高效转移基因组DNA的阳离子法

目前把外源基因引入植物的方法通常是只利用克隆基因作为供体DNA.然而,许多重要的农艺性状是由多基因或未知基因所控制.借助于原生质体融合或染色体转移已完成了未克隆基因组DNA对原生质体的转移,获得了含多基因大片段DNA的转移.但是,这些方法太难且复杂,常常只能采用限定量的基因型. Metapontum Agrobios的N.M.Antonelli和依阿华州立大学的J.Stadler开发了把未克隆基因转移到植物细胞的简便方法.此方法(以前曾用于哺乳动物细胞转化)过程是:(1)先用聚合阳离子Polybrene(Aldrich)预处理原生质体,然后加入DNA或(2)将     

去唾液酸糖蛋白受体和脂质素协同介导原代大鼠肝细胞基因转移

以阳离子脂质素作为DNA运载体 ,以肝细胞去唾液酸糖蛋白受体 (ASGPR)的天然配体去唾液酸胎球蛋白 (ASF)作为导向配体 ,用于介导原代大鼠肝细胞基因转移 .结果表明转染复合物中加入ASF可明显提高肝细胞转染率 ,并且明显降低高比例脂质素 DNA复合物转染细胞时对细胞的毒性作用 ,ASGPR的化学合成配体半乳糖基白蛋白在基因转移中亦与ASF具有同样的作用 .因此ASGPR可与阳离子脂质素协同介导肝细胞基因转移 ,为原代肝细胞基因转移提供了一种更为简便、实用、有效的方法 ,有应用于肝基因治疗的前景 .     

关于痢疾菌苗的研究现状(续)

<正>下面讨论志贺氏菌质粒的基因产物。这是Hale的初步工作及志贺氏菌毒株与侵袭性大肠杆菌微细胞的初步应用。由于会出现分裂不完善的突变体,致使其细胞的一部分分裂后不能遗传染色体DNA,细胞发芽部分太小不能包含染色体,只能包含大质粒。微细胞可以从营养细胞中分离到,在这些种群中从新合成蛋白质的是由质粒而不是染色体DNA。来自弱毒亲本的微细胞不能侵入     

微细胞介导人14号染色体自A9细胞转移至DT40细胞

为了获得含人14号染色体的DT40细胞,用于人抗体基因的表达研究.本研究利用微细胞介导的染色体转移技术,将A9细胞中的人14号染色体转移至DT40细胞中.首先,摸索秋水仙胺诱导A9细胞微核形成最佳浓度与最佳时间,以终浓度为10 mg/mL的细胞松驰素B破坏细胞骨架,离心分离微细胞,获得的微细胞依次经8μm、5μm、3μm滤膜过滤后与受体细胞DT40融合,细胞铺板后加入G418筛选.然后,对长出的抗性克隆进行基因组DNA检测及FISH杂交,分析人14号染色体在DT40杂合细胞克隆中的存在情况.结果显示,成功获得含人14号染色体的DT40(#14)细胞,三轮试验共获得抗性克隆30个,人14号染色体有效转移率为1×10-6.实验结果表明,人14号染色体完整的自A9细胞转移至DT40细胞,获得的DT40(#14)细胞可用于制备含人抗体基因的人类人工染色体,用于人抗体基因的表达研究.     

花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定

利用非对称体细胞杂交技术, 获得芸薹属花椰菜(Brassica oleracea var. botrytis)与黑芥(B. nigra)的种间杂种, 实现了野生种质抗病基因向甘蓝类蔬菜作物的渗透。以具有良好再生能力的花椰菜下胚轴原生质体作为融合受体, 具有抗黑腐、黑胫和根肿病优良性状的黑芥叶肉原生质体作为融合供体, 用不同强度的UV射线处理后, 利用PEG方法诱导供、受体原生质体融合。培养后获得170棵再生植株, 选取来自40个不同愈伤组织的40棵单株进行形态学观察及RAPD和SRAP分子标记检测, 结果表明其中30棵为体细胞杂种。染色体计数显示, 约23%杂种植株的染色体数目小于供、受体染色体数之和。用流式细胞仪测定DNA含量显示, 杂种植株DNA含量是受体的2-4倍, 20%杂种植株DNA含量小于供、受体之和。     

花椰菜与黑芥非对称体细胞杂种的鉴定分析

选用兼具抗黑腐病、黑胫病、根肿病的野生种质黑芥(B.nigra)作为供体,具有良好原生质体培养能力的花椰菜(Boleracea var.botrytis L.)基因型"0307"作为受体,供体叶肉原生质体经不同剂量UV照射处理后,通过PEG介导,与不经任何处理的受体下胚轴原生质体融合,培养获得再生植株.形态学观察显示再生植株的表型多样,呈偏向受体花椰菜类型及中间类型分布:SRAP分子标记特征表明,杂种中受体的遗传信息较为完整,而来自供体的特异扩增带丢失量约为20.0%-97.8%,且不同杂种中存在热点丢失序列;约23.0%的再生植株其染色体数目小于供、受体染色体数之和;采用流式细胞仪对再生株的细胞DNA含量进行分析,结果显示,20%的植株其DNA含量小于供、受体DNA含量总和.对22棵再生植株进行了黑腐病人工接种抗性鉴定,17棵再生植株表现良好抗性,初步证明通过非对称体细胞杂交技术已将外源抗性基因转入花椰菜中.实验表明UV辐射处理,导致再生植株中供体遗传信息的部分丢失或者染色体在不同程度上的消减,获得了花椰菜与黑芥的非对称体细胞杂种,但UV的剂量效应不明显.     

用一种新型基因枪将外源基因转入水稻细胞(简报)(英文)

本文介绍了一种设计上改进的基因枪,用这种新型基因枪将外源基因转移到水稻细胞获得了表达。用包有pBI 121质粒DNA的钨微弹轰击水稻悬浮细胞以及成熟种子胚后,在悬浮细胞中检测到了外源基因(GUS)的表达。胚诱导的愈伤组织在无抗生素选择的条件下扩增并分化、再生,共获得30株绿色小植株。经DNA斑点杂交测得其中两株的植物总DNA中存在GUS基因。Southern杂交分析证实GUS基因整合到了水稻基因组.     

用人DNA介导的基因转移修复中国仓鼠细胞的HPRT缺陷

 中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)经N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱变和6-巯基鸟嘌呤(6-TG)选择,得到稳定的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)缺陷细胞株,酶活性仅为野生型的6.5％。用磷酸钙共沉淀法和电脉冲法向HPRT-细胞转移人宫颈癌细胞(HeLaS_3)基因组DNA,纠正了CHO细胞的HPRT缺陷。酶活性提高了6.9倍,达到野生型的45％。用Alu序列探针进行分子杂交,证实经过基因转移并连续传代15次以上的受体细胞中含人DNA序列。表明人的有关基因已稳定地整合到CHO细胞的染色体中。     

基因枪在水稻遗传转化中的应用及其转化技术的优化

1983年Zambryski等人用根瘤农杆菌介导法进行烟草基因转移,获得了世界上首例转基因植株.随后,应用DNA直接导入技术如电击法(electroporation)和PEG介导法(PEG—mediated)成功地获得了转基因水稻植株.近年来,随着基因枪技术的建立和发展,水稻遗传转化成功的报道逐年增多.目前基因枪技术在植物遗传转化中的应用超过了根瘤农杆菌介导和其它转化方法的应用.这是因为基因枪转化技术不受植物种类的限制,不需要以原生质体作为转化的受体,可以将外源基因直接导入细胞、组织或器官,因而克服了根瘤农杆菌     

超声诱导基因转移

植物基因工程的关键技术之一,是把外源基因导入植物细胞.目前,植物细胞的基因转移方法有:(1)农杆菌Ti或Ri质粒载体法;(2)病毒载体法;(3)磷酸钙核酸沉淀吸收法;(4)PEG介导DNA直接转移法;(5)脂质体载体法;(6)显微注射法;(7)电激基团转移法:(8)基因枪喷射法;(9)激光微束法等.前两种方法是以生物体作为载体介导基因转移,属生物方法中间三种方法是以化学药物介导基因转移.属化学方法;后四种是以物理手段介导基因转(?)属物理方法.由于物理方法操作比较简单,不受宿主范围的限,因此近年(?)发展迅速.     

染色体转位(Translocation)与癌症

许多种癌症是由染色体转位引起的。这是因为转位使原癌基因活化并过量表达,或是转位使基因融合。大部分已确认的转位都与免疫系统(免疫球蛋白和T细胞受体基因)本身固有的V(D)J重组有关。此外,外界因素,如电离辐射和某些化学药物等因素使DNA双链断裂,也可能导致染色体转位和癌变。了解染色体转位和癌变机制,对临床诊断和防治具有重要应用价值 。     

微细胞介导的染色体转移技术及其应用

微细胞介导的染色体转移技术（MMCT）是一项利用微细胞将外源染色体转入受体细胞的技术。该技术是在细胞融合的基础之上发展起来的,是细胞融合技术的进一步细化,在当代生物的若干领域里得到了广泛的应用。～些肿瘤抑制基因、端粒酶抑制基因、诱导衰老基因以及DNA修复基因都是通过MMCT技术取得细胞内识别和定位,由此促进了针对这些基因的功能研究,并为相关疾病的治疗提供了依据。同时,MMcT技术也为其他领域如表观遗传学、基因组印迹、哺乳动物人工染色体等方面的进一步研究提供了有力的手段。与体细胞核移植技术结合,MMCT还可用于建立具有重要医学药用价值和优良农业生产性状的转染色体动物,显示其具有广阔的应用前景。本文概述了MMCT技术及其在相关领域的应用与发展趋势。     

细菌和放线菌质粒DNA的分离

到目前为止,所发现的细菌和放线菌的质粒DNA都是共价闭合超盘旋的环状结构。它的碱基组成与染色体DNA不同,分子量较染色体DNA小得多,有的质粒可以通过接合作用有效地转移到受体细胞中去。常利用质粒的这些特性来分离它们。现将几种分离质粒的方法介绍如下。     

麦类作物遗传转化(英)

麦类作物包括小麦 (TriticumaestivumL .)、硬粒小麦 (Triticumturgidumconv .durumDest.e.m)、大麦 (HordeumvulgareL .)、黑麦 (SecalecerealL .)、燕麦 (AvenasativaL .)及小大麦 (×TritordeumAschersonetGraebuer.)。自从基因枪被发明以来 ,科学家们已经利用来自麦类作物的幼胚、盾片、成熟种子胚、花粉粒、花药、幼穗、叶基组织、发芽种子幼苗的顶端分生组织及其愈伤组织或培养物作为外植体 ,通过基因枪、农杆菌介导、PEG法、电激法、微注射法、硅化纤维素介导、幼穗注射法等技术先后将一些选择标记基因、报告基因和有用的目的基因如抗真菌、抗虫、籽粒品质、抗干旱基因等转化到麦类作物中。转基因植物表现为抗性增强或籽粒的加工品质提高和营养成份增加。被转化的基因通常以单位点多拷贝的形式随机整合到受体细胞的基因组中 ,并以孟德尔规律遗传。整合位点一般分布在染色体的近端粒区域 ,整合的拷贝数大多为 5～ 10个拷贝 ,最高可达到 5 0个拷贝。在转化过程中 ,被转化的质粒上的片段包括选择标记基因、目标基因、甚至质粒的抗生素基因和其他无关序列 ,随机地连接并形成多个分子量大小不等 ,组成成分不同的分子簇 ,或首先由其中一个分子簇整合到植物基因组中 ,这会导致在整合位点附近产生“热点     

普通小麦与簇毛麦对称及不对称体细胞杂交的比较

由长期继代的小麦品种济南177悬浮系制备原生质体为受体,取继代一年的簇毛麦愈伤组织不经照射或经⁶⁰Co-g射线照射,剂量分别为40,60,80Gy(1.3Gy/min),然后分离原生质体为供体,在PEG诱导下分别进行了对称及不对称融合(g融合).经形态学、细胞学、同工酶及5SrDNA间隔序列分析鉴定,对称及不对称融合均高频率地获得了体细胞杂种细胞系,并在对称融合及低剂量g辐照组合得到再生杂种植株.基因组原位杂交的结果证实,对称及不对称融合杂种中异源染色体间不同方式的易位及重组均普遍存在.g辐照存在剂量效应.结果表明:对称及不对称体细胞杂交均可有效地实现核基因的转移与重组,而不对称体细胞杂交还可直接导致染色体小片段易位,显示出此方法在小麦育种上的独特优势.     

微囊介导的染色体转移技术及其应用

微囊介导的染色体转移技术是从细胞融合技术演变而来的,它是把供体细胞用秋水仙胺和细胞松弛素B处理,制备成含有一条或几条染色体的微囊,再与受体细胞融合的技术.     

EB病毒介导细胞融合的研究

Enders和Peeble首次使用麻疹病毒诱导培养细胞的融合。随后Okada证实仙台病毒是一种高效的病毒类融合因子。为人工诱发体细胞杂交技术奠定了基础。此后又相继发现一些DNA病毒也有介导细胞融合的能力,其中研究得较为广泛和深入的单纯是疱疹病毒。最近Bayliss和Wolf的实验显示EB病毒能够介导Raji细胞之间,以及Raji细胞与不存在EB病毒受体的T淋巴细胞等的融合。     

利用PEG法对GUS基因在几种杨树原生质体中瞬间表达的研究(简报)

建立合适的外源基因转移系统是植物基因工程的一个至关重要的方面。外源基因的瞬间表达能够在短时间内确定外源基因是否转移到植物细胞中,从而确定重组质粒DNA上的启动子对于某一受体系统是否有效。利用PEG(聚乙二醇)法或电激法进行直接基因转移在火     

小鼠的克隆着丝粒(SFA)DNA的鉴定

着丝粒是真核染色体上的重要细胞器,是真核染色体作为基因载体行使其遗传功能的关键结构.着丝粒DNA首先是从酵母中分离克隆并被用以构建酵母人工染色体.鉴于真核有丝分裂机制研究和构建高等动物人工染色体研究的需要,从分离和检定过的小鼠着丝粒DNA库中筛选出了6#着丝粒DNA(SFADNA),并用荧光原位杂交法(FISH)对其进行了在染色体上的定位检定.用缺口平移法和PCR法分别标记了SFA DNA和SFA DNA中的小鼠寡份卫星DNA作为探针,分别与小鼠腹水癌细胞和小鼠L929细胞进行原位杂交;并用荧光抗体显示杂交信号的位置.结果,SFA DNA在两种细胞的中期染色体上的杂交信号都位于亚末端的初级缢痕处,表现为单一粗大的斑块.寡份卫星DNA在两种细胞的中期染色体上的杂交信号亦都位于亚末端的初级缢痕处,但极大多数的斑点均表现为成对的细小斑点.初级缢痕正是染色体着丝粒所在的特征性部位.故以上结果说明定位于该部位的克隆的6#SFA DNA,和其中的小鼠寡份卫星DNA都来源于小鼠着丝粒DNA.     

花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定

利用非对称体细胞杂交技术,获得芸薹属花椰菜（Brassica oleracea var．botrytis）与黑芥（B．nigra）的种间杂种,实现了野生种质抗病基因向甘蓝类蔬菜作物的渗透。以具有良好再生能力的花椰菜下胚轴原生质体作为融合受体,具有抗黑腐、黑胫和根肿病优良性状的黑芥叶肉原生质体作为融合供体,用不同强度的UV射线处理后,利用PEG方法诱导供、受体原生质体融合。培养后获得170棵再生植株。选取来自40个不同愈伤组织的40棵单株进行形态学观察及RAPD和SRAP分子标记检测,结果表明其中30棵为体细胞杂种。染色体计数显示,约23％杂种植株的染色体数目小于供、受体染色体数之和。用流式细胞仪测定DNA含量显示,杂种植株DNA含量是受体的2—4倍,20％杂种植株DNA含量小于供、受体之和。