茶碱激活型RNA分子开关的构建及在枯草芽胞杆菌中调节外源基因表达的性能

枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis在工业生物技术以及合成生物学领域作为一种重要的微生物可广泛用作代谢工程、重组蛋白表达以及新型基因电路的底盘。在B. subtilis中构建基于非编码RNA的高精准调节元件,能够实现不依赖蛋白质因子的基因表达调控,丰富B.subtilis基因表达通用工具。通过基因工程手段,设计了基于茶碱适体域的核糖开关E和适体核酶AZ调节元件,并与不同的B.subtilis内源组成型启动子适配,构建出茶碱激活型基因表达控制元件。测定这两种调节元件与6种组成型启动子组合匹配下报告基因GFP的荧光强度,鉴定并分析各调控元件的工作性能。并进一步以红色荧光蛋白mCherry和普鲁兰酶两种不同的异源蛋白验证核糖开关或适体核酶与启动子的最优组合。结果表明,同一种RNA调节元件与不同启动子组合呈现不同水平的调控效率。在核糖开关与启动子的组合中,启动子PsigW和核糖开关E组合(sigWE)对GFP表达的诱导率最高,达到16.8。在适体核酶与启动子的组合中,AZ与启动子P43、PrpoB组合(P43AZ和rpoBAZ)的诱导率最高,分别达到了6.1和6.2。进一步验证结果显示,sigWE调控mCherry的诱导率最高(9.2),而P43E调控普鲁兰酶的诱导率最高(32.8),产酶水平达到了81U/mL。核糖开关和适体核酶对GFP、mCherry、普鲁兰酶均能实现调控,但是不同元件组合的调控性能有所差异,对不同基因的调控效果也不尽相同。     

新型基因表达调控元件——人工核糖开关的构建及筛选

核糖开关作为一种新发现的RNA元件,可以高效、准确、快速地执行基因调控任务,且免疫原性低,有可能在将来以顺式模块的方式应用于未来的基因治疗。近年来已经成功构建了多种人造核糖开关,构建方法主要是利用人工适体元件与基因表达调控元件组装,或者是在天然核糖开关基础上进行改造。文中全面综述了涉及人工核糖开关设计及筛选的技术,讨论了可以用于哺乳细胞、响应非天然配体信号、调控特征为热力学和动力学控制的核糖开关的设计新策略,并对核糖开关的筛选构建策略及其在基因治疗及新型药物开发领域的应用前景进行了展望。尽管目前将核糖开关设计成为功能强大的新型基因调控系统还面临很大的困难,但通过构效关系的研究、计算机辅助设计、体外筛选及细胞内筛选技术、高通量优化筛选等技术的综合应用,核糖开关一定可以成为有力的基因调控工具,如能成功应用则可大大促进基因治疗临床化的进程。     

核糖开关的结构和调控机理

一种新发现的RNA分子——核糖开关,通过感知代谢物浓度的变化调控目标基因的表达。它可以调整自身的结构直接结合代谢物小分子,而不需要蛋白因子的参与。在原核生物中发现了大量的核糖开关,在真核生物如植物和真菌中也发现了核糖开关。核糖开关由适体域和表达平台两个功能域组成,能在不同水平调控基因的表达,如转录终止、翻译起始、mRNA剪辑和加工。核糖开关不需要蛋白因子的参与,因此人们认为它可能是古代RNA世界的遗留物。核糖开关作为RNA传感器可以设计成一种基因控制元件,在未来的基因治疗方面可能具有很大的应用前景。     

核糖开关的结构和配体结合规律

核糖开关是一种RNA固有的基因表达调控系统。近年来,核糖开关的应用受到科研工作者的广泛关注,其结构与功能的研究也越来越受到重视。核糖开关具有哪些结构特征和调控机制,它是如何识别目的配体,又怎样与目的配体紧密结合,全面了解这些机制将为探索新型核糖开关,设计人工高效核糖开关提供重要思路。本文对核糖开关结构特征和调节机制、适体筛选、配体结合规律进行简要介绍。     

核糖开关及其在抗菌药物方面的研究进展

核糖开关是一类与核酸、氨基酸、金属离子、糖类衍生物以及辅酶等特异性配体结合的RNA元件,它与配体结合后通过调控相应下游的基因表达起到控制细胞生命及活动的作用。目前核糖开关是基因调控方面的研究热点,应用于大量筛选工程菌株、构建新型生物传感器以及作为抗菌药作用的新靶点。综述了几种主要的核糖开关(如:嘌呤核糖开关、赖氨酸核糖开关、环二鸟苷酸核糖开关、glm S核糖开关、TPP核糖开关、FMN核糖开关等)在抗菌药物靶点方面的研究进展。     

glmS核糖开关研究进展

glmS核酶是存在于革兰氏阳性细菌中,对葡糖胺-6-磷酸(GlcN6P)的合成起反馈抑制作用的核糖开关。同时,glmS核糖开关是一种位于glmS基因5′非翻译区的自剪切核酶。glmS核糖开关/核酶通过结合GlcN6P后自剪切抑制下游基因glmS的表达。对glmS核糖开关结构和功能的研究将有助于开发新的抗生素作用靶点。本文对glmS核糖开关的结构和功能进行阐述并介绍glmS核糖开关近年来的研究进展和应用。     

依赖于5′端非编码区高级结构的真核生物mRNA翻译调控

翻译水平的调控是真核基因表达调控的重要环节.近年来的研究表明,许多真核基因的翻译依赖于RNA 5′端非编码区的结构元件.一些小结构元件,如铁离子反应元件,具有1个茎环结构,由铁离子介导控制转铁蛋白的翻译. 核糖开关通过结合特定代谢分子在2种结构状态下切换,调控可变剪接和翻译起始.另1个高度结构化的mRNA元件是内部核糖体进入位点,通过富集核糖体和起始因子促进基因的表达.本文综述了依赖于小结构元件、内部核糖体进入位点和核糖开关的真核基因翻译起始调控相应的研究成果和研究方法.对于研究的前景以及可能存在的挑战也作出阐述.     

依赖于5′端非编码区高级结构的真核生物mRNA翻译调控

翻译水平的调控是真核基因表达调控的重要环节.近年来的研究表明,许多真核基因的翻译依赖于RNA5′端非编码区的结构元件.一些小结构元件,如铁离子反应元件,具有1个茎环结构,由铁离子介导控制转铁蛋白的翻译.核糖开关通过结合特定代谢分子在2种结构状态下切换,调控可变剪接和翻译起始.另1个高度结构化的mRNA元件是内部核糖体进入位点,通过富集核糖体和起始因子促进基因的表达.本文综述了依赖于小结构元件、内部核糖体进入位点和核糖开关的真核基因翻译起始调控相应的研究成果和研究方法.对于研究的前景以及可能存在的挑战也作出阐述.     

基于核糖开关的新型基因表达调控系统的应用

核糖开关是能对细胞环境的改变做出反应的顺式作用元件,通过改变自身的构象实现对基因表达的调控。基于核糖开关调控方式简洁,无需蛋白质参与,响应迅速,且自身片段小,结构简单,易于设计和改造等特性使其在生物医学领域体现出诸多应用优势。对核糖开关的结构,调节机理以及这种新型基因表达调控系统在基因治疗、抗生素新靶点的开发、病毒疫苗的安全控制、新型核糖选择器和生物体内传感器的应用进行了综述,旨为启示我国核糖开关的新型应用。     

核糖核酸调节子的构建与即时检测中的应用*

合成生物学专注于可重复利用模块和元件的工程化设计,并在生物系统中表现出良好的行为和功能。在无细胞蛋白表达系统中,核糖核酸调节子作为即时检测中的重要传感元件,通过靶标分子的诱导使其自身结构发生变化,进而调控下游基因的表达。系统介绍不同类型的核糖核酸调节子及其作用原理,包括一代核糖核酸调节子、toehold开关、功能拓展的核糖核酸调节子和核糖开关。详细阐明构建核糖核酸调节子的设计-测试-分析过程:计算机辅助设计、基因表达测试和结构功能化分析。汇总基于核糖核酸调节子的体外即时检测应用,重点总结toehold开关介导的病原菌核酸检测和核糖开关参与的小分子检测。讨论当前无细胞即时检测的特点、挑战和发展趋势,为开发新型核糖核酸调节子和即时检测工具提供思路和参考。     

环二鸟苷单磷酸核糖开关的结构与功能

环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)是细菌中广泛存在的一类核苷类第二信使分子,能够调控细菌的生物被膜形成、运动性、黏附、毒力以及胞外多糖的产生等众多生理活动。核糖开关是m RNA 5′-非翻译区(5′-Untranslational region,5′-UTR)的一段RNA序列,包含可以识别并结合配体的保守序列——适配体区(Aptamer domain,AD),以及结构多变、可以调控下游编码基因的表达平台区(Expression platform,EP)。当代谢物分子浓度比较高时,其与适配体区结合,引起下游的表达平台区发生构象变化,进而实现对下游基因的调节。目前已发现c-di-GMP-Ⅰ和c-di-GMP-Ⅱ两类c-di-GMP的核糖开关。它们通过特异性地结合c-di-GMP,调控种类繁多的下游基因的表达。c-di-GMP-I核糖开关分布广泛,尤其在厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)的细菌中最为丰富。c-di-GMP-Ⅱ核糖开关具备变构核酶的功能,结合c-di-GMP后在其非典型剪切位点处发生结构变化,调节下游基因表达。文中围绕c-di-GMP核糖开关的发现、功能、分类以及下游调控基因的功能进行综述与分析。     

核糖开关与基因表达调控

核糖开关(riboswitch)是近几年基因表达调控研究的一个热点.核糖开关位于mRNA的非翻译区(untranslated regions, UTR),能够直接感受胞内外信号并引起自身二级结构的变化,在转录或后转录（翻译和mRNA稳定性）水平实现对下游相关基因的表达调控,该过程不依赖于包括蛋白质在内的其它任何因子的作用. 根据现已发现的核糖开关所能识别的信号因子类型,可以将其分为4类,即小分子代谢物、金属离子、环境因素及空载tRNA敏感的核糖开关;其中,小分子代谢物敏感的核糖开关是发现和研究最多且最深入的一类. 随着研究的深入,将会有更多的核糖开关被发现,这不仅有助于理解生物进化与环境适应性,而且在生物学基础研究,新型药物的开发以及工业生产领域都将发挥重要作用.     

核糖开关的研究及应用

核糖开关是一类自然界中天然存在的适配子,通过结合小分子代谢物调控基因的表达。它位于特定的mRNA非编码区,可以不依赖任何蛋白质因子而直接结合代谢物并发生构象变化,在转录和翻译水平上参与调控生物的基本代谢途径。目前已知核糖开关不仅广泛存在于细菌的代谢相关基因中,还存在于某些真菌和植物中。对核糖开关的深入研究将为基因功能研究、生物传感器研发以及新型抗菌药物开发等提供新的途径。     

仅基于RNA元件构建可诱导哺乳动物细胞基因表达的调控系统

大量的临床前和临床研究结果已表明基因治疗是理想的疾病治疗手段,然而如何实现治疗基因表达的精确调控仍然是研究人员面临的主要挑战。目前临床前研究常用的基因调控系统多基于控制转录,对反式转录激活因子和专门启动子元件的依赖限制了该系统的临床应用。最近,仅采用RNA元件构建的几种基因表达调控系统得到开发,其作用机制为核酶介导的RNA自我切割、RNA干扰、mRNA翻译启动或终止控制等。该类系统的调控活性由小分子配体反式控制,诱导基因表达的变化幅度可观,反应快速,在哺乳动物体内外均可实现。该系统结构模块化,调控活性可调节,可以克服现有转录调节系统的一些应用局限,对将来基因治疗的临床应用具有重要意义。     

合成生物学开关在代谢工程中的应用

在代谢工程研究领域中合成生物学开关主要用于调控基因的表达。传统的代谢工程改造主要通过敲除和过表达来改变特定基因的表达量。但基因敲除通常会导致菌体生长的下降。因此,我们需要适时的关闭和激活特定基因的表达。合成生物学开关就是解决这一问题的关键工具。目前,在代谢工程中常用的合成生物学开关有光控开关、温度诱导开关、拨动开关和核糖开关。其中,拨动开关和核糖开关在动态调节基因表达上拥有更大优势。介绍了代谢工程中常用的几种合成生物学开关,以及它们在代谢工程的应用。     

等温滴定量热法研究核糖开关aac与氨基糖苷类抗生素的相互作用

核糖开关(riboswitch)是位于m RNA非编码区域的RNA元件,可与小分子配体结合导致结构转变,进而调控下游基因的表达。核糖开关aac能够特异性结合氨基糖苷类抗生素,从而调控氨基糖苷类抗生素抗性基因的表达。目前,核糖开关aac与氨基糖苷类抗生素相互作用的位点和机制尚不清楚。作者利用等温滴定量热法对核糖开关aac与氨基糖苷类抗生素的结合亲和力及结合热力学性质进行了研究,并初步探讨了点突变对相互作用的影响。结果发现,西索米星、庆大霉素、G418、奈替霉素和巴龙霉素能够特异性结合核糖开关aac,而阿米卡星、卡那霉素A、链霉素、链丝菌素、新霉胺、新霉素及核糖霉素与核糖开关aac无特异性相互作用;核糖开关aac与氨基糖苷类抗生素的结合热力学性质表明二者通过氢键和范德华力发生相互作用。西索米星滴定核糖开关aac突变体的结果表明,U68和A18位点很可能与氨基糖苷类抗生素形成氢键,A13和A44位点对于相互作用也有影响。这些结果对进一步研究核糖开关aac与氨基糖苷类抗生素相互作用的位点和机制具有重要的参考价值。     

一种新发现的基因表达调控机制——核糖开关

最近发现 ,某些依赖代谢物调节的基因转录产物的 5′UTR存在特征性结构———核糖开关(riboswitch) .核糖开关可以特异性结合代谢物 ,通过构象变化 ,在转录或翻译水平上调节基因表达 .核糖开关广泛存在于G+ 及G-细菌的代谢相关基因中 ,在真菌、植物中也有发现 .核糖开关调节维生素、氨基酸、核苷酸等基础代谢过程 ,其调节基因表达不需要任何蛋白因子作为中介 ,在进化上可能是RNA世界遗留的分子化石 .核糖开关可用于研究基因功能 ,开发新型药物及基因治疗 .     

针对不同基因靶位的锤头状核酶对HBV的抑制作用研究

前基因组mRNA是HBV(Hepatitis B virus)基因表达和复制的重要中间产物,全长的前基因组mRNA分子具有复杂易变的二级结构,是设计抑制HBV的核酶时所必须考虑的因素.我们使用多个最新的计算机软件对HBV前基因组mRNA二级结构进行模拟、分析,在全面分析核酶的可作用位点的基础上设计三个针对不同基因靶位的锤头状核酶,并对它们在细胞中对HBV的抑制作用进行研究.结果表明在HBV前基因组mRNA上存在几个高度复杂二级结构的区域,可能对核酶完全不敏感,而S、C、X基因的编码区是合适的核酶作用位点,都可达到对HBV的有效抑制,而且X基因位点的核酶对HBV的各种mRNA的抑制作用最为明显,是设计针对HBV核酶时应该优先考虑的位点.     

细菌中黄素单核苷酸核糖开关研究进展

核糖开关(Riboswitch)具有RNA结构,是位于mRNA 5′非编码区的RNA传感器。在无任何蛋白质因子参与下,可特异性地直接结合代谢产物,使自身构象发生相应变化,启动或阻断mRNA的转录、翻译、拼接等过程来调控基因的表达。某些Riboswitch可应用于抗菌药物研发。本文综述了Flavin mononucleotide riboswitch(FMN riboswitch)三维结构、基因表达调控的机制及热力学、动力学的研究进展,为基于FMN riboswitch的合理药物设计奠定了基础,并对开发新一代抗菌药物进行了展望。     

针对不同基因靶位的锤头状核酶对HBV的抑制作用研究

前基因组mRNA是HBV(Hepatitis Bvirus)基因表达和复制的重要中间产物,全长的前基因组mRNA分子具有复杂易变的二级结构,是设计抑制HBV的核酶时所必须考虑的因素。我们使用多个最新的计算机软件对HBV前基因组mRNA二级结构进行模拟、分析,在全面分析核酶的可作用位点的基础上设计三个针对不同基因靶位的锤头状核酶,并对它们在细胞中对HBV的抑制作用进行研究。结果表明在HBV前基因组mRNA上存在几个高度复杂二级结构的区域,可能对核酶完全不敏感,而S、C、X基因的编码区是合适的核酶作用位点,都可达到对HBV的有效抑制,而且X基因位点的核酶对HBV的各种mRNA的抑制作用最为明显,是设计针对HBV核酶时应该优先考虑的位点。