利用代谢工程技术提高工业微生物对胁迫的抗性

代谢工程是工业微生物菌种改造的平台技术,不仅可用于改变微生物细胞内的代谢流向,也可以用于改善工业微生物的生理功能。在工业生产过程中,微生物细胞会面临多种胁迫作用,这些胁迫诱导的基因调节作用,都有可能影响细胞的许多重要生理功能,从而影响生物转化过程的效率。从工业应用的观点出发,选择生产性能良好、对发酵过程中的主要胁迫因素有较强耐受性的菌株至关重要。以下评述了借鉴传统代谢工程技术和反向代谢工程技术来提高工业微生物对胁迫抗性的若干研究策略,提出了该领域目前存在的问题,以及利用代谢工程技术改善微生物胁迫抗性——即微生物生理功能工程的发展方向。     

工业菌种改良述评

微生物菌种是发酵工业的基础。菌种筛选和持续不断的改良贯彻于发酵过程始终。传统的(经典的)诱变—筛选仍是目前最实用的常规技术;以基因工程为核心的现代生物技术正越来越显示出其在菌种改良上的魅力,并将最终成为微生物育种的主导技术。     

发酵工业菌种的迭代创制

生物发酵是以微生物菌种为生物催化剂,以淀粉糖、生物质等可再生资源为原料发酵生产各种食品、化学品、燃料、材料等物质的生产过程,具有绿色、低碳和可持续等特征。我国拥有全球规模最大的生物发酵产业,尤其氨基酸、维生素等传统发酵产品占全球市场份额的60%–80%。发展生物发酵产业对于我国实现“碳中和、碳达峰”的战略目标和生物经济发展具有重要的意义。微生物工业菌种是生物发酵产业的核心,直接影响原料路线、产品种类和生产成本。创新发酵工业菌种,提升其原料转化利用效率,提高产物生产水平,拓展产品种类,是生物发酵产业高质量发展的关键。近年来,合成生物学、系统生物学等学科的发展,进一步加深了研究者对微生物底盘细胞生理代谢机制的理解,加速了基因编辑等菌种设计创制使能技术的发展,为发酵工业菌种改造提升提供了新动能。本文选取了具有代表性的大宗氨基酸、B族维生素、柠檬酸、燃料乙醇等发酵产业,从其工业微生物底盘的基础研究和技术开发角度,综述发酵工业菌种改造提升的最新进展,并展望人工智能、自动化与生命科学交叉融合将对工业菌种迭代产生的重要影响。     

生物技术研究和开发的进展与展望(续)

四、微生物工程 微生物工程又称发酵工程,是利用微生物的特定性状,通过现代生化工程技术,使微生物产生有用物质或直接用于工业化生产的技术。主要包括菌种选育、菌体生产、代谢产物的发酵和微生物功能的应用等技术。传统的微生物发酵,如酒、醋的酿造,起源于史前时期。但是,作为现代科学概念的微生物工程,是从二十世纪四十年代随着抗生素发酵工业的建立而兴起的。七十年代以来,由于基因工程、细胞融合和细胞固定化技     

工业微生物酸胁迫的耐受机制及改造途径

工业微生物在发酵生产过程中会面对发酵环境和自身产生的各类酸性物质,而这些酸性物质会影响工业微生物的生长和代谢,即产生酸胁迫。微生物通过调控胞内质子浓度、保护和修复生物大分子、改变细胞膜组分以及整体水平调控等耐受机制来应对酸胁迫。结合酸胁迫的各种耐受机制,利用自然筛选和人工改造的方法提高工业微生物的抗酸胁迫能力,为构建出更能适应工业生产条件的菌株提供理论依据。     

蛋白质组学技术在工业发酵梭菌研究中的应用

介绍了目前应用较广泛的蛋白质组学技术的原理、应用及优缺点;总结了发酵工业中常用的梭菌属细菌;重点阐述了蛋白质组学技术在工业发酵梭状芽孢杆菌研究中的应用,为工业发酵菌种的改良和发酵工艺的优化提供理论依据。最后讨论了今后工业发酵菌种蛋白质组学研究的重点和方向。     

转录组平台技术及其在代谢工程中的应用

组学技术在系统水平上对细胞代谢进行全面的分析,极大地促进了代谢工程的发展和应用。全基因组水平的转录分析可以使研究者更加精确地评估细胞表型,加深对细胞代谢的理解。而且转录组分析也有助于研究者鉴定菌种改良的目标基因,加速对微生物细胞工厂的合理设计及构建。文中介绍了3种主要转录组平台技术的原理,并总结了转录组学在代谢工程领域中应用的最新进展和未来发展趋势。     

脯氨酸代谢与植物抗渗透胁迫的研究进展

脯氨酸被认为是植物和细菌内的一种相容渗透剂,有助于植物和细菌抵御渗透胁迫。本文就近年来有关植物体内脯氨酸合成和代谢、脯氨酸含量受渗透胁迫的影响情况、脯氨酸合成降解有关的酶及其基因、脯氨酸在细胞中的运输和定位、ＡＢＡ与脯氨酸的诱导合成以及脯氨酸和植物抗渗透胁迫关系的研究进展作了简要综述。     

面向工业生物技术的系统生物学

工业生物技术是以微生物细胞工厂利用可再生的生物原料来生产能源、材料与化学品等的生物技术,在解决资源、能源与环境等问题方面起着越来越重要的作用。系统生物学是全面解析微生物细胞工厂及其发酵过程从"黑箱"到"白箱"的重要研究方法。系统生物学借助基因组、转录组、蛋白质组、代谢组以及代谢流组等多组学数据,可解析微生物细胞工厂在RNA、蛋白与代谢物等不同水平上的变化规律与调控机制。目前,系统生物学在微生物细胞工厂的设计创建与发酵工艺优化中起着越来越重要的指导作用,许多成功应用实例不断涌现,推动着工业生物技术的快速发展。文中重点综述基因组、转录组、蛋白质组、代谢组与代谢流组以及基因组规模的网络模型等各组学技术的最新发展及其在工业生物技术尤其是菌株改造与发酵优化中的应用,并就工业生物技术中系统生物学的未来发展方向进行展望。     

精氨酸代谢途径抗酸关键基因对乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000胁迫抗性的影响

【目的】寻找精氨酸代谢途径中与酸胁迫相关的关键作用因素。【方法】通过在Lactococcus lactis NZ9000中分别过量表达来源于Lactobacillus casei Zhang的精氨酰琥珀酸合成酶(ASS)和精氨酰琥珀酸裂解酶(ASL)改变精氨酸代谢提高酸胁迫抗性。【结果】与对照菌株对比,重组菌株在环境胁迫下表现了较高的生长性能、存活率和发酵性能。生理学分析发现,酸胁迫环境下,重组菌株细胞有较高的胞内NH4+、ATP含量和H+-ATPase活性,并显著提高了精氨酸脱亚胺酶(ADI)途径中的氨基酸浓度。进一步的转录分析发现,天冬氨酸合成、精氨酸代谢相关的基因转录水平上调。【结论】在L.lactis NZ9000中过量表达ASS或ASL可以引发精氨酸代谢流量的上调,进而提高了细胞的多种胁迫抗性。精氨酸合成途径广泛存在于多种微生物中,为微生物,尤其是工业微生物提高胁迫抗性提供了新思路。     

渗透胁迫下不同抗旱性小麦幼苗氨同化差异

在渗透胁迫下,测定了不同抗旱性小麦（抗旱性强的品种洛旱6号和抗旱性弱的品种周麦18）幼苗氨同化酶及相关参数的变化.结果表明:小麦生物量在渗透胁迫下明显降低,且抗旱性弱的周麦18降幅较大.铵态氮含量随胁迫程度的增加而增加,且周麦18增加较明显;谷氨酰胺合成酶(GS)活性在不同抗旱性品种间表现不同,抗旱性强的洛旱6号在低渗透胁迫下显著增加,在高渗透胁迫下明显降低,而周麦18随胁迫程度的增加逐渐降低;依赖还原型辅酶Ⅰ的谷氨酸脱氢酶(NADH-GDH)活性随胁迫程度的增加逐渐加大,低渗透胁迫下周麦18增加较明显,高渗透胁迫下洛旱6号增幅较大;依赖氧化型辅酶Ⅰ的谷氨酸脱氢酶(NAD^+-GDH)和依赖氧化型辅酶Ⅱ的异柠檬酸脱氢酶(NADP-ICDH)活性均随胁迫程度的增加而增加,周麦18的NAD^+-GDH活性、洛旱6号的NADP-ICDH活性增幅较大.表明小麦抗旱性的提高与铵态氮同化的增强有关,低渗透和高渗透胁迫下分别依赖GS和NADH-GDH活性的增加.     

进化代谢选育高渗透压耐受型产琥珀酸大肠杆菌

在以碳酸钠为酸中和剂的大肠杆菌两阶段发酵产琥珀酸的过程中,由于Na+的积累造成发酵体系中渗透压的提高,严重抑制了琥珀酸的产物浓度。为了增强大肠杆菌对渗透压的耐受性,考察了利用进化代谢方法筛选高渗透压耐受型高产琥珀酸大肠杆菌菌株的可行性。进化代谢系统作为一种菌株突变装置,可以使菌体在连续培养条件下以最大的生长速率生长。以NaCl为渗透压调节剂,通过在连续培养装置中逐步提高NaCl浓度使菌体在高渗透压条件下快速生长,最终得到了一株高渗透压耐受型琥珀酸生产菌株Escherichia coli XB4。以碳酸钠为酸中和剂,在7 L发酵罐中利用Escherichia coli XB4进行两阶段发酵,厌氧培养60 h后,琥珀酸产量达到了69.5 g/L,琥珀酸生产速率达到了1.81 g/(L.h),分别比出发菌株提高了18.6%和20%。     

Salicylic acid and nitric oxide alleviate osmotic stress in wheat (Triticum aestivum L.) seedlings

Salicylic acid (SA) and nitric oxide (NO) are reported to alleviate the damaging effects of stress in plants rather similarly when applied at appropriate low concentrations. An experiment was therefore conducted to study the impact of SA, sodium nitroprusside (SNP; as NO donor), and methylene blue (MB; as a guanylate cyclase inhibitor) on wheat seedling performance under osmotic stress. Osmotic stress significantly reduced shoot fresh weight (SFW), chlorophyll contents (Chla, Chlb, total Chl), and membrane stability index (MSI) and also increased malondialdehyde (MDA) level, lipoxygenase (LOX) activity, and hydrogen peroxide production. Moreover, enzymatic antioxidant activities including superoxide dismutase, guaiacol peroxidase, and glutathione reductase activity were enhanced under osmotic stress. On the contrary, SA or SNP pretreatment reduced the damaging effects of osmotic stress by further enhancing the antioxidant activities that led to increased SFW, Chl, and MSI and reduced MDA level and LOX activity. However, pretreatment of plants with MB reversed or reduced the protective effects of SA and SNP suggesting that the protective effects were likely attributed to NO signaling. Therefore, NO may act as downstream of SA signaling in reduction of induced oxidative damage in wheat seedlings.     

Growth of Saccharomyces cerevisiae in a chemostat under high glucose conditions

Saccharomyces cerevisiae was grown in a chemostat under high glucose conditions (up to 300 g l^–1). The results support the view that higher glucose feed favors higher ethanol production regardless of the existence of osmotic stress. A low glucose utilization and yield coefficient provides an opportunity to improve continuous fermentation performance in the fuel alcohol industry. The possibility exists of reusing yeast cells and subsequently lower operating costs, and by using an optimal glucose feeding concentration between 100 and 200 g l^–1.     

Flocculation onset in Saccharomyces cerevisiae: effect of ethanol, heat and osmotic stress

AIMS: To examine the effect of different stress conditions on the onset of flocculation in an ale-brewing strain, Saccharomyces cerevisiae NCYC 1195. METHODS AND RESULTS: Flocculation was evaluated using the method of Soares, E.V. and Vroman, A. [Journal of Applied Microbiology (2003) 95, 325]; plasma membrane integrity was accessed using propidium iodide and the staining of the yeast cell wall was performed using calcofluor white M2R. Cells in exponential phase of growth were subjected to different stress conditions. The addition of 1%, 3% and 5% (v/v) ethanol, 1% and 3% (v/v) isopropanol or a brief heat shock (52 degrees C, 5 min), did not induce an early flocculation phenotype when compared with control cells. The addition of 10% (v/v) ethanol, a continuous mild heat-stress (37 degrees C) or an osmotic stress (0.5 or 1 mol l(-1) of NaCl) did not induce a flocculent phenotype. CONCLUSIONS: Flocculation seems not to be induced as a response to different chemical (ethanol and isopropanol) and physical (heat and osmotic) stress conditions. Conversely, osmotic and ethanol [10% (v/v)] stress, as well as a continuous mild heat shock (37 degrees C), have a negative impact on the phenotype expression of flocculation. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: The findings reported here contribute to the elucidation of the control of yeast flocculation. This information might be useful to the brewing industry, as the time when the onset of flocculation occurs can determine the fermentation performance and the beer quality, as well as in other biotechnological industries where flocculation can be used as a cell separation process.     

渗透胁迫对烤烟体内钾素累积的影响

以烤烟K326为材料,研究了PEG渗透胁迫对烤烟体内钾素累积的影响。结果表明：旺长期内短时间低渗透胁迫强度刺激了烟株中K^ 的累积,胁迫时间延长或胁迫强度增加时,K^ 累积速率逐渐降低,甚至导致体内钾的损失。钾累积量的这种变化与渗透胁迫导致的根细胞膜结构的破坏及质膜选择透过性功能的降低有关。胁迫程度较高或时间较长时,细胞膜的相对透性增加,导致根中的K^ 大量外流。这说明短时间的低渗透胁迫不会明显降低烟叶的含钾量,但烤烟对干旱的御胁迫性及胁变修复性较小,烤烟生育期内特别是对水分变化最敏感的旺长期应有合适的水分供应,以提高烟根的吸钾速率、降低钾的外流损失。     

工业酵母抗逆机理研究进展

工业酵母利用木质纤维素等生物质资源发酵生产醇、酮、醛、酸等各种化合物,是解决人类面临的不可再生资源和能源危机的重要途径,这激发了人们对木质纤维素水解液为原料和环保节能型浓醪发酵技术的极度关注。然而高浓度底物、产物、渗透压、木质纤维素水解液中抑制性物质、发酵过程温度的提高均会抑制微生物生长代谢及发酵性能,这是发酵行业"瓶颈"问题。本文简述了渗透压、温度及抑制性物质对酵母细胞生长的危害,并从胞内稳态平衡、分子水平等方面着重叙述工业酵母对渗透压、温度及抑制性物质的抗逆机制研究进展。     

渗透压敏感和耐高渗酵母菌在海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊中的生长和代谢

为了研究微囊微环境中渗透压对微囊内不同渗透压敏感性细胞生长、代谢的影响, 分别以渗透压敏感型酿酒酵母Y02724与耐高渗酵母Hansel为细胞模型, 考察了有氧条件下这两种细胞在海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸(Alginate-chitosan-alginate, ACA)微胶囊中的生长、代谢状态。主要检测了细胞比生长速率、最大产物生成量以及代谢物乙醇、甘油分泌量等的变化。实验结果分析表明, 渗透压胁迫可能是导致不同渗透压敏感性细胞在微囊微环境中生长代谢特征变化的因素之一, 即微囊微环境内可能存在渗透压胁迫。     

渗透胁迫下小麦根系渗透调节与根冠淀粉水解的研究

用不同浓度的PEG—600对抗旱性不同的小麦幼苗进行渗透胁迫处理,研究了小麦幼苗根系的淀粉酶活性、可溶性糖含量、渗透势、渗透调节能力和根冠淀粉的水解状况。结果表明,随着渗透胁迫程度的加重,抗旱性强的小麦品种昌乐5号和北农2号根系渗透势和饱和渗透势的降低程度大于抗旱性弱的小麦品种鲁麦5号和921842,并且抗旱性强的小麦品种根系的渗透调节能力大于抗旱性弱的小麦品种。随着渗透胁迫程度的加重．各品种小麦根冠淀粉粒均有不同程度的减少。而抗旱性强的品种根冠淀粉粒的减少程度小于抗旱性弱的品种;抗旱性强的小麦品种根系淀粉酶活性显著高于抗旱性弱的小麦品种,但是,随着渗透胁迫程度的加重,抗旱性弱的品种淀粉酶活性增加的幅度远高于抗旱性强的品种。可溶性糖含量的变化趋势与淀粉酶活性的变化趋势一致．即渗透胁迫下根冠淀粉水解程度大的小麦品种,可溶性糖的含量高。但根冠淀粉水解在根系的渗透调节以及在小麦适应水分胁迫中的作用还有待于进一步探讨。     

过氧化氢胁迫促进产朊假丝酵母合成谷胱甘肽

谷胱甘肽(GSH)在生物细胞抵御外界环境条件的刺激和胁迫时起到非常重要的作用。考察了不同时间不同浓度过氧化氢胁迫和过氧化氢连续胁迫对产朊假丝酵母合成GSH的影响, 发现低浓度过氧化氢的连续胁迫对GSH的合成有明显促进作用。进一步在发酵罐上应用了低浓度过氧化氢(36 mmol/L)持续胁迫策略, 最终GSH产量为922 mg/L, 胞内GSH含量为1.64%, 比对照分别提高了7%和35%。