大肠杆菌二氢硫辛酸转乙酰基酶的外周结合结构域的溶液构象

丙酮酸脱氢酶复合体催化丙酮酸氧化脱羧,生成乙酰辅酶 A.该复合体由丙酮酸脱羧酶(E1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(E2)和二氢硫辛酸脱氢酶(E3)三种酶组成.大肠杆菌E2的外周亚基结合结构域(peripheral subunit-binding domain, PSBD)结合E1和E3,对丙酮酸脱氢酶复合物的结构和功能有重要作用.本研究采用PCR技术扩增了E2的PSBD的48个氨基酸残基区域编码序列（cDNA）,构建pET-32a-pp-Psbd表达载体,测序正确后转入BL21（DE3）中表达,目的蛋白质用镍柱和HiTrap SP柱纯化后达到电泳纯,质谱鉴定纯化后蛋白质分子量与理论值符合.pull-down结果表明,PSBD可分别与E1和E3结合.圆二色谱表征PSBD的二级结构主要为a-螺旋,当在0.5 mol/L NaCl的离子强度下,55.7% 的PSBD分子折叠为正确的构象.动态光散射实验发现,PSBD分子有3种不同的构象存在形式,因此,PSBD非常容易从折叠态转化为不和E1、E3结合的无规卷曲态,这种构象的相互转化为其功能性与E1、E3结合及解离提供了结构基础.     

丙酮酸脱氢酶活性缺失与疾病发生的研究进展

丙酮酸脱氢酶系(pyruvate dehydrogenase complex,PDH_C)主要由丙酮酸脱氢酶(E1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(E2)、二氢硫辛酸脱氢酶(E3)和E3结合蛋白(E3BP)组成,绝大多数的丙酮酸脱氢酶系缺失都是由丙酮酸脱氢酶E1α亚基突变或者磷酸化引起,仅有少数突变发生在E2、E3和E3BP上。本文就PDHC的结构与功能,PDHA1基因突变和E1α磷酸化与其功能的关系,及在相关疾病包括肿瘤的发生、发展和转移中的分子机制的研究进展做一总结,以期对因E1α功能丧失引起的疾病的诊断与治疗有所借鉴意义。     

丙酮酸脱氢酶多酶复合体研究进展

2 氧 (代 )酸脱氢酶复合体 (ＯＡＤＨｃ)是众多多酶复合体中的一个典型代表 ,该复合体家族包括 3种多酶复合体———丙酮酸脱氢酶多酶复合体 (ＰＤＨｃ)、支链 2 氧 (代 )酸脱氢酶多酶复合体和 2 酮戊二酸脱氢酶多酶复合体。其中ＰＤＨｃ催化糖代谢中丙酮酸的不可逆地氧化脱羧产生乙酰ＣｏＡ。1 .丙酮酸脱氢酶多酶复合体的组成ＰＤＨｃ广泛地分布于微生物、植物和哺乳动物中。在真核生物中 ,组成ＰＤＨｃ的所有蛋白质都是由核基因编码 ,且它们主要都位于线粒体上 (在一些生物的质体中也发现了它们的同工酶 )。ＰＤＨｃ的核心结构是由 3个…     

磷酸丙糖异构酶的折叠及稳定性研究

从鸡胸肌中纯化出磷酸丙糖异构酶(triosephosphateisomerase,TIM),通过蛋白质内源荧光,圆二色性,紫外吸收二阶导数光谱等多种研究溶液构象的方法,对TIM被盐酸胍和热变性过程进行了详细的研究.结果表明,用不同测量方法得到TIM的变性过程均高度协同,没有观察到折叠中间态,应用单分子二态去折叠模型计算了TIM去折叠的热力学参数.通过圆二色光谱在222nm处的变化监测的TIM热变性过程也是高度协同的二态过程,天然态TIM的表观Tm为64.6℃.在低浓度盐酸胍存在下,TIM的热稳定性降低.讨论了二体蛋白质的可能去折叠机制,证明在使用的实验条件下磷酸丙糖异构酶去折叠过程中二级结构与三级结构的变化是同时发生的,其去折叠遵循观察不到二体解离的表观二态过程.     

蛋白质隐态构象

生物活性蛋白质的结构具有动态特性,存在构象系综,包含常规结构生物学可测定的稳态和常规结构生物学无法测定的隐态构象.隐态构象与稳态构象之间存在着多态平衡,在蛋白质生物学功能上具有重要作用.蛋白质隐态定义起源于蛋白质折叠机制及蛋白质分子动态学研究.在蛋白质构象系综中,蛋白质隐态的含量较少、寿命短及较稳态构象能量高等性质使得...     

丙酮酸脱氢酶活性调控在线粒体代谢与生长平衡中的作用

丙酮酸脱氢酶多酶复合体(PDC)催化丙酮酸生成乙酰辅酶 A(acetyl-CoA)的反应是线粒体代谢与生长的调控枢纽.丙酮酸脱氢酶激酶 (PDK)/丙酮酸脱氢酶磷酸酶(PDP)对丙酮酸脱氢酶(PDH)的磷酸化 /脱磷酸化作用以及丙酮酸/乙酰辅酶A对PDH底物产物水平的调控是线粒体适应不同生理环境的代谢调节方式,而调控 PDK基因转录的上游信号恰好也是线粒体生长或生物发生的调控机制.过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR)/过氧化物酶体增殖物激活受体g共激活因子-1(PGC-1) 信号通路可能是线粒体代谢与生长在基因转录水平的共同调控通路.线粒体代谢与生长经共同通路调节可维持线粒体功能与结构之间的平衡.     

从量子跃迁观点对蛋白质折叠速率的统计分析

理解蛋白质折叠速率是探明蛋白质结构和折叠机制物理基础的关键.蛋白质折叠速率的温度依赖关系是当前一个未解决的难题.假定蛋白质折叠是一个分子构象间的量子跃迁,导出了一个蛋白质折叠速率的解析公式.由此公式出发,计算了资料库中二态蛋白质的折叠速率和研究了它们的温度依赖性.从第一性原理出发,对实验给出的16个二态蛋白质折叠速率的非阿列尼乌斯(non-Arrhenius)温度关系给予成功解释,进而预测了这些蛋白质解折叠速率的温度依赖关系.依据量子折叠理论,给出了一个预测二态蛋白质折叠速率的统计公式,用于65个蛋白的资料库,理论和实验比较的相关系数为0.73.此外,理论还给出了与实验结果一致的最大和最小折叠速率估计.     

动力学接触序: 基于量子跃迁的蛋白质折叠速率参数

把蛋白质折叠看成多肽链上扭转态间的量子跃迁, 依据构象动力学的量子理论, 提出用接触残基间多肽链转动惯量和扭转势能来表征接触特性的动力学接触序, 从而能定量地从动力学角度研究蛋白质折叠速率. 在80个蛋白的数据集上实验, 证实了构象量子跃迁观点的合理性并得到以下结论: (1) 折叠速率与接触转动惯量之间存在显著相关性; (2) 多态蛋白的折叠可以看成在同样转动惯量、温度等条件下的二态蛋白折叠基础上的中间态延迟, 并估计了延迟时间的数量级; (3) 折叠可以分为释能和吸能两类, 蛋白质折叠速率上限由释能折叠决定, 并导出大多数折叠速率大的二态蛋白的量子跃迁过程为释能反应, 而折叠速率小的多态蛋白为吸能反应.     

保守GTP酶ObgE的分子伴侣活性研究

分子伴侣(molecular chaperone)能够帮助新生多肽链或错误折叠的蛋白质形成天然构象,但本身又不是成熟蛋白质的组成成分。蛋白质需要分子伴侣的帮助,才能够从核糖体合成的新生肽链折叠成有生物活性的大分子。E.coli的ObgE蛋白是保守的GTP酶,ObgE蛋白参与信号转导、蛋白运输和细胞周期调控,并与E.coli在氨基酸饥饿下的应激反应有关。本实验通过分子克隆,将E.coli ObgE蛋白的基因克隆到表达载体pET-28a中,转化到E.coli BL21进行蛋白表达纯化。纯化后的ObgE蛋白通过柠檬酸合成酶变复性实验、α-葡萄糖苷酶变复性实验、牛碳酸酐酶变复性实验,检测ObgE蛋白的分子伴侣活性,发现ObgE具有一定的分子伴侣活性,为该蛋白的研究应用奠定了基础。     

分子伴侣的多重功能

分子伴侣(molecular chaperone)在原核生物和真核生物的细胞中广泛存在.分子伴侣可稳定未折叠或部分折叠的多肽,并防止不适当的多肽链内或链间相互作用;有些分子伴侣也可与天然构象的蛋白质相互作用以促使寡聚态蛋白质发生结构重排.基于分子伴侣能识别并调节细胞内多肽的折叠,因此它们还具有介导线粒体蛋白跨膜转运,调控信息传导通路和转录、复制,以及参与微管形成与修复等功能.     

GroEL的耗能分子伴侣机制

双环结构Gro EL及其辅分子伴侣Gro ES是目前研究得最深入的分子伴侣.然而,Gro EL/Gro ES帮助蛋白质折叠的一些关键理化机制,尤其是水解ATP,Gro EL发生构象改变,能否主动调节蛋白质错误折叠中间体的构象,以促进错误折叠中间体的复性,仍然存在争议.结合本研究组近年的工作,作者着力介绍Gro EL促进蛋白质折叠的主动解折叠机制.     

蛋白质构象病

蛋白质结构生物学既从蛋白质一级结构序列 ,也从蛋白质空间结构及其动态变化去研究蛋白质的性质和功能。生物医学研究表明蛋白质空间构象发生异常变化会引起疾病发生 ,形成了蛋白质构象病 (Ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｆｏｒｍａ ｔｉｏｎａｌｄｉｓｅａｓｅｓ)这一新的病理学概念[1] 。1 .蛋白质构象病及其分子构象病理学一般讲 ,引起构象疾病的蛋白质分子与正常蛋白质同时存在于机体内 ,至少部分蛋白质具有正常折叠的空间构象 ,并以正常形态释放。当蛋白质构象异常变化时可导致其生物功能丧失 ,或者引起其后发生的蛋白质聚集与沉积 ,使组织结构…     

应用单克隆抗体鉴定人类肝脏线粒体蛋白质组中的抗原优势蛋白

对线粒体蛋白质组的鉴定和分析有助于理解线粒体的功能和相关疾病的发病机制, 包括能量代谢、凋亡、自由基产生、产热作用、钙离子信号通路等. 本实验旨在鉴定人类肝脏线粒体蛋白质组中的抗原优势蛋白. 用线粒体蛋白质作为免疫原, 经过细胞融合、筛选和克隆, 制备了240多个单克隆抗体杂交瘤细胞系. 单克隆抗体识别的线粒体蛋白抗原通过人类肝脏cDNA表达文库筛选方法鉴定, 相应的线粒体蛋白质的亚细胞定位通过免疫组化证实. 发现了肝脏线粒体中6个抗原优势蛋白, 分别被至少两种特异性的单克隆抗体所识别. 这6个蛋白分别是乙酰辅酶A酰基转移酶(线粒体3-酮酯酰辅酶A硫解酶)2、醛脱氢酶1家族A1、氨甲酰磷酸合成酶1、二氢硫辛酰胺S乙酰转移酶(丙酮酸脱氢酶复合物的E2组分)、烯酰辅酶A水合酶1和羟基类固醇(11β)脱氢酶1. 这些单克隆抗体有望应用于人类肝脏蛋白质组计划的相关研究, 如去除优势蛋白、蛋白与蛋白之间相互作用的研究和验证等.     

基于氢氘交换核磁共振技术研究蛋白质与阳离子交换介质的相互作用

原位实时捕捉多孔介质内的蛋白结构变化信息是蛋白质层析失活机理研究中的难点。为此,本文发展了蛋白质氢氘交换与核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)相结合的新型蛋白质液固界面表征路线。研究了溶菌酶在溶液态以及在阳离子交换介质内部吸附态时的去折叠行为,并揭示了蛋白与阳离子交换介质(SP Sepharose FF)相互作用机理。溶液态溶菌酶的一维核磁共振氢谱动力学显示蛋白质去折叠可导致残基暴露进而加快氢氘交换速率。吸附态溶菌酶的二维氢-氢全相关谱图(Total correlation spectroscopy,TOCSY)以及残基峰强度显示,溶菌酶在吸附态时的去折叠呈区域性,无规则卷曲(Coil,bend,and turn)片段的酰胺氢信号更容易失去,而二级结构域(α-helix,β-sheet)对酰胺氢信号保护更好。最终,利用蛋白表面静电势模拟计算结合氢氘标记的蛋白核核磁数据可确定出溶菌酶与阳离子交换介质的作用位点。这对于深刻理解层析过程中蛋白与层析介质微观作用机理以及层析过程中吸附剂的选择、设计具有重要意义,也为获取蛋白质与生物材料之间相互作用研究提供新的有效工具。     

红莲型水稻细胞质雄性不育花药蛋白质组学初步分析

采用固相pH梯度－SDS PAGE 双向电泳对红莲型细胞质雄性不育水稻(YTA)的不育系和保持系(YTB)单核期花粉总蛋白质进行了分离,通过银染显色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱。Image Master 2D V5.0 软件可识别约1800个蛋白质点,其中差异表达的蛋白质点数为85。将其中16个差异点采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ionizaton time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）进行了肽质指纹图分析,通过采用Mascot 软件对MSDB数据库查询,其中9个蛋白质点得到了鉴定。YTA相对于YTB有部分参与碳代谢和淀粉合成的酶缺失或表达量降低,这些蛋白质分别是ADP-葡萄糖磷酸转移酶（AGPase）,UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶,乙酰辅酶A合成酶和二氢硫辛酸脱氢酶等。其中AGPase是参与淀粉合成的蛋白,与花粉发育密切相关。乙酰辅酶A合成酶和二氢硫辛酸脱氢酶是细胞内合成乙酰辅酶A的重要酶,而乙酰辅酶A是进入TCA循环的重要底物,乙酰辅酶A的缺乏可以导致TCA循环不能顺利进行,从而不能提供小孢子发育所需要的大量能量。YTA相对于YTB部分参与碳水化合物代谢的重要酶缺失或表达量降低,有可能导致因线粒体提供的能量不足,淀粉合成受阻,因而花粉不能正常发育。      

人热休克蛋白转录因子1 DNA结合结构域的表达、纯化和晶体生长

目的:获得大量热休克转录因子1(HSF1)DNA结合结构域(DBD)蛋白,用于晶体生长的三维结构解析。方法:将DBD基因片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中并获得高效表达,经过Glutathione SepharoseTM 4B亲和层析、ResourceQ纯化后,蛋白纯度达到95%以上。结果:圆二色谱仪分析蛋白质的二级结构结果显示α螺旋占33%,β折叠占15%;采用悬滴气相扩散法得到了针状DBD晶体。结论:纯化的蛋白质与同源性达68%的Kluyveromyceslactis的DBD有相似的空间构象。获得的蛋白质晶体为进一步的三维结构解析奠定了基础。     

二氢硫辛酰转乙酰基酶通过乙酰化磷酸葡糖酸脱氢酶促进核酸合成

丙酮酸脱氢酶复合物(pyruvate dehydrogenase complex,PDC)是位于线粒体内的多酶复合物,催化丙酮酸不可逆地氧化脱羧转为乙酰辅酶A,二氢硫辛酰转乙酰基酶(dihydrolipoyl acetyltransferase,DLAT)是PDC的1个亚基.PDC在细胞线粒体呼吸中发挥关键作用.但是D...     

人二氢乳清酸脱氢酶蛋白的表达、纯化及其与新型抑制剂的晶体结构

人二氢乳清酸脱氢酶（human dihydroorotate dehydrogenase, hDHODH）是催化嘧啶从头合成途径的一个关键酶。近年来,多种研究表明,抑制该酶可缓解类风湿性关节炎的症状。但该酶的抑制剂甚少,寻找该酶的高效抑制剂具有重要意义。本研究利用PCR技术扩增hDHODH基因,构建重组质粒pET-19b-hDHODH,并在大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli ) BL21(DE3)中表达,获得可溶性蛋白质。用Ni2+-NTA亲和层析柱对蛋白质进行纯化,获得较高（90%）纯度的hDHODH蛋白,将蛋白质与抑制剂3-(5-乙硫基)-1H-1, 2, 4-三氮唑-3-)苯甲酸和底物DHO混合孵育。用Hampton试剂盒初筛晶体并用棋盘法进行优化,获得晶形完美、衍射能力很强的hDHODH蛋白复合物单晶。用X射线衍射晶体,用CCP4、Coot软件解析结构,获得hDHODH蛋白复合物晶体结构。从解析的结构中可以看出,抑制剂与蛋白质的吻合度非常高,且抑制剂通过亲水的羧基端与蛋白质356位和147位的酪氨酸形成氢键网络。抑制剂的5元环与蛋白质359位的亮氨酸和360位的苏氨酸相互作用,使抑制剂与蛋白质牢固结合。该复合物晶体结构的顺利解析,将为开发新型特异性抗类风湿性关节炎药物提供重要基础。     

高等生物丙酮酸脱氢酶复合体活性调节机制

丙酮酸脱氢酶复合体催化丙酮酸的氧化脱羧,在糖代谢中扮演了一个非常关键的角色.该酶是一个具有严密结构的多酶复合体,其活性被一套由磷酸化/去磷酸化的翻译后修饰以及转录水平上的信号调节所组成的复杂机制所精确地调控:E1三个磷酸化位点存在位点特异性,而且在这些位点上四个PDK同工酶表现出的明显差异又为这种调节机制引入了同工酶特异性.     

双孢蘑菇子实体发育后期差异表达蛋白质分析

为探讨双孢蘑菇子实体发育后期的蛋白质表达变化,对双孢蘑菇As2796子实体采收期、成熟期和开伞期的蛋白质组进行了双向电泳(2-DE)分析,发现了16个表达差异明显的蛋白质。通过质谱分析(MALDI-TOF/TOF MS)和数据库检索,有14个差异蛋白质获得鉴定。其中磷酸烯醇式丙酮酸水合酶与能量代谢相关,T-蛋白复合体1、蛋白酶体、5-甲基四氢三谷氨酸-同型半胱氨酸甲基转移酶、1-吡咯琳-5-羧酸脱氢酶、精氨酸酶与氨基酸或蛋白质代谢直接相关,而GTP结合蛋白则参与细胞的多种生命活动,在细胞的生长发育过程中起着重要的作用。另外7个为功能未知的蛋白质。