耐低温酵母Curvibasidium rogersii菌株在松萝样品中的首次分离鉴定及基于基因组分析的生物特性探究

【目的】对西藏松萝地衣来源的两株非常规酵母进行分离鉴定,并通过基因组序列分析探究其生物学特性和应用潜力。【方法】从西藏来源的松萝地衣样品内部分离得到2株耐低温酵母菌株,通过26S D1/D2和ITS序列比对分析以及生理生化实验进行菌种鉴定;通过全基因组序列分析和验证探究菌株的生物特性。【结果】两株酵母菌株经鉴定均为Curvibasidium rogersii,可以在10℃低温良好生长,在20℃生长最佳,25℃及以上温度生长缓慢或不生长。对其进行基因组测序和基因组挖掘,测序结果发现,其基因组注释出功能的部分与产油脂的低温酵母白冬孢酵母Leucosporidium creatinivorum具有最高相似性,尼罗红染色发现两株酵母都能够生产油脂,另外在基因组序列中还发现了可能参与木糖代谢的相关蛋白编码基因,实验证明两个酵母菌株可以利用木糖生长。【结论】首次分离鉴定了来自西藏松萝的酵母C. rogersii,为充分开发利用松萝和其他地衣来源微生物,以及利用可代谢木糖的新资源酵母生产微生物油脂提供了基础。     

植物与内生真菌互作的生理与分子机制研究进展

在自然生态系统中,植物组织可作为许多微生物定居的生态位.内生真菌普遍存在于植物组织内,与宿主建立复杂的相互作用(互惠、拮抗和中性之间的相互转化),并且存在不同的传播方式(垂直和水平传播).内生真菌通过多样化途径来增强植物体的营养生理和抗性机能.但这种生理功能的实现有赖于双方精细的调控机制,表明宿主和真菌双方都进化形成特有的分子调控机制来维持这种互惠共生关系.环境因子(如气候、土壤性质等)、宿主种类和生理状态、真菌基因型的变化都将改变互作结果.此外,菌根真菌和真菌病毒等也可能普遍参与植物-内生真菌共生体,形成三重互作体系,最终影响宿主的表型.研究试图从形态、生理和分子水平阐述内生真菌与植物互作的基础.     

酿酒酵母乙酸耐性分子机制的功能基因组进展

提高工业酿酒酵母对高浓度代谢产物及原料中的毒性底物等环境胁迫因素的耐受性,对提高工业生产效率具有重要的意义。乙酸是纤维素原料水解产生的主要毒性副产物之一,其对酵母细胞的生长和代谢都具有较强的抑制作用,因此,对酿酒酵母乙酸耐性分子机制的研究可为选育优良菌种提供理论依据。近年来,通过细胞全局基因表达分析和代谢组分析,以及对单基因敲除的所有突变体的表型组研究,对酿酒酵母乙酸耐性的分子机制有了更多新的认识,揭示了很多新的与乙酸毒性适应性反应和乙酸耐性提高相关的基因。综述了近年来酿酒酵母乙酸耐性的基因组规模的研究进展,以及在此基础上构建乙酸耐性提高的工业酵母菌的代谢工程操作。结合本课题组的研究,对金属离子锌在酿酒酵母乙酸耐性中的作用进行了深入分析。未来对酿酒酵母乙酸耐性分子机理的认识及改造将深入到翻译后修饰和合成生物学等新的水平,所获得的认知,将为选育可高效进行纤维素原料生物转化、高效生产生物燃料和生物基化学品的工业酿酒酵母的菌株奠定理论基础。     

酿酒酵母组蛋白变体Htz1调控基因转录的作用机制

在真核生物染色质中,作为核心组蛋白的H2A是构成核小体重要组分,其变体之一H2A.Z高度保守,对真核细胞生物的生命活动有重要意义. 模式生物酿酒酵母中的H2A.Z被称作Htz1. 在对多种生物H2A.Z的研究中,以对酿酒酵母组蛋白变体Htz1的探讨最为深入全面. 本文将从多个方面详细介绍酿酒酵母Htz1对基因表达调控的作用机制,涵盖其蛋白结构、染色质上的定位、翻译后修饰、结合机制、生物功能及其分子伴侣的作用等,并对未来该领域需要解决的重要科学问题进行了展望.     

酿酒酵母乙醇耐性的分子机制及基因工程改造

提高工业微生物对毒性代谢产物及高温等环境胁迫因素的耐受性对工业生产具有重要的意义。发酵过程中产生的乙醇对酵母细胞的生长和代谢都具有较强的抑制作用,是酿酒酵母的重要环境胁迫因素之一。对酿酒酵母乙醇耐性的分子机制的研究可为选育具有较强乙醇耐受性的酵母菌种提供理论基础。近年来,通过细胞全局基因转录分析和基因功能分析,对酿酒酵母乙醇耐性的分子机制有了更多新的认识,揭示了很多新的与乙醇耐性相关的基因,并在此基础上,通过对相关基因进行过量表达或敲除,成功提高了酵母菌的乙醇耐性。以下综述了近年来酵母菌乙醇耐性的生物化学与分子生物学机制的研究进展,以及构建具有较高乙醇耐性的酵母菌的基因工程操作。这些研究不仅加深了对酿酒酵母乙醇耐性的机理认识,也可为高效进行生物转化生产生物质能源奠定理论基础。     

耐高温酿酒酵母的构建与高温耐受机制解析

旨在构建优良的高温耐受酿酒酵母菌株,并探究其高温耐受机制。通过CRISPR/Cas9技术在絮凝性工业酿酒酵母KF-7中敲除ASP3(编码L-天冬酰胺酶II)并进一步高表达CRZ1(编码具有锌指结构的转录因子Crz1p),通过比较转录组解析重组菌株的高温耐受机制。结果显示,在44℃高温条件下,ASP3敲除菌株KAS11利用98.36 g/L葡萄糖产生43.68 g/L乙醇。在KAS11基础上高表达CRZ1后,菌株KASCR7发酵105.37 g/L葡萄糖产48.02 g/L乙醇。与KF-7相比,两个重组菌株的乙醇产量分别提升了4.77%和15.18%。比较转录组分析结果表明,在高温胁迫下,重组菌株的核糖体生物合成及翻译相关基因受到抑制,而热休克蛋白基因以及NAD⁺、NADH、嘌呤、甘油、脯氨酸等合成相关基因受到诱导,这些响应可能共同导致重组菌株的高温耐受性提升。研究结果可为构建高温耐受酿酒酵母菌株提供优良菌株资源和理论基础。     

酿酒酵母丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶的功能与调控

从酿酒酵母蛋白磷酸酯酶的分类和结构特征入手,阐述了该蛋白家族中的亚家族成员丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶的功能和表达调控.深入研究酿酒酵母丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶,特别是PP2C蛋白磷酸酯酶的细胞功能及其调控,将对新药研发和疾病干预治疗提供重要基础.     

基于转录组学分析的丙酸钙对酿酒酵母的抑菌机制

[背景]丙酸钙作为在面包等食品中添加的防腐剂,具有一定的抑菌作用,但目前对其的研究大多聚焦于生化、群体层次.[目的]在分子水平上探究丙酸钙对酵母起抑菌作用的机制.[方法]取实验组和对照组中对数生长期的耐高糖酵母BH1进行转录组测序及分析,并进行实时荧光定量PCR验证.[结果]与6h对照组(无丙酸钙处理;Control ...     

秀丽线虫衰老调控的生理与分子机制

秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)是目前研究动物衰老调控机制重要模型之一.在线虫中,众多的信号通路经相互协同形成的复杂网络接受来自感觉神经元的各种环境信息,进而通过信号传递作用于各组织器官而影响衰老的诸多方面.线虫衰老的生理与分子调控主要涉及三个调节系统,即发挥神经内分泌功能的insulin/IGF-1体系、进食限制延缓衰老的调节系统和线粒体呼吸链/ATP合成体系.本文主要针对这三类体系的生理与分子调控机制予以论述.     

酿酒酵母中基于CRISPR/dCas9的基因转录调控工具的开发与应用

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是重要的模式真核微生物,广泛用于基础研究和工业发酵。基于CRISPR/dCas9系统开发的转录调控方法具有可编程、多重性和正交性等优点,在酿酒酵母的基因调控、功能基因组学、代谢工程等研究领域具有巨大潜力。本文关注酿酒酵母中CRISPR/dCas9基因转录调控工具的研究进展,阐述了不同转录调节结构域对dCas9或gRNA活性的调节,设计与优化dCas9和gRNA表达的方法,影响CRISPR/dCas9系统转录调控效率、特异性和通量的靶向性因素,最后总结了该工具在酿酒酵母代谢工程中的应用,并对该技术的未来发展提出了展望。     

Crabtree-negative characteristics of recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae

For recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae, ethanol yield and productivity is substantially lower on xylose than on glucose. In contrast to glucose, xylose is a novel substrate for S. cerevisiae and it is not known how this substrate is recognized on a molecular level. Failure to activate appropriate genes during xylose-utilization has the potential to result in sub-optimal metabolism and decreased substrate uptake. Certain differences in fermentative performance between the two substrates have thus been ascribed to variations in regulatory response. In this study differences in substrate utilization of glucose and xylose was analyzed in the recombinant S. cerevisiae strain TMB3400. Continuous cultures were performed with glucose and xylose under carbon- and nitrogen-limited conditions. Whereas biomass yield and substrate uptake rate were similar during carbon-limited conditions, the metabolic profile was highly substrate dependent under nitrogen-limited conditions. While glycerol production occurred in both cases, ethanol production was only observed for glucose cultures. Addition of acetate and 2-deoxyglucose pulses to a xylose-limited culture was able to stimulate transient overflow metabolism and ethanol production. Application of glucose pulses enhanced xylose uptake rate under restricted co-substrate concentrations. Results are discussed in relation to regulation of sugar metabolism in Crabtree-positive and -negative yeast.     

酿酒酵母SRP40基因对细胞耐受性影响的研究

【目的】本论文研究酿酒酵母srp40³⁹突变基因对酵母细胞异丁醇耐受性的影响。【方法】首先,以酿酒酵母野生型W303-1A和突变株EMS39染色体DNA为模板克隆野生型SRP40基因和srp40³⁹突变基因;然后,将野生型SRP40基因和srp40³⁹突变基因分别连接到质粒YCplac22上,构建质粒YCplac22-SRP40和YCplac22-srp40³⁹。将质粒YCplac22-SRP40、YCplac22-srp40³⁹以及YCplac22空质粒分别转化入野生型酿酒酵母W303-1A中,分别得到W303-1A-SRP40工程菌、W303-1A-srp40³⁹工程菌和W303-1A-control工程菌。将3株工程菌分别置于含1.0%异丁醇、1.3%异丁醇、8.0%乙醇和0.5%异戊醇的CM培养基中进行发酵,测定细胞密度(OD₆₀₀)和生长情况,并计算2–10 h的比生长速率（μ）。将3株工程菌于55°C热激4 min后做稀释...     

Man8GlcNAc2糖基化的酿酒酵母菌株的构建

酿酒酵母糖蛋白的N-糖基化经过高尔基体的修饰后形成聚合度约150-200的甘露寡糖,高尔基体N-糖基化的糖基转移酶Mnn1p和Och1p在甘露寡糖的形成过程中起关键作用。通过同源重组置换敲除了酵母中的MNN1和OCH1基因阻断高尔基体N-糖基化修饰,分离纯化了mnn1 och1突变株中的N-糖蛋白,糖酰胺酶PNGaseF酶解释放的N-糖链经过2-氨基吡啶衍生后,利用HPLC和MALDITOF/MS结合的方法分析了突变株糖蛋白上的N-糖链。结果显示mnn1 och1突变株中的糖蛋白的N-糖链为结构单一的糖链,分子量为1794.66,推测为Man₈GlcNAc₂。     

双孢蘑菇酪氨酸酶基因在酿酒酵母中的异源表达及其酶学特性

【目的】在酿酒酵母中异源表达双孢蘑菇来源的酪氨酸酶基因PPO2,并研究酪氨酸酶在酿酒酵母胞内及胞外的酶学特性。【方法】提取双孢蘑菇总RNA,通过RT-PCR克隆酪氨酸酶基因PPO2,构建表达载体pSP-G1-PPO2,并转化至酿酒酵母进行表达,采用镍亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。【结果】在酿酒酵母中正确表达了大小为65 kDa的酪氨酸酶蛋白。重组酶能催化底物酪氨酸产生黑色素。体外活性测定表明,酪氨酸酶催化最适温度为45°C,以酪氨酸和多巴为底物时最适pH分别为7.0和8.0。在酿酒酵母中测得底物酪氨酸浓度低于2.5 mg/mL时,黑色素的产量与底物浓度呈现正相关性。【结论】来源于双孢蘑菇的酪氨酸酶基因PPO2在酿酒酵母中成功表达,重组酶具有良好的酶学特性。利用酪氨酸酶产物黑色素的产量与底物浓度呈现正相关性这一特性,可将其作为细胞酪氨酸产量的传感器,为高通量筛选酪氨酸高产菌株提供了思路。     

酿酒酵母芳樟醇耐受性的工程改造

【背景】芳樟醇具有特殊的香气和多种生物学活性,是食品、医药和化妆品行业的重要原料。随着合成生物学的高速发展,代谢改造微生物进行芳樟醇生物合成是当前研究的一大热点。然而在微生物的生物合成中,芳樟醇对底盘细胞的毒性是一大瓶颈问题,也是其他单萜物质生物合成的共性问题。【目的】建立合理的耐受性改造方法,以提高微生物宿主细胞对芳樟醇的耐受性。【方法】以酿酒酵母BY4741为研究对象,通过对ABC转运蛋白、活性氧调控相关酶及转录调控因子的过表达,考察它们对酿酒酵母芳樟醇耐受性的影响,并通过对酿酒酵母细胞进行定向驯化,筛选耐受性提高的酿酒酵母突变株。【结果】单独过表达ABC转运蛋白(Yor1、Snq2、Pdr5、Pdr15和Pdr18)、ROS调控相关酶(Gre2、Ctt1、Yhb1、Gpx2、Trr1、Trx2和Gsh2)及转录调控因子(Ino2、Yap1、Yap5和Stb5)并不能有效提高酿酒酵母的耐受性,但在传代适应性驯化过程中获得了两株耐受性提高的酿酒酵母突变株,将芳樟醇的致死浓度从430mg/L提高到了645mg/L以上。进一步通过基因组重测序分析揭示了驯化菌株突变位点。其中YBR074W...     

走出中国：酿酒酵母的起源、驯养与演化

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)被广泛应用于酒类酿造和食品发酵等行业,其被人类利用的历史已有近万年。酿酒酵母也是遗传学、分子生物学、基因组学和合成生物学等研究中常用的模式生物。近年来研究者对其自然和驯养种群进行了全球范围的生态学、群体遗传学和群体基因组学等方面的研究,更新了对其生态分布、遗传多样性、自然进化和驯养史以及进化动力等方面的认知。发现酿酒酵母在原始森林等自然环境中普遍存在,并可能偏好阔叶树树干、腐木和周围土壤等生境。中国酿酒酵母的遗传多样性显著高于世界其他地区,该物种最古老的谱系也仅发现于中国,说明中国可能是该物种的起源地。生态适应是塑造该物种群体结构的主要力量,导致其野生和驯养群体之间的明显分化。驯养群体又分化为固态发酵和液态发酵两大类群,每个类群内又形成不同的驯养谱系。该物种野生群体的遗传多样性远高于其驯养群体,而野生群体遗传多样性的形成主要由中性突变引起。中国野生和驯养群体在麦芽糖利用能力、基因组杂合性、子囊孢子形成率和孢子活力等方面表现出显著差异,表明这2个群体采取不同的生活策略来适应其不同的生活环境。驯养群体通过群体或谱系特异性基因拷贝数...     

Effects of beta-amyloid on proliferation and morphology of yeast Saccharomyces cerevisiae

Deposition of beta-amyloid peptide (1–42) (AP) in the brain is an early event linked with pathogenesis of cell injury and death in Alzheimer disease. Previous studies have demonstrated that AP induces cytotoxicity in several types of human cells. Surprisingly, the peptide was found not only to be non toxic for yeast cells, but to stimulate growth of yeast culture. The results are consistent with AP binding to yeast cell as illustrated by binding isotherms with theapparent dissociation constant of 8 × 10^-7 M and B_max of 4.7 × 10⁴ molecules/cell.     

高效合成葡萄糖二酸酿酒酵母工程菌的构建

葡萄糖二酸是天然存在的一种重要二元酸,其在医疗保健和化工工业等领域具有很高的实际应用价值,因此被称为"最具价值的生物炼制产品之一".以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为底盘微生物,文中考察了过量表达肌醇转运蛋白Itr1、融合表达肌醇加氧酶和葡萄糖醛酸脱氢酶以及弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因...