Ca2+对非细胞体系细胞核重建影响机制的研究

研究Ｃａ＾２＋与非细胞体系细胞核重建的关系以及Ｃａ＾２＋的作用机制,结果显示：Ｃａ＾２＋对非细胞体系中核装配有抑制作用,随着Ｃａ＾２＋浓度的增加,抑制核装配作用增加,在Ｃａ＾２＋作用的早期（作用１０分钟后）中入ＥＧＴＡ,可以部分地逆转Ｃａ＾２＋的抑制作用,Ｃａ＾２＋作用１小时后再加入ＥＧＴＡ,不再有逆转作用。对Ｃａ＾２＋作用机制的研究结果显示,不是由于ＡＴＰ和ＧＴＰ被沉淀而导致细胞核组装被抑制,Ｃ     

甲藻染色体在非细胞体系核重建过程中核小体的组装

利用纯化的原始真核生物寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii E.）染色体,使之与非洲爪蟾（Xenopus laevis L.）S期卵提取物温育,发现甲藻染色体经历了一系列去凝集、再凝集的形态变化,最后形成类似典型高等真核生物的间期核结构。小球菌核酸酶酶切分析表明,不具备组蛋白和核小体结构的甲藻染色体在非洲爪蟾卵提取物中进行了核小体装配,此过程与DNA序列本身、核膜以及核纤层蛋白（Lamin）是否存在无关,但部分拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）参与了这个过程,说明核小体的组装并非为核重建所必需,决定染色体高级结构的因素并不在DNA本身,而可能是非细胞体系中的组蛋白和非组蛋白。     

四膜虫(Tetrahymena shanghaiensis)大核核仁与去膜大核能诱导非细胞体系核重建

外源DNA或染色质在非洲爪蟾卵提取物中可以诱导细胞核样结构的重建。重建核除不具有核仁样结构外,在其它形态结构上与真核细胞核十分相似。前人的工作表明在重建核中具有核仁前体结构。但可能是由于缺少活性核仁组织者的缘故,这些核仁前体不能相互融合形成新生核仁。那么活性核仁组织者在重建核中是否能发挥其功能呢?为了研究这一问题,我们提取纯化了四膜虫的大核与大核的周边核仁。进一步去除大核的核被膜,并将去除核被膜的大核与大核核仁分别加入非洲爪赡卵非细胞体系中。通过电镜超薄切片观察,我们发现无论是与大核染色质相连的周边核仁还是分离纯化的核仁结构在非洲爪赡卵非细胞体系中都不能保持其原有结构特征,而是发生了典型核重建变化,并且在诱导形成的重建核中也看不到核仁样结构。这些结果说明具有活性的核仁组织者在加入非洲爪蟾卵提取物后既不能继续保持其原有的RNA转录功能也不能诱导新的核仁的出现。     

应用HeLa细胞染色体(簇)和蛙卵提取物进行细胞核体外重建试验

将HeLa细胞中期染色体(簇)、非洲爪蟾卵提取物和ATP再生体系混合温育,能够促使细胞核自发重建。在此非细胞体系中重建的细胞核处于一般细胞核大小范围,具有典型的双层核膜,核孔复合体、染色质、核纤层、核骨架等结构,核重建具有一个明显的过程;发现环形片层通过与核膜融合方式参与核膜和核孔复合体组装。     

诸葛菜去膜精子在爪蟾卵提取物中实现非细胞体系核重建

动物爪蟾(Xenopus laevis)卵提取物诱导植物诸葛菜(Orychophragmus violaceus)去膜精子实现非细胞体系核重建. 诸葛菜去膜精子在爪蟾卵提取物中温育30 min左右开始膨大, 随着温育时间的延长, 膨大的精子染色质逐渐去凝集. 电子显微镜观察和荧光显微镜观察均表明重建核有核膜的装配, 膜泡在去凝集的染色质周围逐渐融合形成双层核膜. 用细胞分级抽提整装电子显微镜技术观察到重建核中有核纤层和核骨架结构的装配.     

非细胞体系在细胞凋亡中的应用

随着科学技术的进步和发展,对细胞凋亡的研究也涌现出许多新的方法和技术,为凋亡的研究提供了有力的武器。本阐述了非细胞体系用于细胞凋亡研究的优越性,着重介绍非细胞凋亡体系的种类以及在细胞凋亡研究中的应用,同时总结了非细胞体系研究凋亡过程的各种检测方法。     

利用腺病毒DNA与爪蟾卵提取物在非细胞体系中重构细胞核(简报)

1983年,Lohka和Masui首先报道,用精子染色质与卵提取物一起温育,可以组装成具有典型结构的细胞核。这种核不仅具有合成DNA的能力,而且还能进入M期。同年,     

多头绒泡菌有丝分裂后细胞核重建过程的形态学研究

以进行自然同步核内有丝分裂的多头绒孢菌（Ｐｈｙｓａｒｕｍｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｍ）原生质团为材料,应用常规制片和整体银染后制片的电镜技术研究了有丝分裂后细胞核的形态构建过程,形成新核仁的前体物质在有丝分裂中期时莠在染色体区域的周围,末期时与染色体组一起到达两极,子细胞核刚形成时核仁物质与染色质混合,以后核仁物质相互汇合并同染色质逐渐分开,最后形成一个大核仁,染色质在有丝分裂后期开始解集缩,到两极后在     

非细胞体系核重建过程中两类膜泡在环形片层及核被膜形成中的作用

非洲爪蟾卵经钙离子载体Ａ２３１８７激活后,在１０,０００ｇ下离心得到爪蟾卵提取物,ＬａｍｂｄａＤＮＡ中入上述提取物可构建出染色质结构,并在染色质表面重建核被膜,同时,在染色质外的区域形成环形片层。核被膜在环形片层有相似的发生途径,它们都是由两类在形态、大小、膜结构上有明显差别的膜泡融合而来,首先是直径２００ｎｍ的圆形小膜泡相互融合成双层膜片层,同时核孔复合体在双层膜上大量装配;以这些双层膜片层为基     

多头绒泡菌有丝分裂后细胞核重建过程的形态学研究

以进行自然同步核内有丝分裂的多头绒泡菌(Physarum polycephalum)原生质团为材料,应用常规制片和整体银染后制片的电镜技术研究了有丝分裂后细胞核的形态构建过程。形成新核仁的前体物质在有丝分裂中期时散在染色体区域的周围,末期时与染色体组一起到达两极。子细胞核刚形成时核仁物质与染色质混合,以后核仁物质相互汇合并同染色质逐渐分开,最后形成一个大核仁。染色质在有丝分裂后期开始解集缩,到两极后在新形成的子核中进一步松解。染色质在充分松解后又开始集缩活动,形成一些集缩比较紧密的染色质小块。随着细胞核的进一步发育在核膜和核仁之间形成许多大小不等,形状不规则的染色质团块。     

应用大肠杆菌染色体DNA在非洲爪蟾卵提取物实现诱导非细胞体系核装配

近年来我们实验室已成功地利用细胞核体外组装的实验模式,将多种生物的DNA在非洲爪蟾卵提取物中实现了非细胞体系核装配。但亲缘关系最远的原核生物的染色体DNA是否也能在此真核体系中进行核装配一直没有报道。我们以大肠杆菌染色体DNA为材料,研究了它诱导的非细胞体系核装配。在光镜与电镜水平观察了核装配的过程。显微分光光度计扫描显示DNA片段在核装配过程中经历了凝集-去凝集的变化。证明大肠杆菌染色体DNA也能诱导爪蟾卵提取物装配成具有典型结构的核。α-~(32)P-dCTP的掺入实验表明重建核具有较高的DNA复制活性。     

应用大肠杆菌染色素DNA在非洲爪蟾卵提取物实现诱导非细胞体系…

近年来我们实验室已成功地利用细胞核体外组装的实验模式,将多种生物的ＤＮＡ在非洲爪蟾卵提取物中实现了非细胞体系核装配。但亲缘关系最远的原核生物的染色体ＤＮＡ是否也能在此真核体系中进行核装配一直没有报道。我们以大肠杆菌染色体ＤＮＡ为材料,研究了它诱导的非细胞体系核装置。在光镜与电镜水平观察了核装配的过程。显微分光光度计扫描显示ＤＮＡ片段在核装配过程中经历了凝集－去凝集的变化。证明大肠杆菌染色体ＤＮＡ也     

用DNA酶切小分子片段在非洲爪蟾卵中提取物中实现非细胞体系核装配

用质粒ｐＢＲ３２２的ＤＮＡ酶切片段,长度分别为７５０,３７５和１８６ｂｐ作为外源ＤＮＡ在非洲爪蟾卵撮以物中实现了非细胞体系的核装配。将分离纯化得到的ｐＢＲ３２２ＤＮＡ酶切后经低熔点琼脂糖回收ＤＮＡ片段,长度为７５０,３７５和１８６ｂｐ,分别加入到爪蟾卵提取物再生系统中温育,经ＤＡＰＩ染色,孚尔根染色及电子显微镜观察发现能装配量的重建核。     

用DNA酶切小分子片段在非洲爪蟾卵提取物中实现非细胞体系核装配

用质粒ｐＢＲ３２２的ＤＮＡ酶切片段,长度分别为７５０、３７５和１８６ｂｐ作为外源ＤＮＡ在非洲爪蟾 卵提取物中实现了非细胞体系的核装配（核重建）。将分离纯化得到的 ＰＢＲ３２２ ＤＮＡ酶切后经低熔 点琼脂糖回收ＤＮＡ片段,长度为７５０、３７５和１８６ｂｐ,分别加入到爪蟾卵提取物再生系统中温育, 经ＤＡＰＩ染色、孚尔根染色及电子显微镜观察发现能装配大量的重建核。显微分光光度法研究表 明,ＤＮＡ片段在诱导形成重建核的过程中发生了明显的凝集－会凝集变化。α－３２Ｐ－ｄＣＴＰ掺入重建核 的液闪计数结果表明,ＤＮＡ酶切小分子片段诱导形成的重建核具有较高的ＤＮＡ复制活性,而且复 制活性在一定范围内与加入的ＤＮＡ片段长度呈正相关。实验结果表明,非细胞体系中诱导的核重 建不仅与外源ＤＮＡ的种类无关,与外源ＤＮＡ的长度也没有关系。     

非细胞体系核重建过程中两类膜泡在环形片层及核被膜形成中的作用

非洲爪蟾卵经钙离子载体A 23187激活后,在10,000g下离心得到爪蟾卵提取物。Lambda DNA加入上述提取物可构建出染色质结构,并在染色质表面重建核被膜,同时在染色质外的区域形成环形片层。核被膜与环形片层有相似的发生途径,它们都是由两类在形态、大小、膜结构上有明显差别的膜泡融合而来。首先是直径200nm的圆形小膜泡相互融合成双层膜片层,同时核孔复合体在双层膜上大量装配,以这些双层膜片层为基础,光滑的大膜泡与之融合导致环形片层的扩张与核被膜的成熟。     

利用非洲爪蟾精子染色质和卵提取物在体外重建细胞核

应用非洲爪蟾去膜精子染色质和卵提取物成功地进行了细胞核本外重建。当精子染色质加入卵提取物后,首先发生染色质去浓缩作用,染色质整体结构膨胀;膜泡在膨胀的染色质外周聚集并逐渐彼此融合成双层膜;核孔复合体以某种未知方式组装入双层膜而形成核膜结构,并逐渐完全覆盖膨大的染色质,最终形成典型的间期核结构。     

钙离子信号对非细胞体系中小鼠卵母细胞游离生发泡减数分裂启动的影响

本文构建了包括HeLa裂解液和游离小鼠卵母细胞生发泡的实验体系,用于研究Ca^2 及其下游信号对小鼠卵母细胞减数分裂启动的影响。游离的卵母细胞生发泡可以在M期细胞裂解液中发生减数分裂启动,表现为染色质的凝集。进一步的研究表明,Ca^2 信号的存在对G2期细胞裂解液促进减数分裂启动是至关重要的,G2期中期的细胞裂解液只有经Ca^2 诱导后才具有启动生发泡减数分裂的作用,而G2期晚期无论Ca^2 存在与否均诱发减数分裂的启动,但是G2期早期的裂解液无启动减数分裂的作用。卵母细胞的体外培养实验分析也表明,抑制CaM和CaMKⅡ的活性可以阻止GVBD和报制第一极体的释放。免疫沉淀及Western Blotting结果显示,HeLa细胞裂解液中的MPF从G2期中期到M期均存在,且Cdc2亚基的Tyr由磷酸化向去磷酸化转变。结果进一步证明,卵母细胞减数的分裂的启动可能是通过一种Ca^2 ／CaM依赖的途径来推动的。     

GTP酶Ran在细胞核运输、核分裂与重建中的作用

小分子的单体G蛋白Ran具有鸟苷三磷酸酶活性,其结合形式Ran-GTP作为区分间期细胞的核质和胞质的一个分子标记,并参与调控核质运输、指导纺锤体形成以及引导核膜解体与装配。现就Ran在真核细胞核质运输、有丝分裂纺锤体组装与核膜动力学中的功能作一综述。     

豌豆间期细胞核内核仁组织者区排列的非放射性原位杂交定位

以异羟基洋地黄毒甙（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）ｓｆｉ ｙｎ ｒ ｒＲＮＡ为探针与多聚甲醛固定的植物根振动切片原位杂交。结合免疫荧光检测分析了豌豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）间期细胞核内核仁组织者区的数目、分布和排列。研究结果发现豌豆根尖分生组织间期细胞核内有１－６个被探针分子强烈标记的位点。这些位点呈大小不等（０．２４－１．９８μｍ＾３）的斑点状,分布在核仁的周边,并且与核仁相连。探针标记位点在核