锌指蛋白185 在小鼠睾丸支持细胞中的表达与定位

目的:检测锌指蛋白185在小鼠睾丸支持细胞中的表达,探讨其与精子发生的关系。方法:提取睾丸和支持细胞总RNA,经半定量RT-PCR法检测ZNF185的转录水平;提取睾丸和支持细胞的蛋白质,利用Western blot分析ZNF185的表达量;制备支持细胞爬片,采用免疫荧光技术检测ZNF185的定位。结果:(1)半定量RT-PCR结果显示:在睾丸支持细胞中扩增出ZNF185基因条带。(2)Western blot结果显示:ZNF185在支持细胞中的表达量显著低于在睾丸组织中的表达量。(3)免疫荧光结果显示:ZNF185主要定位于支持细胞胞质中。结论:ZNF185可能参与支持细胞结构与功能的调控,进而影响精子发生过程。     

Bcl-2-like和Bax-like蛋白在白蚁生殖蚁和工蚁精子发生过程中的表达比较分析

为探讨凋亡调节因子Bcl-2和Bax蛋白对白蚁生殖蚁和工蚁性腺发育的影响, 揭示白蚁生殖品级与非生殖品级性腺发育的调节机理, 以尖唇散白蚁Reticulitermes aculabialis为研究对象, 运用免疫细胞化学定位方法对生殖蚁和工蚁精子发生过程中的Bcl-2和Bax蛋白表达进行了研究。结果显示： 生殖蚁和工蚁精子发生过程中从精原细胞至精子时期均有Bcl-2-like和Bax-like的阳性表达。生殖蚁的次级精母细胞、 精子细胞和精子中Bcl-2-like阳性表达率较高, 而在精原细胞和初级精母细胞中阳性率较低; 工蚁在次级精母细胞中最高, 在精原细胞和初级精母细胞中较低。除初级精母细胞期外, 工蚁生殖细胞其他发育阶段Bax-like阳性表达率均显著高于生殖蚁同一阶段生殖细胞。生殖蚁的生殖细胞在精原细胞、 初级精母细胞和次级精母细胞时期Bax-like阳性表达率较高, 发育至精子时期阳性率最低; 工蚁在次级精母细胞、 精子细胞和精子时期Bax-like表达率较高, 在初级精母细胞中表达率最低。在精子发生过程中, 生殖蚁生殖细胞Bax/Bcl表达量比值逐步下降; 而工蚁生殖细胞发育过程中Bax/Bcl表达量比值仅在次级精母细胞期下降, 其他发育时期均升高; 根据Bax/Bcl判断, 精原细胞和初级精母细胞是生殖蚁精子发生过程中主要的凋亡点, 而工蚁除了精原细胞和初级精母细胞外, 精子细胞和精子也是主要的凋亡目标。研究结果表明, 白蚁生殖细胞凋亡与其他动物一样受Bcl-2家族的调节, 在精子发生过程中Bcl-2-like和Bax-like表达具有动态变化规律, 正是这种变化调控生殖细胞在不同发育阶段的生或死; Bcl-2-like和Bax-like对生殖细胞凋亡调节不仅在精子发生中有非常重要的作用, 而且可能与工蚁品级的形成有关。     

类雄激素受体在尖唇散白蚁繁殖蚁和工蚁精子发生中的免疫细胞化学定位

为了比较和探讨类雄激素受体 (androgen receptor-like,AR-like)在白蚁生殖品级和非生殖品级精子发生过程中的作用,运用免疫细胞化学方法对尖唇散白蚁Reticulitermes aculabialis繁殖蚁和工蚁精子发生中的AR-like的定位进行了研究。结果显示：在繁殖蚁和工蚁精子发生过程中都有AR-like免疫阳性细胞的分布,均分布于初级精母细胞的细胞质和细胞核中;与繁殖蚁相比,AR-like在工蚁中的表达较弱。结果提示,AR-like的表达与精子发生过程中初级精母细胞的减数分裂有关,雄激素及其受体通过调控精母细胞的第一次减数分裂来影响白蚁精子的发生。虽然工蚁的精巢发育受抑制,但其精子发生和维持具有与繁殖蚁相同的激素调节机制,能形成精子。本研究为工蚁性腺退化不育而根据群体的变化又可以发育为补充繁殖蚁这一特殊的生理功能提供了组织学依据。     

沙眼衣原体类噬菌体衣壳蛋白CtF的表达及多克隆抗体制备

[目的]预测沙眼衣原中类噬菌体衣壳蛋白CtF的空间结构,表达重组蛋白并制备多克隆抗体。[方法]采用SOPMA和I-TASSER等软件预测CtF的空间结构,利用MEGA6分析其系统发育关系;构建重组质粒pET-28a-CtF,转化至E.coli BL21(DE3)中进行克隆表达;纯化重组蛋白免疫ICR小鼠制备多克隆抗体。[结果]CtF蛋白包含八股β桶状核心结构和环形延伸结构,与已知的衣原体噬菌体VP1蛋白遗传距离较近;重组质粒表达相对分子量约为64 kDa的融合蛋白;免疫小鼠获得免疫血清效价达1∶12 800。[结论]CtF蛋白疑似为沙眼衣原体噬菌体的衣壳蛋白;重组质粒表达相对分子量约为64 kDa蛋白,该蛋白免疫原性良好,为进一步研究其功能奠定了基础。     

Cox-2和Suvrivin蛋白在眼睑基底细胞癌组织中的表达

目的探讨Cox-2和Suvrivin蛋白在眼睑基底细胞癌组织中的表达及临床意义。方法收集武汉大学人民医院和武汉大学中南医院病理科1999-2006年手术切除及活检的眼睑基底细胞癌（basal cell carcinoma,BCC）标本共40例,另取癌周围组织5例作对照。眼睑基底细胞癌发病年龄20-68岁。采用免疫组织化学方法观察各组细胞内Cox-2和Suvrivin蛋白表达的变化。利用HPIAS-2000图像分析系统测定Cox-2和Suvrivin蛋白在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果眼睑基底细胞癌组织中COX-2蛋白呈高表达;癌旁组织中COX-2蛋白呈低表达。眼睑基底细胞癌组织中Suvrivin蛋白呈高表达;癌旁组织中Suvrivin蛋白呈低表达。图像分析结果显示：眼睑基底细胞癌组织与癌旁组织之间COX-2和Suvrivin蛋白的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义（P〈0.01）。结论COX-2、Survivin在眼睑BCC中的异常表达,对眼睑BCC的发生和发展起了重要作用。     

家蚕类泛素化翻译后修饰蛋白NEDD8的cDNA克隆、表达分析和亚细胞定位

【目的】NEDD8是一种重要的蛋白质翻译后修饰蛋白,对底物蛋白的功能具有重要的调节作用。本研究旨在探索家蚕Bombyx mori中NEDD8的功能。【方法】利用RT-PCR技术,从家蚕Bm N细胞中克隆了家蚕NEDD8完整的开放阅读框。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测家蚕NEDD8在不同发育阶段、5龄第3天幼虫不同组织中以及Bm NPV感染Bm N细胞后的相对表达量。通过构建GFP融合表达的重组Bm NPV(B.mori nucleopolyherovirus)感染家蚕Bm N细胞,在共聚焦显微镜下观察NEDD8在细胞中分布情况,用GFP抗体进行Western blot验证。【结果】克隆获得了NEDD8基因。序列分析表明,家蚕NEDD8高度保守,与家蚕泛素蛋白氨基酸序列一致性最高。qRT-PCR分析结果表明,NEDD8在家蚕的不同组织中均有表达,其中头部中表达量最高,其次是丝腺中,而在精巢和卵巢中表达量最低;在家蚕5龄第3天幼虫始到化蛹后第3天NEDD8的表达量开始逐渐增加,化蛾后降至低水平;在家蚕杆状病毒感染Bm N细胞的早期和极晚期NEDD8的表达量都有明显增加。GFP-NEDD8融合表达定位显示NEDD8在Bm N细胞内普遍存在,分布于整个细胞中,并且在感染48 h后存在细胞质内的聚集现象。【结论】NEDD8编码序列在物种间高度保守;NEDD8在家蚕幼虫头部中表达量最高,在化蛹阶段表达量逐渐增加;NEDD8在Bm N细胞内普遍存在并且可能与参与Bm NPV复制。本研究所得结果为进一步研究NEDD8在家蚕中的生物学功能及修饰底物蛋白的作用机制奠定了基础。     

人源类溶菌酶蛋白6在毕赤酵母中的重组表达及活性分析

利用毕赤酵母(Pichia pastoris)重组表达人源类溶菌酶蛋白6(human lysozyme-like protein6,h Lyzl6),对其酶学性质进行分析。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成h Lyzl6基因,将其连接至含有乙醇氧化酶启动子(AOX1)的p PIC9K质粒构建重组表达载体p PIC9K-hlyzl6;重组表达载体经线性化后电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞,经G418筛选获得高拷贝重组菌株后进行甲醇诱导表达。经甲醇诱导72 h后发酵液上清中酶活性达到最高值,发酵液上清经SDSPAGE检测在14.8 k Da处有重组h Lyzl6蛋白条带,分子量符合预期,通过甲壳素亲和层析可对其进行纯化;采用比浊法测定h Lyzl6酶学活性,结果表明h Lyzl6对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)有较好的杀灭作用,最适反应温度为40℃,最适p H为5.5,其酶活力为54 700U/mg,Cu2+对其活性有明显抑制,EC50为30.2799 mg/L。采用基因工程方法首次在毕赤酵母GS115成功表达了重组h Lyzl6,证实其在体外具有杀菌活性,初步揭示h Lyzl6在男性生殖系统先天性免疫中发挥了一定作用,为进一步研究h Lyzl6的功能和应用开发奠定了基础。     

LIVIN和HLA-I类分子在肾透明细胞癌中的表达及其临床意义

目的:探讨凋亡抑制蛋白Livin与人类白细胞抗原(HLA)I类分子在人类肾脏透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)中的表达及其临床意义。方法:选择哈尔滨医科大学附属第一医院2007年12月至2011年12月收治的拟行肾癌根治术的患者80例,应用免疫组织化学方法检测80例ccRCC组织与10例癌旁正常肾组织中Livin及HLA-I类分子的表达,并分析其与患者临床病理特征之间的关系。结果:10例癌旁正常肾组织中均未见Livin的阳性表达,而HLA-I类分子的阳性表达率为100%。ccRCC组织中,Livin的阳性表达率及HLA I类分子表达下调百分率分别为41(51.25%)例和48(60.00%)例,Livin的阳性表达率与正常组相比差异有统计学差异(P0.05)。ccRCC组织中Livin的阳性表达率与淋巴结转移、组织分化程度显著相关(P0.05),而HLA I类分子的表达下调百分率与患者的性别、年龄、肿瘤分级、淋巴结转移及分期均无相关性(P0.05)。ccRCC组织中Livin的表达与HLA I类分子的表达亦无显著相关性(P0.05)。结论:Livin、HLA I类分子表达异常参与了ccRCC的发生、发展过程,Livin可能成为ccRCC的一个重要预后指标和治疗靶点。     

PSCA和Oct-4蛋白在眼睑基底细胞癌组织中的表达及其意义

目的 探讨PSCA和Oct-4蛋白在眼睑基底细胞癌组织中的表达及其意义.方法 收集武汉市中心医院和武汉大学人民医院病理科2002～2009年手术切除及活检的眼睑基底细胞癌（basal cell carcinoma,BCC）标本共20例,另取癌周围组织5例作对照.采用免疫组织化学方法观察各组细胞内PSCA和Oct-4蛋白的表达.利用图像分析系统测定PSCA和Oct-4蛋白在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率.结果 （1）PSCA的表达在眼睑基底细胞癌中,PSCA呈高表达,而癌周围组织中PSCA呈低表达.经q 检验,眼睑基底细胞癌组织与癌旁组织之间PSCA的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义（P〈0.05）.（2）Oct-4的表达眼睑基底细胞癌组织中Oct-4蛋白呈高表达;癌旁组织中Oct-4蛋白呈低表达.图像分析结果显示：眼睑基底细胞癌组织与癌旁组织之间Oct-4蛋白的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义（P〈0.05）.结论 在眼睑基底细胞癌组织中PSCA和Oct-4蛋白的高表达可能是＂癌干细胞＂,PSCA和Oct-4蛋白也许参与了眼睑基底细胞癌的发生和发展.     

Temporal expression of c-kit in spermatogenesis of two grasshopper species

Two species of grasshoppers, Calliptamus abbreviatus （Ikonn.） and Shirakiacris shirakii （I. Bol.）, were collected randomly in the Siping area of Jilin Province, China. By using immunohistochemical methods and statistical analysis, we observed and compared the temporal expression of c-kit protein in four representative stages of spermatogenesis of the two grasshoppers, namely： spermatogonia; primary spermatocyte; secondary spermatocyte; and mature sperm. Results showed that there was c-kit positive temporal expression at each stage of spermatogenesis, but there were different positive expression levels： （i） weak positive expression of c-kit protein appeared in spermatogonia and the positive granules were thinner; （ii） strong positive expression of c-kit protein existed in primary spermatocyte and positive granules became biggest among all developmental stages; （iii） c-kit positive expression stayed stronger in secondary spermatocyte while positive granules became thinner; （iv） there was a strong positive expression of c-kit and thinner positive granules in mature sperm, which distributed on head and tail; （v） the biggest c-kit positive granules had been found massing at the end of spermary; and （vi） significant differences of c-kit positive expression existed in spermatogenesis between two species of grasshoppers. The results indicated that c-kit protein may play a crucial role in spermatogenesis and even retain the physiological action of sperms and fertilization in grasshoppers.     

五种棺头蟋核型的比较研究

报道了中国5种棺头蟋的核型：石首棺头蟋Loxoblemmus equestris, 2n=17, XO(♂);小棺头蟋L. aomoriensis, 2n=11, XO(♂); 哈尼棺头蟋L. haani, 2n=11, XO(♂);多伊棺头蟋L. doenitzi, 2n=11, XO(♂)和窃棺头蟋L. detectus, 2n=11,XO(♂)。并应用核型似近系数及进化距离对这5种蟋蟀作了聚类分析,得出5种蟋蟀的演化方向为石首棺头蟋→小棺头蟋→哈尼棺头蟋→多伊棺头蟋→窃棺头蟋。     

异翅负蝗配子发生过程中c-kit蛋白表达动态

应用免疫组织化学和生物统计分析相结合的方法,对异翅负蝗Atractomorp haheteroptera Bei Bienko配子发生过程中c-kit特异表达特点和动态进行研究。结果表明,(1)精子发生过程中,精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和成熟精子中均有不同程度的c-kit蛋白表达,精巢末端还有较粗大的阳性颗粒分布;(2)卵子发生过程中,第1~6阶段卵母细胞中有不同程度的c-kit蛋白特异性表达,但随着卵黄发生的开始逐渐消失;(3)此外,滤泡细胞、输卵管和受精囊的腺细胞中有c-kit蛋白颗粒的存在;(4)从c-kit蛋白季节动态变化看,精子发生和卵子发生中的阳性表达都随着时间的延续出现下降的态势。因此,c-kit蛋白的特异性表达提示该蛋白参与配子发生过程的阶段性调控,具有重要的生理作用。     

Up-regulation of Arl4a gene expression by broccoli aqueous extract is associated with improved spermatogenesis in mouse testes

Introduction: Broccoli (Brassica oleracea) is well known for its properties as an anticancer, antioxidant, and scavenger of free radicals. However, its benefits in enhancing spermatogenesis have not been well established.Objective: To study broccoli aqueous extract effects on sperm factors and the expression of genes Catsper1, Catsper2, Arl4a, Sox5, and Sox9 in sperm factors in mice.Material and methods: Male mice were divided randomly into six groups: (1) Control; (2) cadmium (3 mg/kg of mouse body weight); (3) orally treated with 200 µl broccoli aqueous extract (1 g ml^-1); (4) orally treated with 400 µl of broccoli aqueous extract; (5) orally treated with 200 broccoli aqueous extract plus cadmium, and (6) orally treated with 400 µl of broccoli aqueous extract plus cadmium. We analyzed the sperms factors and Catsper1, Catsper2, Arl4a, Sox5, and Sox9 gene expression.Results: An obvious improvement in sperm count and a slight enhancement in sperm motility were observed in mice treated with broccoli extract alone or with cadmium. Sperm viability was reduced by broccoli extract except for the 200 µl dose with cadmium, which significantly increased it. Interestingly, Arl4a gene expression increased in the 400 µl broccoli- treated group. Likewise, the Arl4a mRNA level in mice treated with cadmium and 200 µl of broccoli extract was higher than in the cadmium-treated mice. Furthermore, broccoli extract enhanced the mRNA level of Catsper2 and Sox5 genes in mice treated with 200 µl and 400 µl broccoli extract plus cadmium compared with the group treated solely with cadmium.Conclusion: The higher sperm count in broccoli-treated mice opens the way for the development of pharmaceutical products for infertile men.     

花胫绿纹蝗和疣蝗配子发生时原癌基因c-kit特异性表达比较研究

应用免疫组织化学和生物统计分析相结合的方法,对花胫绿纹蝗Aiolopus tamulus (Fabricius)和疣蝗Trilophidia annulata (Thunberg)配子发生过程中原癌基因c-kit特异表达进行了比较研究。结果表明：（1）精子发生过程中,精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和成熟精子中均有不同程度的c-kit蛋白表达,精巢末端还有较粗大的阳性颗粒分布;（2）卵子发生过程中,第1～6阶段卵母细胞中有不同程度的c-kit蛋白特异性表达,但随着卵黄发生的开始逐渐消失;（3）2种蝗虫配子发生过程中c-kit表达存在种间差异。     

Expression and localization of DNA topoisomerase II during rat spermatogenesis

The potential role(s) of DNA topoiosmerase II (topo II) during chromatin changes that characterize different stages of spermatogenesis was investigated in the rat by an analysis of the expression and localization of topo II mRNA and protein in individual spermatogenic cells. Expression of topo II was restricted to spermatogonia, spermatocytes, and round and early-elongating spermatids. Two protein bands of 177 and 170 kDa were detected in immunoblots of spermatocytes and round spermatids, while bands of 148 and 142 kDa were prominent in preparations of elongating spermatids. Topo II levels and distribution patterns, as observed by immunofluorescent microscopy, exhibited cell type-specific variations. Differences in topo II staining patterns were also apparent when nuclear matrices of spermatogenic cells were prepared with different extraction conditions. In addition to its possible function as a structural component, topo II, associated with nuclear matrix preparations from spermatogenic cells, possessed catalytic activity. These observations indicate that both the 177 and 170 kDa and the 148 and 142 kDa forms of topo II share similar structural and functional properties. Topo IIβ mRNA was transcribed in rat spermatogenic cells at 6.2 kb. Relative levels of topo IIβ mRNA were high in spermatogonia and spermatocytes, and decreased in both round and early-elongating spermatids. Changes in topo II expression levels and localization patterns represent distinct stage-specific markers for the maturation of spermatogenic cells, and are consistent with the involvement of topo II in mediating DNA modifications and chromatin changes during spermatogenesis. © 1996 Wiley-Liss, Inc.     

运用RAPD技术对棺头蟋属昆虫亲缘关系的研究

用RAPD技术研究了棺头蟋属Loxoblemmus 9个种的亲缘关系。研究中每种使用了3个标本,试验所用的54种随机引物中,有9种引物能扩增出清晰而稳定的多态性片断,多态性片断共计193条。根据扩增结果,计算了个体间及种间扩增片断共享度和遗传距离,用UPGMA法进行聚类分析,构建系统树。每个种均各自聚为一类,聚类结果所呈现的属内种间关系与传统分类研究基本一致。