真核细胞中多重表达框mRNA的选择性翻译起始

扫描模型和遗漏扫描模型是真核生物mRNA翻译起始的两种主要机制,但其仍存在某些例外情况,如对具有多顺反子结构的mRNA,选择性翻译起始的发生机制目前仍不清楚.本研究基于GFP蛋白开放表达框(ORF)构建了一系列重组表达载体,用以转录在移码翻译顺序及同一翻译顺序下,AUG起始密码子处于不同序列背景,以及间隔不同距离的多顺反子结构mRNA.通过转染人Bel 7402细胞系,研究了这些多顺反子结构mRNA的翻译起始模式.结果表明,在移码翻译顺序下,多顺反子mRNA可翻译出对应的不同蛋白质,而在同一翻译顺序下,GFP蛋白表达框中的多个AUG密码子,仅有首位起始密码子可发挥作用,提示核糖体在从首位起始密码子开始翻译的同时,可能会有部分核糖体继续向下扫描并识别下游的起始密码子,而这种选择性的翻译起始效率,主要取决于密码子所处的序列背景及间隔距离等因素.     

茶尺蠖小RNA病毒5′端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique 小RNA病毒(EoPV)中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端.克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征:A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多.利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点(IRES)的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域.据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制.     

茶尺蠖小RNA病毒5'端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique小RNA病毒（EoPV）中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端。克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征：A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多。利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点（IRES）的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域。据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制。     

5'UTR中AUG的分布及其对翻译起始的影响

以细菌和古菌基因组5’UTR序列作为研究对象,分析在5’UTR的3个不同阅读框架中三联体AUG的分布,发现无论是细菌还是古菌基因组都在阅读框1中有非常明显的AUG缺失（depletion）。AUG的缺失表明在起始密码子上游的AUG很可能会对基因的翻译起始产生影响。分析得知：绝大部分的AUG都是以uORF（upstream open readingframe）的形式出现的,uAUG（upstreamAUG）的数量很少,特别是在阅读框1中,而且在细菌基因组的阅读框1中uAUG较多地出现在了含有SD序列的基因上游。比较发现,uAUG引导的序列在同义密码子使用上的偏好性较真正的编码序列差,这可能表明细菌和古菌在同义密码子使用上的偏好性也是决定基因准确地翻译起始的重要因素之一。     

5’UTR中AUG的分布及其对翻译起始的影响

以细菌和古菌基因组5′ UTR序列作为研究对象,分析在5′ UTR 的3个不同阅读框架中三联体AUG的分布,发现无论是细菌还是古菌基因组都在阅读框1中有非常明显的AUG缺失(depletion)。AUG的缺失表明在起始密码子上游的AUG很可能会对基因的翻译起始产生影响。分析得知：绝大部分的AUG都是以uORF(upstream open reading frame)的形式出现的,uAUG(upstream AUG)的数量很少,特别是在阅读框1中,而且在细菌基因组的阅读框1中uAUG较多地出现在了含有SD序列的基因上游。比较发现,uAUG引导的序列在同义密码子使用上的偏好性较真正的编码序列差,这可能表明细菌和古菌在同义密码子使用上的偏好性也是决定基因准确地翻译起始的重要因素之一。     

靠近5′端帽子的上游AUG不影响t-PA mRNA的翻译

大多数真核生物mRNA的翻译起始都符合Kozak提出的扫描学说,即40s小亚基携带相应的起始因子进入mRNA的5′末端,沿mRNA线性滑动,至第一个AUG起始密码处与60s大亚基结合,形成第一个肽键,然后进入肽链延伸阶段。本课题组所构建的重组质粒pMM 5065含人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)cDNA。序列分析证明,该质粒中t-PA起始密码子ATG的5′端序列为:AAGCTTGCATGCCTGCAGGTC ATG GAT……,可见转录后t-PA mRNA起妈密码子AUG的5′端还有一个AUG三联体(即上游AUG),形成一个较长的与t-PA框架不同的阅读框     

大肠杆菌双顺反子表达载体中绿色荧光蛋白表达水平的研究

构建了一系列含有编码硫氧还蛋白(Trx)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的双顺反子重组表达质粒,重点考察双顺反子间紧密相连和重迭的间隔序列.诱导表达后,对表达的GFP进行荧光检测,利用GFP的荧光强度来反映蛋白质的表达水平.结果表明各表达载体所表达的GFP的平均荧光强度差距很大,表明双顺反子间的间隔序列对报告基因表达水平有一定的影响,为实现不同功能基因表达的精确调控奠定了基础.     

基于mRNA 5'端TIR区二级结构优化提高重组sTNFαRI在大肠杆菌中的表达水平

目的:通过优化PET11b-s TNFαRI 5'mRNA翻译起始区(TIR)二级结构从而提高可溶性肿瘤坏死因子I型受体(sTNFαRI)在大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)]中的表达水平。方法:通过对PET11b-s TNFαRI mRNA 5'端TIR区二级结构的自由能及核苷酸位置熵分析,设计相应的引物对mRNA 5'翻译起始区(TIR)相应密码子进行突变,从而使核糖体结合位点(RBS)及起始密码子(AUG)暴露于发夹结构之外,此外将p ET11b核糖体结合位点由GAAGGAGA突变为GAAGAA,以利于翻译复合体的组装以及翻译起始。通过基因克隆的方法将5'端TIR区优化后的序列与s TNFαRI序列一起克隆到p ET11b载体中,并转化大肠杆菌BL21(DE3),阳性转化子经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测。结果:通过对PET11b-s TNFαRI 5'TIR mRNA二级结构优化,经SDS-PAGE和Western blot分析表明重组s TNFαRI的表达水平较优化前提高50%~60%。结论:通过对重组载体翻译起始区(TIR)mRNA序列的二级结构优化可以有效提高目的蛋白的表达水平,对进一步工业化生产具有重要的应用价值。     

珊瑚藻R-藻红蛋白rpeA和rpeB基因全长cDNA克隆与序列分析(英文)

依据珊瑚藻 (CorallinaofficinalisL .)藻红蛋白rpeA和rpeB的DNA序列 (AF5 1 0 986 )设计引物 ,通过PCR RACE方法扩增得到rpeA和rpeB的cDNA序列 .序列分析表明 ,该序列采用多顺反子转录策略 ,全长 2 2 5 7bp(AF5 42 5 5 4) ,排布顺序为 5′UTR rpeB 间隔区 rpeA 3′UTR .5′非编码区 4 93bp ,rpeB基因 5 34bp ,基因间隔区 1 0 1bp ,rpeA基因 4 95bp ,3′非编码区 6 34bp .在rpeA和rpeB的基因起始密码子上游均存在类似原核核糖体结合的Shine Dalgarno (SD)序列 .在rpeA基因终止密码子下游 1 1 0bp处还存在着一个可能的开放阅读框架 .经检索GenBank发现 ,真核红藻藻红蛋白中尚无有关cDNA序列的报道     

m RNA5′端不同位置的二级结构对原核生物翻译起始的影响

 一个 2 1 bp的序列插入 B50中的人 PCNA- Lac Z′融合蛋白 m RNA的 SD序列的上游 1 1 bpH ind 切点处 ,构成正、反向插入的两个重组质粒 B50 il、B50 i2 .通过计算机程序对 m RNA二级结构的模拟分析 ,B50 il的插入序列在翻译起始区 (TIR)前形成一个发夹结构 ,但不影响 TIR的二级结构 ;B50 i2的插入序列在 TIR 5′端形成一个二级结构 ;而另一克隆 D1 3与 B50因 SD前后的 6个和 7个碱基序列的不同 ;使翻译起始区 TIR的 SD到 AUG附近的二级结构不相同 .实验测定的四者的β-半乳糖苷酶活性与计算机计算的解开 m RNA TIR的二级结构所需能量ΔE进行比较 ,其结果说明 m RNA TIR前面的二级结构对翻译起始无影响 ,而位于 TIR的 5′端的二级结构对翻译起始效率是有影响的 .不过 ,它与 m RNA TIR的 SD到 AUG的附近的二级结构对翻译起始效率的影响相比 ,TIR5′端二级结构的影响比较小 .同时 ,PCNA- Lac Z和 PCNA- Lac Z′两种融合蛋白的β-半乳糖苷酶活性也进行了比较 ,酶活性有差别 ,但不同质粒酶活性的比值仍相同 .     

m RNA5′端不同位置的二级结构对原核生物翻译起始的影响

一个 2 1 bp的序列插入 B50中的人 PCNA- Lac Z′融合蛋白 m RNA的 SD序列的上游 1 1 bpH ind 切点处 ,构成正、反向插入的两个重组质粒 B50 il、B50 i2 .通过计算机程序对 m RNA二级结构的模拟分析 ,B50 il的插入序列在翻译起始区 (TIR)前形成一个发夹结构 ,但不影响 TIR的二级结构 ;B50 i2的插入序列在 TIR 5′端形成一个二级结构 ;而另一克隆 D1 3与 B50因 SD前后的 6个和 7个碱基序列的不同 ;使翻译起始区 TIR的 SD到 AUG附近的二级结构不相同 .实验测定的四者的β-半乳糖苷酶活性与计算机计算的解开 m RNA TIR的二级结构所需能量ΔE进行比较 ,其结果说明 m RNA TIR前面的二级结构对翻译起始无影响 ,而位于 TIR的 5′端的二级结构对翻译起始效率是有影响的 .不过 ,它与 m RNA TIR的 SD到 AUG的附近的二级结构对翻译起始效率的影响相比 ,TIR5′端二级结构的影响比较小 .同时 ,PCNA- Lac Z和 PCNA- Lac Z′两种融合蛋白的β-半乳糖苷酶活性也进行了比较 ,酶活性有差别 ,但不同质粒酶活性的比值仍相同 .     

原核表达中优化起始密码下游序列的软件设计与实现

在原核表达中影响外源基因表达效率的因素有很多,这其中翻译起始效率起了非常重要的作用。翻译起始效率又主要受SD序列、SD序列与起始密码子之间的间距、DB(DownstreamBox)序列、mRNA翻译起始区(TIR)的二级结构和稀有密码子等因素的影响。主要针对DB序列和5′端稀有密码子的优化设计了软件。通过计算机对序列进行分析比对后,按照匹配碱基数、匹配位置、密码子使用频率平均值的顺序进行排序,给出一些优化序列,并给出了软件算法。     

膜蛋白原核表达的基因序列优化北大核心CSCD

膜蛋白的结构与功能研究是当前的热点之一。目前获取膜蛋白的最主要途径是通过原核系统进行表达。但是膜蛋白在原核系统中表达水平相对较低,通过对基因序列进行优化促使膜蛋白正确高效表达是一项非常重要的技术手段。归纳了近些年来膜蛋白原核表达技术在基因序列优化研究上的最新进展,并从稀有密码子的优化、m RNA的稳定性与翻译起始、m RNA与核糖体行为、翻译的效率与膜蛋白的折叠4个方面对基因序列上影响膜蛋白表达的因素进行了总结,旨在为膜蛋白的原核表达提供一定的思路和参考。     

膜蛋白原核表达的基因序列优化

膜蛋白的结构与功能研究是当前的热点之一。目前获取膜蛋白的最主要途径是通过原核系统进行表达。但是膜蛋白在原核系统中表达水平相对较低,通过对基因序列进行优化促使膜蛋白正确高效表达是一项非常重要的技术手段。归纳了近些年来膜蛋白原核表达技术在基因序列优化研究上的最新进展,并从稀有密码子的优化、m RNA的稳定性与翻译起始、m RNA与核糖体行为、翻译的效率与膜蛋白的折叠4个方面对基因序列上影响膜蛋白表达的因素进行了总结,旨在为膜蛋白的原核表达提供一定的思路和参考。     

基因表达与mRNA结构的关系

基因的转录调控和转录后水平的调控在基因表达过程中起着重要作用。mRNA的结构与基因表达调控的关系非常密切。目前对于mRNA结构对表达的影响因素,主要集中于起始密码子和S-D序列的结构和间隔长度、基因和基因间的间隔区序列和长度,5’末端与3’末端非翻译区、多聚（A）尾、内含子序列对翻译起始效率、发夹结构对mRNA的稳定性的影响和mRNA翻译起始区等对基因表达影响。     

敏捷气热菌起始密码子侧翼序列与密码子偏好及基因长度相关性研究

好氧超嗜热古菌敏捷气热菌 (Aeropyrumpernix)mRNA中起始密码子AUG侧翼序列的保守性以及它与密码子使用偏好及基因长度之间具有相关性。AUG侧翼序列的保守性由M1(1)值表示 ,AUG侧翼序列对翻译起始的有效性由AUGCAI值表示。研究表明 :高表达和低表达基因的 - 2 0位到 13位中某些位点的保守性存在差异 ,其中高表达基因的 - 4位和 - 3位可能与其高表达的特性有关 ;在A .pernix中一个普遍的趋势是 :较短的基因有较高的表达效率 ,较长的基因的表达效率较低。与仅使用密码子偏好相比 ,将AUGCAI值引入到研究古菌在翻译水平上的自然选择更准确、更具有广泛适应性     

滑动序列对游仆虫中识别+1位和+2位编程性核糖体移码具有关键作用

编程性核糖体移码(programmed ribosomal frameshifting,PRF)广泛存在于生命进化谱系的各个分支,是一种翻译水平上的基因表达调控方式。单细胞真核生物游仆虫(Euplotes)中不仅PRF基因比例高,而且移码类型有+1和+2位两种。本研究从基因组水平对八肋游仆虫(E.octocarinatus)中的+2 PRF基因进行了鉴定,比较分析+1及+2 PRF基因中可能的调控元件。为了探讨游仆虫中滑动序列对移码类型的影响,克隆了八肋游仆虫的+1 PRF基因——η微管蛋白基因,将其构建到含绿色荧光蛋白报告基因的游仆虫大核人工染色体中,转染游仆虫细胞,通过检测GFP的表达来确定不同滑动序列突变体对应的移码类型。结果表明,滑动序列的改变能使游仆虫+1 PRF转变为+2 PRF,且这种移码类型的改变与滑动序列第1个密码子编码何种氨基酸无关。本研究揭示了滑动序列对游仆虫中识别+1和+2位的编程性核糖体移码具有关键作用。     

稀有密码子对大肠埃希菌表达外源蛋白的影响

外源基因中的稀有密码子是影响大肠埃希菌（大肠杆菌）表达的重要因素,稀有密码子尤其是串联稀有码子能降低甚至耗竭胞内同源ｔＲＮＡ,降低蛋白表达水平,并具有显著的位置效应,另外,稀有密码子可以引起外源ｍＲＮＡ翻译过程中的移码翻译,核糖体跳跃和氨基酸错配等异常事件,本文就稀有密码子影响大肠杆菌蛋白表达的机制研究作一系统综述。     

在动态过程中巧判遗传信息读取的方向

基因表达时遗传信息的读取有确定的方向,从而决定密码子读码及氨基酸排序。在转录和翻译的立体动态过程中,分析相关物质或结构的动态变化,包括RNA聚合酶移动、mRNA释放、起始密码方向、核糖体移动、tRNA进位、肽链合成、反密码子方向和反义RNA结合点等,可巧妙判定方向。     

小RNA病毒蛋白翻译调控元件研究进展

真核生物的起始复合物并不是在起始AUG处形成 ,而是在mRNA的 5′末端形成 ,其识别信号就是 5′末端的帽子结构。小RNA病毒科成员RNA 5′末端没有帽子结构 ,而有一个病毒编码的小蛋白质与基因组共价相连。小RNA病毒的蛋白翻译起始于 5′非翻译区中的内部顺式调控元件 ,称为内部核糖体进入位点 (IRES)。口蹄疫病毒 (foot and mouthdiseasevirus,FMDV)是该科病毒的典型代表 ,引起偶蹄动物的急性接触性传染病。完整FMDV含有单链正股RNA、衣壳蛋白及少量装配过程中夹带的非结构蛋白和宿主细胞肌动蛋白 ,其基因组RNA全长约 8 5kb ,可直接作为信使RNA。对IRES的一、二级结构进行了比较 ,对IRES与翻译起始因子的相互作用以及对病毒毒力的影响作了综述。