脂肪酶高产菌株选育和菌种库的建立

从山东省济南市植物油厂、肉联厂、乳品厂、菜市场等处的含油土壤中分离筛选到80余株脂肪酶活性较高的产生菌,包括细菌、霉菌、酵母等各种类型,我们对其中的部分菌株进行了形态学及酶学性质的初步研究。一株酶活较高的菌株Y-11经鉴定为丝孢酵母属（Trichosporon）,用紫外线及亚硝酸对其进行了双重诱变、然后用制霉菌素及琥珀酸钠筛选耐药性突变株,使酶活提高155%,并将筛选到的菌株建立一个能够产生各具特色的脂肪酶的菌种库,为今后进一步开展脂肪酶应用研究打下基础。     

耐碱性脂肪酶产生菌的选育及酶学性质的研究

从山东省济南市植物油厂的含油土壤中分离筛选到一株耐碱性脂肪酶产生菌,经初步鉴定为丝孢酵母属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）对该菌株脂肪酶合成受制霉菌素及琥珀酸的影响的情况进行了研究,经诱变筛选抗药性突变株,使酶活力提高了１５５％,还对该突变株的产酶条件及酶学性质进行了研究,并对有关机理进行了讨论。     

用快中子法选育细菌脂肪酶高产菌株

研究了从土壤中筛选产脂肪酶的菌株,利用紫外线,快中子,快中子和磁场复合,γ射线,γ射线和磁场复合诱变,以酶活为筛子进行诱变育种,结果,出发菌酶活较低的一株得到了一株酶活为396．22U/mL的诱变株,此酶活比出发菌株高92倍,并发现比菌对紫外线和快中子比较敏感,而出发菌酶活较高的一株得到了酶活为424．60U/mL发酵液的诱变株,此酶活为出发菌株3．0倍,在此基础上,初步探讨了快中子,γ射线及磁场复合处理在产脂肪酶菌种诱变中的作用,并认为,在产脂肪酶菌株的诱变中快中子诱变更为有效。     

BMMYA' plate -Fast blue RR top agar —— an efficient plate screening method for lipase with high enzyme activity

建立了一种高效筛选高酶活或高产脂肪酶菌株的平板方法.该方法以华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)脂肪酶基因proRCL在毕赤酵母中构建的基因突变文库为筛选对象,利用BMMYA’平板-Fast blue RR顶层琼脂法对其中高酶活或高产的脂肪酶突变株进行筛选,将待筛菌株接种至含有2％甲醇的BMMYA’平板上,30℃生长并诱导4～5d后,平板经脂肪酶致死温度65℃处理1h,冰浴、室温平衡后,向平板中倾入Fast blue RR顶层琼脂.2 min内周围显示出明显的黑褐色的菌株为高酶活或高产突变株.该方法简便,快速,高效而且准确,筛选阳性率可达到90％.     

脂肪酶产生菌Aspergillus niger NJY-1的选育及鉴定

目的：筛选耐高温脂肪酶产生菌株并对其进行18SrDNA鉴定及系统进化树亲缘分析。方法：通过聚乙烯醇橄榄油乳化液方法对所选菌株的粗酶酶学性质进行研究并通过BLAST和MAGE4软件鉴定和聚类分析。结果：从云南省福贡县的榨油作坊土壤中筛选到一株耐高温产酸性脂肪酶的菌株NJY-1,对其粗酶酶学性质进行研究结果表明：该菌株酶促反应的最适作用pH为6.0,pH稳定性为3.0-8.0,最适作用温度为50℃,温度稳定性为35-60℃。该菌株通过18SrDNA鉴定及系统进化树分析,NJY-1与Aspergillus niger具有最紧密的亲缘关系,达到99%。结论：筛选到了1株耐高温脂肪酶产生菌株NJY-1,确定了其粗酶酶学性质和其亲缘关系。     

BMMYA’平板-Fast blue RR顶层琼脂法高效筛选高酶活脂肪酶

建立了一种高效筛选高酶活或高产脂肪酶茵株的平板方法。该方法以华根霉（Rhizopus chinensis CCTCCM201021）脂肪酶基因proRCL在毕赤酵母中构建的基因突变文库为筛选对象,利用BMMYA’平板-Fast blue RR顶层琼脂法对其中高酶活或高产的脂肪酶突变株进行筛选,将待筛茵株接种至含有2％甲醇的BMMYA’平板上,30℃生长并诱导4～5d后,平板经脂肪酶致死温度65℃处理1h,冰浴、室温平衡后,向平板中倾入Fast blue RR顸层琼脂。2min内周围显示出明显的黑褐色的菌株为高酶活或高产突变株。该方法简便,快速,高效而且准确,筛选阳性率可达到90％。     

用快中子法选育细菌脂肪酶高产菌株*

研究了从土壤中筛选产脂肪酶的菌株,利用紫外线、快中子、快中子和磁场复合、γ射线、γ射线和磁场复合诱变,以酶活为筛子进行诱变育种。结果,出发菌酶活较低的一株得到了一株酶活为３９６．２２Ｕ／ｍＬ的诱变株,此酶活比出发菌株高９２倍,并发现此菌对紫外线和快中子比较敏感;而出发菌酶活较高的一株得到了酶活为４２４．６０Ｕ／ｍＬ发酵液的诱变株,此酶活为出发菌株３．０倍。在此基础上,初步探讨了快中子、γ射线及磁场复合处理在产脂肪酸菌种诱变中的作用,并认为,在产脂肪酸菌株的诱变中快中子诱变更为有效。     

牦牛瘤胃中产脂肪酶微生物的分离与鉴定

【背景】脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶,广泛应用于工业化生产中,微生物是工业脂肪酶的主要来源。瘤胃中微生物种类繁多、数量庞大,已有关于瘤胃微生物产纤维素酶的报道,尚无产脂肪酶瘤胃微生物的分离筛选报道。【目的】从牦牛瘤胃中分离筛选出能够产脂肪酶的微生物,并进行菌株鉴定及其酶学性质的研究。【方法】以橄榄油为唯一碳源,通过中性红油脂平板进行初步筛选后,用改进铜皂-分光光度法测定酶活力进行复筛;再经形态学观察、生理生化实验和16S rRNA基因序列分析进行菌种鉴定;研究3种脂肪酶的最适作用温度、pH值及金属离子、有机溶剂和表面活性剂对酶活力的影响。【结果】筛选出6株酶活力较高的菌株,其中3株为液化沙雷氏菌,2株为白地霉,1株为卷枝毛霉。脂肪酶的酶学性质研究表明:液化沙雷氏菌、白地霉和卷枝毛霉所产脂肪酶的最适作用温度为45、35和40°C;最适pH为8.0、7.0和7.0;Ca2+和Mg2+对3种脂肪酶均有激活作用;Zn2+对3种脂肪酶有不同程度的抑制作用,EDTA、SDS可使3种脂肪酶失活;3种脂肪酶对丙三醇的耐受力较高,卷枝毛霉脂肪酶对甲醇、乙醇、丙酮的耐受力较高。【结论】从牦牛瘤胃中分离出3种产脂肪酶的微生物,且证实瘤胃微生物在脂肪酶研究方面具有较高的价值。     

高产耐高温脂肪酶生产菌的筛选与鉴定

从小笼包蒸屉垫中筛选得到了两株脂肪酶高产菌株J2和J3,经形态观察以及26S rRNA基因(26S rDNA)序列比对鉴定,两株菌分别属于Aureobasidium属的两个变体。200 r/min、30℃下摇瓶发酵3-5 d后,以对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)作为底物,用分光光度法测得J2和J3发酵上清液中的脂肪酶酶活分别为10.61 U/m L和14.43 U/m L。对两株菌所产脂肪酶的耐热特性研究显示,菌株J2产脂肪酶的最适反应温度为50℃,并且酶液在50℃保温5 h无酶活损失;另一株菌J3所产脂肪酶的最适反应温度为60℃,酶液在50℃保温5 h后酶活剩余42.19%,在40℃保温5 h没有酶活损失。这表明J2和J3菌株所产脂肪酶具有较好的热稳定性和较高的最适反应温度。     

脂肪酶产生菌分离,鉴定及酶性质的研究

从含油污泥中分离筛选出１７株产脂肪酶菌株,对其中一株进行鉴定,为无花果丝孢酵母（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｆｉｇｕｅｒｉａｅ）．研究了该菌的最适产酶条件,并对其部分酶性质进行了研究．     

原生质体紫外诱变选育白地霉GXU08脂肪酶高产菌株

目的:初步筛选脂肪酶高产菌株。方法:以白地霉GXU08为出发菌,对其进行原生质体紫外诱变选育。结果:筛选得到6株脂肪酶活力比出发菌株GXU08高的突变株,其中菌株4-39的酶活达14.2U,比GXU08提高了63.2%。突变株经9次传代,3次摇瓶复筛,其脂肪酶酶活性保持稳定,为今后进一步研究不同的育种方法进一步提高脂肪酶的产量打下基础。     

紫外诱变选育脂肪酶高产菌株及其酶学性质的研究

目的:初步筛选脂肪酶高产菌株.方法:以 1444 粗壮假丝酵母作为出发菌株,对其进行紫外线诱变育种.结果:经紫外诱变的重复处理、摇瓶复筛和遗传稳定性实验,最终得出两株高产酶突变株 Z6 及 Z8,其酶活分别为22.6、25U/ml,酶活力较出发菌株分别提高了 120%和 150%.酶学性质研究表明:Z6、Z8的最适反应温度分别为45、50℃,最适 pH 都为8,在 pH 6～9较稳定.Z6、Z8的热稳定都较好,在50℃下保温 60min 酶基本不失活.结论:经紫外诱变获得的突变株 Z6 及 Z8 有进一步的研究价值.     

产脂肪酶深海细菌的筛选鉴定及酶学性质研究

从分离自南大西洋深海沉积物的细菌中筛选出一株产脂肪酶菌株FE10,通过16S rRNA序列分析,对FE10进行分子鉴定和系统发育分析,初步确定其为海杆菌属（Marinobacter）。对菌株FE10所产脂肪酶进行酶学性质初步研究表明：在实验温度条件下所产脂肪酶40℃、pH 7时酶活最高,pH 9时酶活几乎消失。     

产脂肪酶嗜碱细菌的筛选及酶学性质研究

目的:筛选产脂肪酶嗜碱细菌,并研究其酶学性质.方法:以豆油为唯一碳源的固体平板筛选产酶菌株,16S rDNA同源性分析确定微生物菌属,单因素实验优化产酶条件、研究酶学性质.结果:筛选出1株产脂肪酶的嗜碱菌株,鉴定为假单胞菌(Pseudomonas),命名为Pseudomonas sp.C-36.菌株产酶的最佳培养条件为:甘油2%(V/V).蛋白胨0.7%(W/V),酵母提取物0.5%(W/V),K2HPO4 0.2%(W/V),MsS04·7H2O 0.05%(W/V),NaCl 0.3%(W/V),Triton X-100 0.01%(W/V),pH 9.5,转速180r/min,37℃下培养24h,产酶量为2.782 IU/ml.该酶的最适温度和pH分别为40℃和9.0,50℃时酶活半衰期为2h.Ca2+等金属离子对该酶酶活具有促进作用,而Zn2+对酶活的抑制作用明显.有机溶剂的耐受性实验表明,该酶在疏水性有机溶剂中稳定性良好.结论:筛选得到1株嗜碱的脂肪酶产生菌C-36,并鉴定为Pseudomonas.     

产脂肪酶木霉菌株的筛选鉴定及酶学性质研究

筛选到4株可产生脂肪酶的真菌菌株,分别是153—1、13—2、30425和西1-1,经形态观察、ITS序列测方法鉴定,30425、153—1鉴定为Trichoderma harzianum,西1-1、13—2鉴定T.longibrachiatum。研究了脂肪酶的基本酶学性质,153—1、13-2、30425和西1-1酶的最适作用温度为45℃、40℃、20℃、20℃,最适pH为9．5、10．0、7.5、9．5,金属离子对153—1、13—2、30425和西1-1酶活的影响存在差异,其中Mn^2＋、Cu^2、Pb^2＋对4株菌株的酶活均为抑制作用,而Ba^2＋对4株菌株的酶活均为不同程度的激活作用。     

基于基因的重新设计与高通量筛选策略选育解脂耶氏酵母脂肪酶高产菌株

脂肪酶（EC 3.1.1.3）是应用广泛的工业用酶。高效的脂肪酶产生菌是脂肪酶工业生产和应用的前提。通过基因的重新设计与合成技术优化了解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）脂肪酶YLL的密码子,并实现了其在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的高效表达;通过高通量筛选策略获得了更高效的脂肪酶基因工程菌菌株SILVER。在14 L发酵罐条件下,菌株SILVER酶活达40 500 U/ml、蛋白质含量达2.52 g/L发酵液,为该类脂肪酶的产业化奠定了基础。     

利用麻风树油驯化筛选高活性脂肪酶产生菌及其催化酯化反应

以1株分解麻风树油的脂肪酶产生菌Pseudomonas sp. LP-1为出发菌株, 通过麻疯树油定向驯化筛选获得1株酶活较高且产酶稳定的菌株P. sp. X-2-45, 其水解酶活为29.79 U/mL, 比原始菌株提高了288%。对P. sp. X-2-45生长与产酶特征、对植物油脂水解能力及在有机相中催化脂肪酸和有机醇间的酯化反应研究发现, 该菌株生长速率和产酶速率明显加快, 培养30 h时生物量和酶活达到最大, 稳定期延长, 培养过程中脂肪酶在培养基中的稳定性提高。以麻疯树油诱导合成的P. sp. X-2-45脂肪酶对麻疯树油的水解能力比原始菌株提高了378%, 说明采用麻风树油定向驯化可提高脂肪酶对相应底物的水解能力。X-2-45脂肪酶可以催化月桂酸与正丁醇、正辛醇、月桂醇和丙三醇之间, 棕榈酸、硬脂酸与甲醇、正辛醇、月桂醇和丙三醇之间, 油酸与甲醇、正丁醇、正辛醇、月桂醇和丙三醇之间发生酯化反应。     

产低温脂肪酶菌株Geotrichum candidum ch-3的选育、发酵条件及酶学性质研究

从新疆昌吉市油脂化工厂的含油冻土中筛选到一株产低温脂肪酶的菌株ch-3,形态鉴定及18SrDNA序列分析表明该菌株为白地霉,命名为Geotrichum candidum ch-3。我们对其生长及产酶情况和酶性质做了初步研究。该菌株的最适生长温度是20℃。玉米浆、豆油可显著促进脂肪酶的产生。粗酶液经双水相萃取和Sephadex G-75凝胶过滤分离纯化后进行酶学性质的研究。该脂肪酶最适作用温度为35℃,在0℃可保持66%的相对酶活性,最适pH值为7.0,对热较敏感,50℃处理20min,剩余酶活为55%,Fe2＋、Cu2＋、Mn2＋以及Ca2＋对酶有较强的激活作用。     

诱变选育脂肪酶高产菌株及其脂肪酶固定化

以紫外和微波复合诱变选育脂肪酶产生菌 Rhizopus sp. RXF12,获得高产突变株RZ13,其脂肪酶摇瓶发酵单位是出发株的2.62倍。菌株经多次传代,遗传性状稳定。对RZ13菌株的发酵条件进行了正交优化,在25 ℃、pH 8.0的条件下,接入5 %(v/v)的RZ13菌株单孢子悬液 (107个/ml) 振荡培养84 h,达到RZ13菌株最佳产酶状态,脂肪酶活可达95.08 U/ml。考察了脂肪酶性质,在低于40 ℃,pH 7.0~9.0范围内脂肪酶活稳定。经载体筛选及固定化过程优化,选用镁铝水滑石25℃吸附4 h,对RZ13脂肪酶进行了固定化。结果表明,固定化酶的最适作用温度为35~55℃,pH为7.5~9.0,较游离酶的均有较大扩展。     

蛋白酶产生菌的筛选和紫外诱变育种

目的:筛选水产品加工用蛋白酶产生菌,为酶的的分子改造和水产品加工提供材料基础.方法:通过在富含水产品蛋白的场所的针对性采样,菌落平板筛选结合发酵上清液平板验证以及Folin-酚试剂定量检测确认筛选结果,并通过紫外诱变提高产中性蛋白酶菌株的产酶能力.结果:从12份土样中分离187株具有明显蛋白酶活性的单菌落.在挑取的11株透明圈明显的蛋白酶产生菌中,菌株W9在所有菌株中可以稳定产生较高的蛋白酶酶活力,约为1 594U/ml.通过对其进行紫外诱变后,在突变株中筛选得到一株酶活约为1 845U/ml的 W9UV突变株,比野生菌株酶活提高了15.6%.结论:突变菌株W9UV可稳定产生较高的蛋白酶酶活力,发酵性能优良.