表达,SDS-PAGE 结果表明抗冻蛋白PLAFP基因以可溶性融合蛋白形式表达,相对分子质量 36 kD。用 Glutathione Sepharose 4B 亲和柱对表达蛋白进行纯化后,通过赤翅甲 Dendroides canadensis 抗冻蛋白的小鼠抗血清进行 Western blot 分析,结果表明纯化的 GST-PLAFP 融合蛋白与赤翅甲抗血清能够发生特异性的免疫反应。大肠杆菌的低温抗冻保护实验结果证明,30 μg/mL 的 GST-PLAFP 在-6℃ 对细菌具有显著的保护作用,且随着抗冻蛋白浓度的增加,抗冻保护作用的效 果也随之增加。本研究首次报道了从荒漠昆虫洛氏脊漠甲扩增得到抗冻蛋白基因,提示抗冻蛋白可能是荒漠昆虫普遍采取的过冬生存策略,为进一步开发利用昆虫抗冻蛋白奠定了基础。     

赤翅甲抗冻蛋白基因的原核表达及蛋白生物活性检测

根据GenBank中序列人工合成赤翅甲Dendroides canadensis的抗冻蛋白基因（afp）,将其克隆到载体pGEX-4T-1上,构建融合表达的重组质粒,转化大肠杆菌 BL21并进行原核表达。通过优化表达的诱导条件和SDS-PAGE检测,证明人工合成的赤翅甲抗冻蛋白基因能够特异性地表达,并以可溶性融合蛋白形式存在,相对分子质量约为40 kD。抗冻蛋白的生物活性检测表明,赤翅甲的抗冻融合蛋白能够提高细菌的耐寒能力。     

两种色型黄粉虫抗冻蛋白cDNA克隆、序列分析与表达分析

产生抗冻蛋白(antifreeze proteins, AFPs)是大多数昆虫抵抗低温的一个重要策略。为给黄粉虫Tenebrio molitotr耐寒机理研究提供参考, 本研究采用RT-PCR、 5′ RACE和3′ RACE法克隆了黄、 黑两种色型黄粉虫幼虫的抗冻蛋白基因Tm-afp, 分析了其基因序列及所编码的氨基酸序列, 并检测了其在这两种色型间的mRNA水平差异。结果表明： 从黄、 黑两种色型黄粉虫幼虫克隆出的Tm-afp cDNA全长分别为579 bp和588 bp, 它们包含一个20 bp的5′端非翻译区、 一个402 bp的开放阅读框和一个变异较大的3′ 端非翻译区, 其碱基序列一致性为95%。由于这两个抗冻蛋白基因编码的蛋白成熟肽存在两个氨基酸差异： 第35位（D→E）和130位（T→S）, 因此将其判定为黄粉虫抗冻蛋白基因Tm-afp的两个异构体, 并分别命名为Tm-afp-1和Tm-afp-2。Tm-afp-1和Tm-afp-2编码的抗冻蛋白异构体（分别为Tm-afp-1和Tm-afp-2 ）信号肽之间有3个氨基酸差异： 第2位（G→A）、 9位（S→T）和27位（Y→N）; 其成熟肽的第一个氨基酸为谷氨酰胺, 含8个高度保守的12 aa短串联重复序列, 每个重复序列的第2位和第8位为半胱氨酸。此外, Tm-afp-1和Tm-afp-2均属富含苏氨酸和半胱氨酸的昆虫抗冻蛋白, 其二级结构均由大量的β-折叠和无规则卷曲组成, 三级结构为8个特殊的右手β-螺旋, 每一圈螺旋由12个氨基酸组成; 在β-螺旋的一个侧面规则排列着由保守XCT形成的β折叠片层。同时, 低温可以诱导黄、 黑两种色型黄粉虫Tm-afp的表达, 但长时间低温诱导下黑色型黄粉虫幼虫的Tm-afp表达量显著高于黄色型黄粉虫幼虫Tm-afp表达量。结果提示, 黄粉虫种内不同色型间, 抗冻蛋白基因Tm-afp可能存在多种异构体, 并且黑色型黄粉虫Tm-afp比黄色型黄粉虫Tm-afp对低温的应答更强烈。这一研究结果为进一步探索黄粉虫的耐寒性机理提供了有益参考。     

黄粉甲抗冻蛋白AFP84a在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

为表达和纯化黄粉甲Tenebrio molitor抗冻蛋白, 采用RT-PCR方法扩增得到黄粉甲抗冻蛋白基因afp84a cDNA, 将其连接到pMAL-p2X质粒上, 构建分泌型融合表达载体pMAL-p2X-afp84a, 并在大肠杆菌Escherichia coli TBI中表达; 进一步利用Amylose柱亲和纯化出该重组蛋白, 后利用细菌抗寒性检测重组蛋白的生物活性。结果显示: 融合蛋白含量占总可溶蛋白的40%。SDS-PAGE分析表明, 用MgSO4处理法与超声波细胞破碎法均可使融合蛋白从细胞中释放; 融合蛋白经Amylose柱亲和纯化, Factor Xa因子酶切, 电泳显示获得的目的蛋白呈单一条带。细菌抗寒性检测表明该重组蛋白具有较高的抗冻活性。黄粉甲抗冻蛋白基因afp84a cDNA的克隆、 原核表达为进一步研究抗冻蛋白的性质和应用提供了有用的实验材料。     

荒漠昆虫小胸鳖甲抗菌肽Attacin基因的克隆及低温表达模式分析

昆虫在低温冷驯化过程中会发生很多基因表达的改变, 从转录组层面上开展广泛的研究有助于全面认识昆虫对冷响应的分子机制。为了对荒漠昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis的 4℃低温转录组数据中一个上调表达的Attacin基因（MpAttacin1）进行深入了解并分析其对低温诱导的响应情况, 本研究通过生物信息学分析对该基因进行了鉴定, 并利用实时荧光定量PCR对其在低温下的mRNA水平进行了检测。结果表明： 获得的MpAttacin1 cDNA长度为523 bp, 包含一个456 bp的开放阅读框和67 bp的5′端非翻译区。MpAttacin1编码含有151个氨基酸残基的多肽, N端含有17个氨基酸的信号肽序列。同源性分析表明, 其氨基酸序列与其他鳞翅目、 双翅目和鞘翅目昆虫的抗菌肽Attacin具有30%~40%的一致性。以邻接法（neighbor-joining, NJ）构建的系统进化树表明, 小胸鳖甲Attacin1与其他鞘翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先, 属于Attacin_C超家族。实时荧光定量PCR分析结果显示, 在4℃与-4℃低温胁迫时, MpAttacin1基因的转录都呈现先升高后降低的应激反应趋势, 但在对低温的响应时间和强度上有所不同。在4℃处理5 h和9 h后, MpAttacin1的表达量分别为对照组的2.3和3.8倍, 而在-4℃处理7 h和9 h后, 分别为对照组的2.4和1.5倍。这些研究表明, 除已知的抗菌功能外, Attacin在昆虫的低温适应过程中可能也发挥着重要的作用。